CC BY
67
© Н. Н. Константинова, В. М. Прокопенко, Г. Х. Толибова, А. В. Арутюнян, Н. Г. Павлова
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН, Санкт-Петербург
ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО ФОСФОКРЕАТИНА НА КРЕАТИНКИНАЗНУЮ/ФОСФОКРЕАТИНОВУЮ (КК/ФК) СИСТЕМУ МИОМЕТРИЯ САМКИ КРОЛИКА В КОНЦЕ БЕРЕМЕННОСТИ
УДК: 618.141-07-092.9
■ Исследовали влияние экзогенного фос-фокреатина (неотона) на креатинкиназ-ную/фосфокреатиновую (КК/ФК) систему миометрия самки кролика в конце беременности. Показано, что состояние КК/ ФКр системы миометрия тесно связано,
а следовательно, зависит от наличия или отсутствия его сократительной активности и характеризует функциональное состояние миометрия и его готовность к сокращению. Под влиянием неотона изменения в системе КК/ФКр миометрия у самок кролика носят дозозависимый характер. Увеличение дозы экзогенного фосфокреатина приводит к более сильному подавлению активности мКК-азы, увеличению свободного и суммарного креатина, однако достоверных изменений уровня ФКр не выявлено. Предполагается, что введение неотона самкам кролика на 30-й день беременности способствует рефосфорилированию внутриклеточной АДФ. Применение неотона в дозе 0,5 г способствует созданию условий, при которых наблюдается не только умеренная активация сокращений миоме-трия, но и их регуляция.
■ Ключевые слова: экзогенный фосфокреатин; сокращение миометрия; митохондриальная креатинкиназа.
Несмотря на успехи современного акушерства, одними из наиболее распространенных осложнений родов остаются нарушения сократительной активности матки. Феномен дисфункции миометрия может быть обусловлен энергетическим дефицитом на клеточном уровне, связанном с нарушением энергообразования в митохондриях миоцитов [1]. Для улучшения энергетического состояния миометрия и профилактики аномалий родовой деятельности используют карбоксилазу, глюкозу, пантотенат кальция [2], аскорбиновую кислоту, витамины группы В и АТФ [7], актовегин и инстенон [5], а также комплекс антиоксидантов (унитиол с аскорбиновой кислотой) [11]. Применение в акушерстве названных препаратов не приводит к эффективному улучшению энергетического потенциала миометрия, что стимулирует поиск новых путей регуляции нарушений сократительной активности матки. Одним из подходов является использование фосфорилированных гуанидиновых соединений, в частности фосфокреатина, участвующего в энергетическом снабжении клеток и тканей.
Лекарственный препарат неотон является синтезированным аналогом естественного метаболита клетки — фосфокреатина (ФК). Физиологическая роль ФК состоит в обеспечении внутриклеточного транспорта АТФ от мест синтеза молекулы к местам ее использования [16]. Влияние неотона на сократительную активность мышц широко изучено при повреждениях миокарда [12, 13]. Защитный эффект на сердечную мышцу и антиаритмическое действие ФК были впервые продемонстрированы в эксперименте на изолированном сердце собаки [15] и связаны, как показали многочисленные исследования, с комплексным воздействием на метаболизм кардиомиоцитов при ишемии миокарда [8].
Помимо кардиологии неотон нашел применение в области патологий нервной системы [3], в спортивной медицине [9].
Цель исследования
Изучение влияния неотона, окситоцина и их сочетаний на энергетический потенциал миометрия в ткани матки самок кролика.
Методика исследования
Опыты проведены на 57 самках кроликов породы «шиншилла» массой 3000-4000 г. Все животные были фертильными и содержались в регламентных условиях вивария на стандартном рационе. Спаривание самок с самцами проводили в одно и то же время дня двукратно в течение часа. Следующий день после спаривания считался первым днем беременности.
На 30-й день беременности животным внутривенно вводили препараты:
0,25
■то 0,2
^ 0,15
ш
! 0,1
к
и
0
1
ей
5 0,05
*
<
0
Рис. 1. Активность митохондриальной креатинкиназы в тканях матки после введения неотона, окситоцина и их
сочетаний
1 — контрольная группа
2 — окситоцин 1 ЕД
3 — неотон 0,5 г
4 — неотон 0,5 г+окситоцин 1 ЕД
5 — неотон 1,0 г+окситоцин 1 ЕД Примечание: * — р < 0,05, ** — р < 0,01, *** — р < 0,001 по
сравнению с контрольной группой.
1-я группа — 0,5 г неотона;
2-я группа — предварительная инъекция 0,5 г неотона и последовательно инъекция окситоцина в дозе 1 ЕД;
3-я группа — предварительная инъекция 1 г неотона и последовательно инъекция окситоцина в дозе 1 ЕД;
4-я группа — инъекция окситоцина в дозе 1 ЕД;
5-я группа (контрольная) — инъекция физиологического раствора.
Митохондриальную фракцию из отмытых от крови фрагментов поперечного разреза ткани матки получали, используя дифференциальное центрифугирование разрушенной на холоде ткани в среде выделения состава: 0,3 М раствор сахарозы, содержащий 10 мМ ЭДТА (рН 7,5). Осадок, содержащий митохондрии, ресуспендировали в Трис-НС1 буфере (рН 7,2). Разрушение митохондрий осуществляли путем 3-кратного замораживания и оттаивания [6]. Активность мКК определяли на биохимическом анализаторе «А^уоп» (США) с помощью диагностической системы СК-КАС FC (DiaSys) и выражали в международных единицах на мг белка. Белок определяли, используя тест-систему фирмы Копе1аЬ. Определение Кр осуществляли в безбелковом центрифугате до (свободный Кр) и после гидролиза в 0,1 н НС1 с последующей нейтрализацией раствора 5н К2СО3 (суммарный Кр). Концентрацию КФ рассчитывали как разницу между суммарным и свободным Кр и выражали в мкмолях/г сырой массы ткани [14].
1 2 3 4 5
*
0,25
"ГО
*
1 0,2
ш
^ 0,15
2 и
Ь 0,1
0
1
со
12 0,05 <
0
окситоцин неотон 0,5 г + окситоцин
Рис. 2. Активность митохондриальной креатинкиназы в тканях матки у родивших и неродивших самок
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием стандартных пакетов статистического анализа (StatgrapЫcs V. 6.0).
Результаты и обсуждение
Анализ результатов по влиянию неотона, окси-тоцина и их сочетаний на активность мКК мио-метрия самки кролика проводили у животных, у которых регистрировалась сократительная активность матки.
Как видно из рис. 1, у самок, которым вводили один неотон и неотон в сочетании с ок-ситоцином, активность мКК в миометрии была достоверно снижена по отношению к таковой в миометрии контрольных животных и животных, которым вводили окситоцин. Уменьшение активности фермента зависит от дозы введенного неотона. Уровень активности мКК при инъекции самке неотона в дозе 0,5 г не отличался от таковой при введении его в сочетании с окситоцином. Увеличение дозы неотона до
1,0 г в сочетании с окситоцином приводило к уменьшению значений активности фермента в 2,3 раза (р < 0,001).
Величина активности мКК в миометрии самок в зависимости от интенсивности сократительной активности матки, возникшей под влиянием неотона и окситоцина, представлена на рис. 2. Было выяснено, что под влиянием вводимых препаратов у одних животных возникали роды, у других они не развивались. В течение 30-минутного динамического наблюдения роды произошли у части животных только в 2 сериях опытов: с введением окситоцина и сочетанным его применением с 0,5 г неотона. У родивших животных активность мКК была больше в мио-метрии самок, получавших только окситоцин, по сравнению с таковой у самок при сочетанном его применении с 0,5 г неотона (в 1,5 раза). При от-
□ роды
□ отсутствие родов
Таблица 1
Содержание свободного креатина и суммарной фракции Кр+ФКр в тканях матки после введения неотона, окситоцина и их сочетаний
Биохимические показатели Группы опытов
контрольная группа окситоцин 1 ЕД неотон 0,5 г неотон 0,5 г+окситоцин 1 ЕД неотон 1,0 г+окситоцин 1 ЕД
Суммарный Кр 3,45 і 0,48 3,95 ± 0,13 4,33 і 0,20* 4,58 ± 0,28* 5,26 ± 0,47*
мкг/г веса ткани n = 5 п = 10 n = i2 п = 10 п = 5
Свободный Кр 3,02 і 0,43 3,54 ± 0,17 3,95 і 0,2i* 4,39 ± 0,45* 4,58 ± 0,51*
мкг/г веса ткани n = 5 п = 10 n = i2 п = 10 п = 5
Примечание: * — р < 0,05, ** — р < 0,01, *** — р < 0,001 по сравнению с контрольной группой.
Содержание ФКр (мкг/г веса ткани)
Рис. 3. Содержание фосфокреатина в тканях матки после введения неотона, окситоцина и их сочетаний
1 — контрольная группа
2 — окситоцин 1 ЕД
3 — неотон 0,5 г
4 — неотон 0,5 г+окситоцин 1 ЕД
5 — неотон 1,0 г+окситоцин 1 ЕД
сутствии родов активность мКК была в 1,2 раза меньше по сравнению с таковыми у животных получивших сочетание 0,5 г неотона с 1 ЕД окситоцина. В тех опытах, в которых самкам вводили только неотон в дозе 0,5 г родов у животных, не наблюдалось, уровень активности мКК был таким же, как в миометрии неродивших животных после введения им только окситоцина. Сократительная активность матки в том и в другом случае была одинаковой, судя по числу сокращений за период наблюдения (9,3 ± 1,6 и
11.5 ± 3,3 соответственно).
Уровень активности мКК в группе животных, которым вводили неотон (0,5 г) совместно с окситоцином, независимо от того произошли роды у крольчих или нет, был равен активности фермента в группе животных, получавших один неотон. Следует отметить, что интенсивность сократительной активности матки у родивших самок была больше и составляла при сочетанном введении препаратов
34.5 ± 4,5, у неродивших — 19,0 ± 4,3 (р < 0,01). Наименьшее значение активности мКК ткани матки отмечалось при увеличении дозы неотона (1 г), тогда как родов у самок в этой группе
не наблюдалось. Более того, после инъекции 1 г неотона и последующего введения оксито-цина развивался гипертонус матки, роды отсутствовали и наблюдалась максимальная летальность плодов.
Содержание свободного креатина (Кр) в тканях матки животных, которым вводили неотон или его сочетание с окситоцином (таблица), было достоверно больше по сравнению с его содержанием в миометрии самок контрольной группы и крольчих, которым вводили окситоцин, в 1,3 и 1,1 раза соответственно. Следует отметить, что содержание свободного Кр оставалось неизменным при увеличении дозы неотона до 1,0 г в комбинации с окситоцином по сравнению с группой самок, которым в сочетании с окситоцином вводили 0,5 г неотона.
У животных, которым вводили только неотон или неотон в сочетании с окситоцином, наблюдалось увеличение суммарного содержания креатина (Кр + ФКр) в миометрии по сравнению с его содержанием в тканях матки самок, которым проводили инъекцию одного окситоцина. Совместное введение 0,5 г неотона с окситоци-ном не изменяло содержание суммарной фракции Кр + ФКр в миометрии самок кролика по сравнению с животными, которым была проведена инъекция неотона той же дозы. Введение неотона в дозе 1,0 г одновременно с инъекцией окситоцина сопровождалось более значительным возрастанием Кр + ФКр по сравнению с таковым при дозе неотона 0,5 г (р < 0,001). Введение животным окситоцина в дозе 1 ЕД не влияло на содержание свободного Кр и суммарного Кр + ФКр.
Изменения содержания ФКр представлены на рис. 3. Введение неотона в дозе 0,5 г на фоне окситоцина приводило к снижению содержания ФКр в ткани матки (в 2 раза) по сравнению с контрольной группой и группами самок, которым проводили инъекции окситоцином или неотоном в дозе 0,5 г. Введение повышенной дозы неотона в сочетании с окситоцином приводило к росту
содержания эндогенного ФКр в миометрии самок по сравнению с группой крольчих, которым ввели неотон в дозе 0,5 г.
Таким образом, показатели КК/ФКр системы миометрия тесно связаны с наличием или отсутствием его сократительной активности и характеризуют функциональное состояние миометрия и его готовность к сокращению.
Под влиянием неотона изменения в системе КК/ФКр миометрия у самок кролика носят дозозависимый характер. Увеличение дозы экзогенного фосфокреатина приводит к более сильному подавлению активности мКК-азы, увеличению свободного и суммарного креатина, однако достоверных изменений уровня ФКр мы не наблюдали, хотя некоторая тенденция при совместном применении окситоцина и неотона отмечается. Наши данные позволяют предположить, что введение неотона самкам кролика на 30-й день беременности способствует рефос-форилированию внутриклеточной АДФ. К аналогичному выводу пришли авторы при исследовании действия ФКр при ишемии миокарда [4, 10]. Сравнительный анализ частоты схваток при введении неотона в дозе 0,5 г и при введении одного окситоцина дает нам основание полагать, что при данной дозе неотона создаются условия, при которых наблюдается не только умеренная активация сокращений миометрия, но и их регуляция.
Литература
1. Абрамченко В. В. Концепция энергетического дефицита и нарушенной функции митохондрий в патогенезе аномалий родовой деятельности // Проблемы репродукции. — 2001. — Т. 7, № 4. — С. 39-43.
2. Асатова М. М., Гафарова Д. Х. Аномалии родовой деятельности // Вестник Российск. ассоц. акуш.-гинек. — 1999. — № 2. — С. 85-90.
3. Гусев Е. И., Демина Т. Л., Скворцова В. И. Результаты клинического испытания препарата неотон у больных с заболеваниями нервной системы // Неотон: современное состояние исследований: сб. науч. трудов. — Л., 1990. — С. 35.
4. Исследование методом ЯМР защитного действия фос-фокреатина на ишемизированный миокард в условиях кардиоплегии / Куприянов В. В. [и др.] // Бюлл. Всесоюз. кардиологич. науч. центра АМН СССР. — 1985. — № 1. — С. 14-19.
5. Карагунян О. Р., Абрамян Л. Р., Абрамченко В. В. Опыт применения сочетания антигипоксантов, антиоксидантов в сочетании с простагландинами в профилактике слабости родовой деятельности у беременных групп высокого риска по развитию аномалий родовой деятельности // Проблемы беременности. — 2006. — № 12. — С. 52-53.
6. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен): учебное пособие / ред. Прохорова М. И. — Л., 1982. — С. 29-33.
7. Сидорова И. С. Физиология и патология родовой деятельности. — М., 2000. — 311 с.
8. Перепеч Н. Б. Неотон фосфокреатин механизмы действия и клиническое применение / ред. Алмазов В. А. — М., 2005. — 94 с.
9. Португалов С. Н., Алмазова С. Н., БайрамкуловХ. Д. Влияние неотона на физическую работоспособность крыс // Неотон: современное состояние исследований: сб. науч. трудов. — Л., 1990. — С. 37.
10. Преображенский А. Н, Джавадов С. А., Сакс В. А. Гипотетический механизм защитного эффекта фосфокреатина на миокард // Биохимия. — 1986. — Т. 51, Вып. 4. — С. 675-682.
11. Щербина Л. А., Абрамченко В. В., Костюшов Е. В. Профилактика и лечение слабости родовой деятельности антиоксидантами // Вестник Российск. ассоц. акуш.-гин. — 1997. — № 3. — С. 100-102.
12. Fleming C, Fedosova N. U., Klodos I. Phosphoforms of Na, K ATP — ase II. Interaction of substrate and Cation - Binding sites in Pi Posphorylation of Na, K ATP-ase // Biochemistry. — 1998. — Vol. 37. — P. 16686-16696.
13. Griffiths P. D. The activity of ATP: creatine phosphotransferase in umbilical cord blood // Clin. Chim. Acta. — 1964. — Vol. 9. — P. 210-213.
14. Role of creatine phosphokinase in cellular function and metabolism / Saks V. A. [et al] // Can. J. Physiol. Pharmacol. — 1978. — Vol. 56. — P. 691-706.
Статья представлена А. Г. Савицким, ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта,
Санкт-Петербург
EXOGENIC PHOSPHOCREATINE INFLUENCE ON RABBIT'S MYOMETRIUM CREATINEKINASE/ PHOSPHOKREATINE (CC/PC) SYSTEM AT THE END OF PREGNANCY
Konstantinova N. N., Prokopenko V. M., Tolibova G. H., Arutjunjan A. V., Pavlova N. G.
■ Summary: Exogenic phosphocreatine influence on the rabbit’s myometrium creatinekinase/phosphocreatine (CC/ PC) system at the end of pregnancy was investigated. It was shown that myometrium CC/PC system condition was closely connected and, consequently, depended on contractile activity presence or absence. This system characterized a myometrium functional condition and its readiness for contraction. Under neoton influence changes in rabbit’s myometrium CC/PC system had dose dependent character. The increase of exogenic phosphocreatine dose led to more strong suppression of mCC activity, increasing of free and total creatine. However significant differecies of PC level was not revealed. It was supposed that neoton introduction at the 30th day of rabbit’s pregnancy promoted endocellular
ADP rephosphorylation. 0,5 g dose neoton application contributed conditions at which not only moderate activation of myometrium contractions, but also their regulations were observed.
■ Key words: exogenic phosphocreatine; myometrium contractions; mitochondria creatinkinase.
■ Адреса авторов для переписки
Константинова Наталья Николаевна — профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии и патофизиологии плода с отделением УЗД.
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН. І99034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3.
Прокопенко Валентина Михайловна — к. б. н, старший научный сотрудник, лаб. перинатальной биохимии.
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН. І99034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: [email protected]
Толибова Гулрухсор Хайбуллоевна — научный сотрудник лаборатории патоморфологии.
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН. І99034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: [email protected]
Арутюнян Александр Вартанович — д. б. н., профессор, заведующий лаб. перинатальной биохимии.
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН. І99034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3.
Павлова Наталья Григорьевна — д. м. н., профессор, заведующий лаб. патофизиологии.
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта СЗО РАМН. І99034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: [email protected]
Konstantinova Natalia Nikolaevna — professor MD Senior Researcher of Fetal Physiology&Pathophysiology with Ultrasound Diagnostics Department.
D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology 199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3.
Prokopenko Valentina Mihailovna — PhD, senior researcher of Perinatal Biochemistry Lab.
D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology.
199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3.
E-mail: [email protected]
Tolibova Gulrukhsor Haybulloevna — researcher of laboratory of pathology.
D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology.
199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3.
E-mail: [email protected]
Arutjunian Alexsandr Vartanovich — PhD professor, the Chief of Perinatal Biochemistry Lab.
D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology.
199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3.
Pavlova Natalia Grigorievna — MD professor, the Chief of Fetal Physiology&Pathophysiology with Ultrasound Diagnostics Department. D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology.
199034 Russia, St. Petersburg, Mendeleyevskaya Line, 3.
E-mail: [email protected]
