CC BY
69
УДК 61 1-013.3:576.3
Влияние экспрессии гена pub
на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши в производные экто-, мезо- и энтодермы in vitro
Е.В. Новосадова, Е.С. Мануилова, Е.Л. Арсеньева, А.Н. Лебедев, Н.В. Хайдарова, В.З. Тарантул, И.А. Гривенников* Институт молекулярной генетики РАН, Москва, 123182, пл. акад. Курчатова, 2 *E-mail: igorag@img.ras.ru
РЕФЕРАТ На модели эмбриональных стволовых клеток мыши изучено влияние повышенной и пониженной экспрессии гена pub на начальные этапы их дифференцировки в производные энто-, экто- и мезодермы in vitro. Методом ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией, было показано, что экспрессия генов vimentin, somatostatin, GATA 4, GATA 6, являющихся маркерами энтодермального направления дифференцировки, не изменяется как в клетках с повышенной экспрессией гена pub, так и в клетках с его пониженной экспрессией, а также в соответствующих контрольных линиях. В клетках с повышенной экспрессией гена pub наблюдалось увеличение экспрессии генов-маркеров мезодермального направления дифференцировки (trI card, trI skel, c-kit и IL-7), а в клетках с пониженной экспрессией гена pub — снижение их экспрессии. При анализе экспрессии генов-маркеров эктодермальной дифференцировки (nestin, fi-III tubulin, gfap, th) наблюдалась противоположная картина. В линиях клеток с повышенной экспрессией гена pub показано снижение экспрессии этих генов, тогда как при подавлении экспрессии гена pub происходило увеличение их экспрессии. Таким образом, предполагается, что изменения в экспрессии гена pub в эмбриональных стволовых клетках могут оказывать существенное влияние на дифференцировку этих клеток в мезо- и эктодермальном направлениях.
Ключевые слова: эмбриональные стволовые клетки, дифференцировка, полимеразная цепная реакция, ген pub, мезодерма, энтодерма, эктодерма.
Список сокращений: Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, фетальная сыворотка коровы (ФСК).
ВВЕДЕНИЕ щимся из них типам клеток. Анализ экспрессии генов в про-
Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки представляют собой цессе дифференцировки ЭС клеток в специализированные уникальную модель для изучения процессов, происходящих клеточные типы показал, что последовательность и эффек-на ранних этапах эмбриогенеза [1]. Известно, что и в ходе тивность экспрессии генов в ходе дифференцировки in vitro развития зародыша in vivo ЭС клетки в культуре способны в целом соответствует последовательности данных процес-давать начало всем трем зародышевым слоям: энтодерме, сов in vivo [10]. Это указывает на возможность использова-мезодерме и эктодерме и, соответственно, всем развиваю- ния ЭС клеток в качестве адекватной экспериментальной
модели для изучения молекулярных механизмов начальных этапов дифференцировки. Кроме того, исследования дифференцировки ЭС клеток в том или ином направлении в ответ на воздействие специфических индукторов (факторов роста, цитокинов) или на непосредственную генетическую модификацию этих клеток позволяют приблизиться к пониманию функции исследуемых соединений и различных генов в данном процессе [1].
Ранее нами с помощью метода вычитающей гибридизации были получены и охарактеризованы клоны кДНК, повышенно транскрибирующиеся в ВИЧ-ассоциированных иммунобластных лимфомах [16, 17]. Анализ этих кДНК позволил выявить среди них, наряду с ранее охарактеризованными генами (set, calpain и др.), несколько кДНК, кодирующих гены с неизвестными в то время функциями. Один из таких лимфомоспецифичных генов в дальнейшем был назван pub. Белковый продукт гена pub человека (hPub) имеет высокую степень гомологии (82 %) с мышиным белком Pub (mPub) [5].
Pub относится к семейству TRIM (tripartite motif) белков [5], для которых характерно наличие т.н. TRIM (или RBBC) мотива, состоящего из трех цинк-связывающих доменов: RING (R), B-box 1 (B1) и B-box 2 (B2), сопровождаемых coiled-coil (СС) районом [15]. На данный момент известно 37 представителей данного семейства белков. Некоторые из них вовлечены в такие биологические процессы, как регуляция транскрипции, организация цитоскелета, контроль клеточной пролиферации и дифференцировки [18]. Функции гена hpub в организме практически не изучены. Для мышиного гомолога mpub показано, что он играет важную роль в процессах клеточной дифференцировки и оказывает существенное влияние на транскрипционную активность фактора PU.1 [5]. PU.1 относится к ETS семейству транскрипционных факторов, играет центральную роль в дифференцировке и пролиферации макрофагов и В-клеток в ходе гемопоэза, а также контролирует функциональную активность ней-трофилов [11]. Показано, что продукт гена mpub ингибирует транскрипционную активность Pu.1 в гемоцитах и вследствие этого играет важную роль в пролиферации и диффе-ренцировке миелоидных и лимфоидных клеток [5].
Для исследования влияния гена pub на начальные стадии развития была использована модель ЭС клеток мыши. Ранее нами были получены стабильно трансфицированные клеточные культуры с повышенной экспрессией гена hpub (линия ES-hPub), находящегося под контролем промотора цитомегаловируса и с пониженной экспрессией гена mpub (линия ES-RNAi) в результате действия интерферирующей РНК, а также соответствующие им контрольные линии (ES-DNA3 и ES-pJneo) [2]. Было показано, что повышенная экспрессия hpub приводила к увеличению, а пониженная экспрессия эндогенного mpub -к уменьшению образования ЭС клетками эмбриоидных тел, однако не оказывала влияния на пролиферативную активность этих клеток [2, 3].
В данной работе методом полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), проведена оценка влияния повышенной и пониженной экспрессии генов mpub и hpub на экспрессию генов-маркеров энто-, мезо- и эктодермальной дифференцировки в культурах трансфицированных ЭС клеток мыши.
экспериментальная часть культивирование эс клеток
В работе использовали ЭС клетки мыши линии R1, любезно предоставленные A. Nagy (Mount Sinai Hospital, Toronto, Canada). Культивирование ЭС клеток проводили при 37 0С и 5 % СО2 в среде альфа-МЕМ (Sigma, США), содержащей 15 % фетальной сыворотки коровы (ФСК) (Gibco, США), 0.1 мМ 2-меркап-тоэтанол, 2 мМ L-глутамин, заменимые аминокислоты (Gibco, США), нуклеозиды, витамины и антибиотик гентамицин (20 мкг/мл). В качестве питающего (фидерного) слоя для ЭС клеток использовали первичные фибробласты, полученные от мышей 11-12-го дней эмбрионального развития, пролиферация которых была блокирована митомицином С (5 мкг/мл). Ростовой средой для первичной культуры фибробластов служила среда ДМЕМ (Sigma, США), содержащая 10 % ФСК, 2 мМ L-глутамин и антибиотик гентамицин (20 мкг/мл). При культивировании ЭС клеток без фидерного слоя в среду добавляли LIF (фактор, ингибирующий лейкемию) (Sigma, США) в конечной концентрации 10 нг/ мл, который блокировал спонтанную дифференцировку этих клеток. Пересев клеток со сменой среды осуществляли каждые 3 дня.
индукция дифференцировки эс клеток с образованием эмбриоидных тел
Для индукции дифференцировки с образованием эмбриоид-ных тел ЭС клетки изолировали от фибробластов фидерного слоя. Клетки обрабатывали трипсином, центрифугировали, а затем полученную суспензию инкубировали в чашке Петри (d = 60 мм) (Nunc, Дания) в течение 10-20 мин в СО2-инкубаторе. В течение этого времени основная масса фи-бробластов прикрепляется ко дну чашки, в то время как ЭС клетки остаются в суспензии. Для формирования эмбриоид-ных тел суспензию ЭС клеток переносили на чашку Петри (d = 35 мм) (Nunc, Дания) в количестве 200 000 клеток в 2 мл среды, либо на 96-луночную иммунологическую плашку (по 1000 клеток на лунку, в 100 мкл среды), затем помещали в СО2-инкубатор. На третьи сутки культивирования образовавшиеся эмбриоидные тела переносили на чашки, покрытые желатиной, для дальнейшей дифференцировки.
выделение тотальной РНК и проведение обратной транскрипции
Тотальную РНК из дифференцированных ЭС клеток, а также из других клеточных линий и тканей выделяли методом фенол-хлороформной экстракции с использованием набора YellowSolve (Clonogen, Россия), следуя рекомендациям производителя. Процедуру обратной транскрипции проводили с использованием набора фирмы «Силекс» (Россия), согласно протоколу и рекомендациям производителя. Синтез кДНК проводили на 0.5 мкг тотальной РНК в течение 1 ч при 37 0С в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0.05 мкг случайных гексапраймеров и 100 ед. обратной транскриптазы MMLV (molo^y murine leukemia virus). После остановки реакции (инкубация 10 мин при 70 0С) образцы кДНК хранили при - 20 0С.
полимеразная цепная реакция
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в 25 мкл реакционной смеси, состоящей из Taq-буфера, 1.5 мМ смеси
dNTP, 1.25 ед. «colored» Taq полимеразы («Синтол», Россия), 0.5 мкл образца кДНК и 10 пмоль каждого праймера. Праймеры, подобранные для соответствующих генов, а также условия ПЦР и длины продуктов, представлены в табл. Продукты ПЦР разделяли в 1.5-ном % агарозном геле с визуализацией с помощью бромистого этидия и далее анализировали с помощью системы BioDocAnalyze (Biometra, ФРГ).
результаты и обсуждение
Известно, что дифференцировка в эктодермальном направлении дает начало нервной системе и эпителию, энто-дермальном - печени, поджелудочной железе, щитовидной железе и легким, и мезодермальном - крови, скелетной и сердечной мускулатуре (http://stem-cells.ru).
На модели ЭС клеток мыши мы исследовали влияние изменений в экспрессии генов mpub и hpub на дифферен-цировку этих клеток в эктодермальном, энтодермальном и мезодермальном направлениях.
Для этой цели были выбраны специфические гены-маркеры, характеризующие разные типы клеток, происходящих из того или иного зародышевого листка, которые представлены на рис. 1.
Трансфицированные ЭС клетки четырех линий (ES-hPub, ES-DNA3, ES-Ineo, ES-RNAi) подвергались «спонтанной» дифференцировке, т.е. без добавления специфических индукторов определенных типов клеточной дифференцировки. Наличие экспрессии и изменения в ее уровне определяли с помощью метода ОТ-ПЦР. В случае
ЭС клетки
энтодерма T мезодерма эктодерма
somatostatin trl sk nestin
vimentin trl card gfap
GATA4 c-kit th
GATA6 IL-7 в-III tubulin
Рис. 1. Гены-маркеры определенных направлений дифференцировки ЭС клеток, использованные в экспериментах
энтодермальной и мезодермальной дифференцировки клетки анализировали на 10-й день, а в случае эктодермальной - на 21-й день культивирования [6].
влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена mpub НА ЭНтодЕРМАльнуЮ дИФФЕРЕНцИРОВКу трансфицированных эс клеток
GATA 4, GATA 6 относятся к семейству транскрипционных факторов. Они играют определенную роль в регуляции генов, вовлеченных в эмбриогенез, а также в развитие кардиоваскулярной системы и висцеральной энтодермы. На примере таких организмов, как zebrafish и Xenopus
Таблица Праймеры, использованные в полимеразной цепной реакции
№ Название гена Структура праймеров Т отжига (0С) Кол-во циклов Размер продукта (п.н.)
1 GAPDH 5'-TCCATGACAACTTTGGCATTGTGG-3'-s 5'-GTTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGAC-3'-as 66 27 376
2 pub 5'-CCCATTTGGAAGACGCCG -3' - s 5'-AGGGTGGCTCAGCTCCG -3'-as 70 43 328
3 hpub 5’-GCAGCAGCACATTGACAACA-3’-s 5’-TCCACGAGGCCCTTAAAGAA-3’-as 60 30 382
7 GATA 4 5'-GGTTCCCAGGCCTCTTGCAATGCGG-3'-s 5'-AGTGGCATTGCTGGAGTTACCGCTG-3'-as 65 40 153
8 GATA 6 5'-CCGCGAGTGCGTGAACT-3'-s 5'-CGCTTCTGTGGCTTGATGAG-3'-as 65 40 137
9 trI card 5'-CCACACGCCAAGAAAAAGTC-3'-s 5'-AAGCTGTCGGCATAAGTCCT-3'-as 62 32 204
10 trI skel 5'-CACACTCTGCAGTCTGTGGTGAG-3'-s 5'-CTGAAGGGCACTGAGAGACAGAC-3'-as 64 35 314
12 nestin 5'-CGCTGGAACAGAGATTGGAAGG-3'-s 5'-GTCTCAAGGGTATTAGGCAAG-3'-as 58 30 375
13 gfaP 5'-TCCTGGAACAGCAAAACAAG-3'-s 5'-CAGCCTCAGGTTGGTTTCAT-3'-as 61 42 224
14 p-III tubulin 5'-GAGGAGGAGGGGGAGATGTA-3'-s 5'-CCCCCGAATATAAACACAACC-3'-as 65 35 348
15 th 5'-TGCACACAGTACATCCGTCA-3'-s 5'-TCTGACACGAAGTACACCGG-3'-as 60 35 376
16 vimentin 5'-ACCTGTGAAGTGGATGCCCT-3'-s 5'-AAATCCTGCTCTCCTCGCCTT-3'-as 55 30 318
17 somatostatin 5'-CAGACTCCGTCAGTTTCTGC-3'-s 5'-ACAGGATGTGAAAGTCTTCCA-3'-as 56 30 262
18 c-kit 5'-TGTCTCTCCAGTTTCCCTGC-3'-s 5'-TTCAGGGACTCATGGGCTCA-3'-as 58 45 765
19 IL-7 5'-ACATCATCTGAGTGCCACA-3'-s 5'-CTCTCAGTAGTCTCTTTAG-3'-as 57 45 355
Рис. 2. Экспрессия генов,вовлеченных в энтодермальную дифференцировку стабильно трансфицированных ЭС клеток (10 дней дифференцировки in vitro). Данные ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией.
Гены: а) somatostatin, б) vimentin, в) GATA 4, г) GATA 6, д)ген сравнения -GAPDH.
Линии клеток: 1. ES-hPub, 2. ES-DNA3,
3. ES-RNAi, 4. ES -pIneo. 5. отрицательный контроль (вода)
было показано, что гены GATA 4, 6 играют важную роль на ранних стадиях развития сердца [7, 8, 12-14]. Более того, нокаут генов GATA 4, 6 у мышей приводил к эмбриональной гибели на стадии гаструляции, обусловленной нарушением формирования дефинитивной энтодермы [19].
В результате проведенных экспериментов не было отмечено различий в экспрессии генов vimentin, somatostatin, GATA 4, GATA 6 как в дифференцированных клетках с повышенной экспрессией гена hpub, так и в клетках с пониженной экспрессией гена mpub, а также в соответствующих контрольных линиях (рис. 2). Таким образом, можно предположить, что изменения в экспрессии гена pub не влияют на диффе-ренцировку ЭС клеток в энтодермальном направлении.
влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена mpub на мезодермальную дифференцировку трансфицированных эс клеток
На следующем этапе мы проверили влияние экспрессии генов hpub и mpub на дифференцировку клеток в мезодермальном направлении. Учитывая гомологию мышиного гена mpub и человеческого гена hpub, можно предположить, что продукт гена hpub также будет ингибировать транскрипционную активность PU.1 и тем самым влиять на дифференцировку клеток гемопоэтического ряда. Чтобы проверить эту гипотезу, мы исследовали влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена mpub на дифференцировку ЭС клеток по лимфоидному пути. Для этого нами были выбраны специфические гены-маркеры для лимфоидных клеток, такие как c-kit и IL-7 [7]. ПЦР анализ трансгенных клеточных линий на 10-день культивирования показал, что повышенная экспрессия гена hpub приводит к увеличению экспрессии обоих генов-маркеров, а ингибирование эндогенного гена mpub, напротив, к снижению их экспрессии по сравнению с соответствующими контролями (рис. 3).
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что повышенная экспрессия гена hpub может способствовать дифференцировке ЭС клеток по лимфоидному пути.
Для определения влияния разнонаправленной экспрессии гена pub на дифференцировку ЭС клеток в другие производные мезодермы были выбраны два гена trI sk (скелетный тропонин I), trI card (сердечный тропонин I). В сердце зародыша человека экспрессируются как сердечная изоформа белка, так и изоформа из медленных скелетных волокон. После рождения экспрессия скелетно-мышечной изоформы тропонина I блокируется, а синтез сердечной изоформы, наоборот, стимулируется [5].
Как видно из рис. 4, действительно, экспрессия генов trI card и trI sk осуществляется на разном уровне. В трансфицированных клетках с суперэкспрессией гена hpub экспрессия этих генов также повышена, по сравнению с контрольной линией, а клетки с подавлением экспрессии гена mpub, наоборот, демонстрируют более низкий уровень экспрессии генов тропонина I по сравнению с контрольной линией.
Полученные результаты свидетельствуют о возможном влиянии генов mpub и hpub на дифференцировку ЭС клеток в различные производные мезодермы, причем суперэк-
Рис. 3. Экспрессия генов c-kit и IL-7 в стабильно трансфицированных ЭС клетках (10 дней дифференцировки in vitro). Данные ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией. Гены; а) c-kit, б) IL-7, в) ген сравнения — GAPDH. Линии клеток: 1. ES-hPub, 2. ES-DNA3, 3. ES-RNAi, 4. ES — pIneo, 5. тимус мыши (положительный контроль). 6. отрицательный контроль (вода)
Рис. 4. Экспрессия генов тропонина I сердечной (trI card) и скелетной (trI sk) форм соответственно в стабильно трансфицированных ЭС клетках (10 дней дифференцировки in vitro). Данные ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией. а) ген trI card. Линии клеток: 1. ES-hPub, 2. ES-DNA3, 3. ES-pIneo, 4. ES-RNAi, 5. отрицательный контроль (вода), 6. положительный контроль (сердце взрослой мыши) б) ген trI sk. Линии клеток: 1. ES-hPub, 2. ES-DNA3, 3. ES-pIneo, 4. ES-RNAi, 5. отрицательный контроль (вода), 6. положительный контроль (сердце эмбрионов мыши)
спрессия гена hpub приводит к повышению уровня мРНК для ряда генов-маркеров этого типа дифференцировки.
влияние повышенной экспрессии гена hpub и пониженной экспрессии гена mpub на эктодермальную дифференцировку трансфицированных эс клеток
Для изучения влияния генов hpub и mpub на дифференцировку ЭС клеток в эктодермальном направлении были использованы следующие гены-маркеры: nestin, ß-III tubulin, gfap и th. Ген nestin экспрессируется в нейральных стволовых клетках, молодых нейронах, некоторых глиальных клетках и эпендимальных клетках. Его экспрессия наблюдается на ранних стадиях формирования центральной и периферической нервной системы. Гены ß-III tubulin и gfap кодируют белки цитоскелета нейронов и глиальных клеток соответственно. Ген тирозингидроксилазы th экспрессируется в дофаминергических нейронах [19]. Данные относительно экспрессии этих генов в опытных и контрольных линиях ЭС клеток представлены на рис. 5.
выводы
Как видно из результатов ПЦР анализа, в клетках с повышенной экспрессией гена hpub наблюдается снижение экспрессии генов, вовлеченных в нейральную дифферен-цировку, а в клетках с пониженной экспрессией mpub, на-
Рис. 5. Экспрессия генов, вовлеченных в эктодермальную дифференцировку стабильно трансфицированных ЭС клеток (21-й день дифференцировки in vitro). Гены: а) ß-III tubulin, б) gfap, в) nestin, г) th. Линии клеток: 1. ES-hPub, 2. ES-DNA3, 3. ES-pIneo, 4. ES-RNAi,
5. положительный контроль (гипокамп мыши), 6. отрицательный контроль (вода)
против, увеличение экспрессии этих генов по сравнению с контролями. Такая картина характерна для трех (nestin, ß-III tubulin, gfap) из четырех проанализированных генов. Экспрессия гена th остается на одинаковом уровне для всех четырех линий клеток. Данный результат можно объяснить тем, что изменения в экспрессии гена pub не оказывают влияние на образование дофаминергических нейронов, для которых характерно наличие экспрессии гена th. Таким образом, в результате проведенных экспериментов показано, что суперэкспрессия гена hpub или подавление экспрессии гена mpub в ЭС клетках мыши приводит к существенному изменению в экспрессии ряда генов-маркеров производных отдельных зародышевых листков и, следовательно, может оказывать определенное, причем разнонаправленное, влияние на дифференцировку клеток в мезо- и эктодермальном направлениях.
Настоящая работа частично поддержана грантом Министерства образования и науки РФ (ГК № 02.512.12.2013) и грантом РФФИ (09-04-01117).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гривенников И.А. // Успехи биол. химии. 2008. Т. 48. С. 181-220.
2. Новосадова Е.В., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л., и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005. № 3. С. 174-179.
3. Новосадова Е.В., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л., и др. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. 2005. Т. 1. № 2. С. 14-21.
4. Новосадова Е.В., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л., и др.. // Медицинская генетика. 2008. № 8. С. 43-46.
5. Dhoot G., Perry S. // Exp. Cell. Res. 1978. V. 117. P. 357-370.
6. Fraichard A., Chassande O., Bilbaut G., et al.// J. Cell Sci. 1995. V. 108. P. 3181-3188.
7. Holtzinger A., Evans T. // Development. 2005. V. 132. P. 4005-4014.
8. Holtzinger A., Evans T. // Dev. Biol. 2007. V. 312. P. 613-622.
9. Jiang Y., Henderson D., Blackstad M., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003. V. 18. P 11854-11860.
10. Keller G. // Genes & Dev. 2005. V. 19. P. 1129-1155.
11. Lloberas J., Solier C., Celada A. // Immunol. Today. 1999. V. 20. P. 184-189.
12. Peterkin T., Gibson A., Patient R. // EMBO J. 2003. V. 22. P. 4260-4273.
13. Peterkin T., Gibson A., Patient R. // Dev. Biol. 2007. V. 311. P. 623-635.
14. Reiter J., Alexander J., Rodaway A., et al. // Genes Dev. 1999. V. 3. P. 2983-2995.
15. Reymond A., Meroni G., Fantozzi A., et al. // EMBO J. 2001. V. 20. P. 2140-2151.
16. Tarantul V.Z., Nikolaev A.I., Martynenko A., et al. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2000. V. 16. P 173-179.
17. Tarantul V., Nikolaev A., Hannig H., et al. // Neoplasia. 2001. V. 3. P. 132-142.
18. Torok M., Etkin L. // Differentiation. 2000. V. 67. P 63-71.
19. Zhao R., Watt A.J., Battle M.A., Li J., Bondow B.J., Duncan S.A. // Dev. Biology. 2008. V. 317. P. 614-619.
