CC BY
102
УДК 611-013.3:576.3
Получение и характеристика линии эмбриональных стволовых клеток мыши, трансфицированных геном нейротрофического фактора глии, слитым с геном зеленого флуоресцентного белка
Е. Л. Арсеньева1, И. В. Кузьмин1, Е. С. Мануилова1, Е. В. Новосадова1, Е. В. Муркин2,
Г. В. Павлова2, В. З. Тарантул1, И. А. Гривенников1#
1 Институт молекулярной генетики РАН, Москва
2 Институт биологии гена РАН, Москва # e-mail: [email protected]
РЕФЕРАТ Изучено влияние экспрессии гена нейротрофического фактора глии (gdnf) человека на морфологию и пролиферативную активность эмбриональных стволовых (ЭС) клеток мыши линии R1, а также на их способность формировать эмбриоидные тела (ЭТ). Предварительно методом ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией, было показано, что в этой линии ЭС клеток осуществляется экспрессия генов рецепторов для нейротрофического фактора глии RET и GFRal. Получена линия ЭС клеток мыши, трансфицированных геном gdnf человека, слитым с геном «зеленого» флуоресцентного белка (gfp). Наличие экспрессии гена gdnf человека в этих клетках показано с помощью Нозерн-гибридизации, а синтез его белкового продукта — иммуноцитохимическим окрашиванием с использованием специфических антител. Показано достоверное торможение образования эмбриоидных тел ЭС клетками, трансфицированными геном gdnf. При этом не обнаружено заметного влияния экспрессии гена gdnf на морфологию и пролиферативную активность трансфицированных ЭС клеток по сравнению с контрольными.
Ключевые слова: эмбриональные стволовые клетки, нейротрофический фактор глии, трансфекция, пролиферация, иммуноцитохимия, эмбриоидные тела.
ВВЕДЕНИЕ того, GDNF выполняет ряд важных функций вне нервной
Нейротрофический фактор глии (GDNF, glial derived neu- системы: он регулирует дифференцировку сперматогониев rotrophic factor) относится к семейству GDNF-подобных и необходим для эмбрионального развития почек [14]. лигандов (GFL), которое также включает в себя ньюртурин Все представители семейства GFL осуществляют свое (NRTN), персифин (PSPN) и артемин (ARTN). Все они не- действие на клетки путем связывания с гетерорецептор-обходимы для выживания дофаминергических нейронов ным комплексом, содержащим рецептор RET и корецеп-среднего мозга, а также, за исключением PSPN, перифери- тор GFRa [14]. Специфичность активации рецептора RET ческих сенсорных и симпатических нейронов [12, 14]. Кроме в отношении различных факторов семейства GFL зависит
от типа GFRa, имеющегося в клетках. GDNF, NRTN, ARTN и PSPN обладают высокой аффинностью к корецепторам GFRal, GFRa2, GFRa3 и GFRa4 соответственно. Связывание GFL с «чужим» GFRa возможно, но с меньшей эффективностью. Было показано, что GDNF специфически повышает выживаемость дофаминергических нейронов эмбрионального среднего мозга крыс, усиливает метаболизм дофамина, а также повышает уровень дифференци-ровки тирозингидроксилаза-положительных клеток (TH+), усиливая рост аксонов, увеличивая размеры тела клетки. Аналогичные эффекты наблюдались и в культуре дофа-минергических нейронов среднего мозга крыс [12]. Сходные результаты были получены и на трансгенных линиях дрозофилы. Оказалось, что в линиях дрозофилы, несущих ген gdnf, в дифференцирующихся нервных клетках обнаружен выраженный синтез тирозингидроксилазы, а клетки дрозофилы, несущие ген ngf, активно продуцировали ацетилхолинэстеразу [2, 3]
Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки обладают способностью к самообновлению и дифференцировке в производные всех трех первичных зародышевых листков, как в условиях in vitro, так и in vivo. Важным является тот факт, что в ходе дифференцировки ЭС клеток последовательность экспрессии тканеспецифических генов соответствует последовательности этих процессов при развитии организма in vivo [7].
Способность ЭС клеток дифференцироваться в определенных направлениях в условиях in vitro дает возможность изучать на этой модели клеточные и молекулярные механизмы раннего развития, а также получать разные типы донорских клеток для трансплантации. Преимущественная дифференцировка ЭС клеток в определенном направлении достигается только в специфических условиях культивирования [9], после воздействия экзогенных факторов роста и дифференцировки [7], путем их генетических модификаций [1, 10, 11, 13]. Первые работы по исследованию направленной дифференцировки ЭС клеток были проведены в основном на ЭС клетках мыши, диф-ференцировку которых с помощью вышеуказанных подходов удалось направить в гемопоэтические клетки [16], кардиомиоциты [11], инсулин-секретирующие клетки [15], нейроны и клетки глии [4, 6]. Использование метода сочетания генетических манипуляций с культивированием ЭС клеток мыши на фидерном слое стромальных клеток показало значительное увеличение количества дофами-нергических нейронов (примерно в 2 раза) в опытном варианте по сравнению с контролем. Результаты опытов по трансплантации таких клеток показали эффективную интеграцию TH+ клеток в стриатум мыши [10]. Индукция дофаминергической дифференцировки была показана на ЭС клетках человека при условии их культивирования на стромальных клетках P06 [18]. Важным является вопрос сохранения жизнеспособности дофаминергических нейронов при их трансплантации. В работе Buytaert-Hoefen с соавторами [5] было продемонстрировано, что для повышения жизнеспособности дофаминергических нейронов необходимо присутствие такого фактора, как GDNF, или астроцитов из стриатума. Японские исследователи [17], используя методику кокультивирования ЭС клеток приматов на клетках Сертоли, которые секретируют GDNF,
не только обнаружили увеличение количества индуцированных дофаминергических нейронов по сравнению с контролем, но и успешно осуществили трансплантацию этих клеток в стриатум мышей с патологией, сходной с болезнью Паркинсона у человека. ЭС клетки, полученные в результате определенных экспериментальных манипуляций, включая генетические, обладающие определенным типом направленной дифференцировки, могут быть, в перспективе, использованы в клеточной терапии ряда тяжелых заболеваний человека.
В связи с этим представляет существенный интерес изучение ЭС клеток с повышенной экспрессией гена gdnf. Для этого в настоящей работе были получены поликлональные культуры ЭС клеток мыши, трансфицированных геном gdnf человека, слитым с геном, кодирующим «зеленый» флуоресцентный белок (GFP), и проведена их характеристика.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИя
культивирование эС КЛЕТОК мыши . Культивирование ЭС клеток проводили при 37 0С и 5 % СО2 в среде альфа-МЕМ (Sigma, США), содержащей 15 % фетальной сыворотки коровы (ФСК) (Gibco, США), 0.1 mM 2-меркаптоэтанол, 2 mM L-глутамин, заменимые аминокислоты (Gibco, США), ну-клеозиды, витамины и антибиотик гентамицин (20 мкг/мл). В качестве питающего (фидерного) слоя для ЭС клеток использовали первичные фибробласты, полученные от мышей 11-12 дней эмбрионального развития, пролиферация которых была блокирована митомицином С (3 мкг/мл). Ростовой средой для первичной культуры фибробластов служила среда ДМЕМ (Sigma, США), содержащая 10 % ФСК, 2 mM L-глутамин и антибиотик гентамицин (20 мкг/мл). При культивировании ЭС клеток без фидерного слоя в среду добавляли LIF (фактор, ингибирующий лейкемию) (Sigma, США) в конечной концентрации 10 нг/мл, который блокировал спонтанную дифференцировку этих клеток. Пересев клеток со сменой среды осуществляли каждые 3 дня.
Оценка уровня экспрессии генов рецепторов RET и GFRa1 с помощью полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
Тотальную РНК из недифференцированных ЭС клеток, которые культивировали без фидерного слоя в присутствии LIF, выделяли методом фенол-хлороформной экстракции с использованием набора “YellowSolve” (Clonogen, США), следуя рекомендациям производителя. Процедуру обратной транскрипции проводили с использованием набора фирмы «Силекс» (Россия), согласно протоколу и рекомендациям производителя. Синтез кДНК проводили на 2 мкг тотальной РНК в течение 1 ч при 37 0С в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 0.05 мкг случайных гексапраймеров и 100 ед. обратной транскриптазы MMLV (molo^y murine leukemia virus). После остановки реакции (инкубация 10 мин при 70 0С) образцы кДНК хранили при - 20 0С.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в 25 мкл реакционной смеси, состоящей из Taq-буфера, 1.5 мМ смеси dNTP, 1.25 ед. «colored» Taq полимеразы («Синтол», Россия), 0.5 мкг образца кДНК и 10 пмоль каждого праймера.
Рис. 1. Схемы строения плазмид pEGFP-N1 и LP14g для трансфекции ЕС клеток. Kan/ Neo — ген, обеспечивающий устойчивость к антибиотикам,
EGFP — ген «зеленого белка», MCS — последовательность, содержащая сайты рестрикции, hGDNF — вставка гена gdnf человека
Ниже приведены последовательности праймеров, использованных в экспериментах [8].
Для гена RET: 5'-CCTCCGTGACAGCCGCAAGA-3' (прямой), 5'-GGGAATCCGGCCCTTGCTTT-3' (обратный); размер продукта 297 п.н.
Для гена GFRal : 5'-TCATTGGCAGAAACATCGTAG-3' (прямой), 5'-GCTCAGCTTGCTTTACAGTCC-3' (обратный); размер продукта 285 п.н.
Условия ПЦР были одинаковы для обоих фрагментов: старт: при 52 0C - 5 мин, при 95 0C - 5 мин, далее 35 циклов, включающих при 95 0C 30 сек.; при 68 0C - 30 сек, при 72 0C - 30 сек, при 72 0C - 10 мин. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1.5 % агарозном геле с визуализацией с помощью бромистого этидия.
ГИБРИДИЗАЦИЯ ПО НОЗЕРНУ . мРНК выделяли из ЭС клеток, используя TRI REAGENT (Sigma, США) по протоколу фирмы-производителя, и разделяли электрофорезом в 1.5 % агарозном геле. Затем мРНК переносили на нейлоновую мембрану. Мечение зонда на ген gdnf осуществляли альфа-32Р АТР с помощью набора «Random Prime Labelling» (Promega, США) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Предгибридизацию проводили в гибридизационном буфере (Х5 SSPE, 0.1 % SDS, Х5 р-р Денхардта) в течение 1 ч при 65 °С. Меченый зонд денатурировали 5 мин при 100 °С и добавляли к гибридизацион-ному буферу.
Гибридизацию проводили 16-20 ч при 65 °С на водяной бане. Затем фильтр промывали 3 раза по 15 мин в растворе Х0.1 SSC, 0.1 % SDS, заворачивали в водонепроницаемую пластиковую пленку и закладывали в кассету с фотопленкой. Экспонировали при - 70 °С от 1 до 5 дней.
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ПЛАЗМИДЫ. Для трансфекции клеток использовались следующие генно-инженерные конструкции. Контрольная плазмида pEGFP-N1 (рис. 1а) содержала ген gfp под промотором цитомегаловируса (CMV) и ген устойчивости к антибиотику неомицину neo. Размер плазмиды 4.7 т.п.н. Плазмида LP14g (рис. 1б), несущая ген gdnf человека, слитый с геном gfp, была сконструирована на основе pEGFP-N1. Размер плазмиды 5.3 т.п.н.
Структуры плазмид представлены на рис. 1.
Трансфекция ЭС клеток и селекция. Введение плаз-мидной ДНК в ЭС клетки осуществляли с помощью электропорации на приборе СУМ4 (производство Института молекулярной биологии РАН им. В. А. Энгельгардта) при следующих экспериментально подобранных параметрах: продолжительность импульса - 1.5 мс, напряжение 400 В. Для трансфекции 1 000 000 клеток использовали 6-8 мкг плазмидной ДНК. Трансфицированные клетки рас-севали по 300 000 на чашки Петри диаметром 35 мм, покрытые желатином (0.01 %), в 2 мл стандартной среды для ЭС клеток с добавлением LIF (10 нг/мл). Селекцию начинали на вторые сутки после посева добавлением в среду антибиотика G418 (200 мкг/мл). Смену селективной среды проводили каждые 3-4 сут. Поликлональные культуры каждого варианта трансфекции снимали с чашек на 10 день селекции в виде суммарного пула G418-резистентных клонов. Трансфицированные клетки анализировали визуально под микроскопом Аксиоскоп-2 (Carl Zeiss, Германия). Средняя эффективность трансфекции составила около 10-4
Определение пролиферативной активности ЭС клеток. Оценку пролиферативной активности клеток контрольной и трансфицированной линий проводили на третьи сутки после посева прямым подсчетом клеток под микроскопом Olympus СКХ41 (Olympus, Япония) в камере Горяева.
Получение эмбриоидных тел. Для индукции дифферен-цировки с образованием эмбриоидных тел (ЭТ) ЭС клетки изолировали от фибробластов фидерного слоя. Для этого клетки обрабатывали трипсином, центрифугировали, а затем полученную суспензию инкубировали в чашке Петри (d = 60 мм) (Nunc, Дания) в течение 15-30 мин. За это время основная масса фибробластов прикрепляется ко дну чашки, в то время как ЭС клетки остаются в суспензии. Для формирования ЭТ суспензию ЭС клеток переносили на чашку Петри (d = 35 мм) (Nunc, Дания) в количестве 500 000 или на 96-луночную иммунологическую плашку (по 1000 клеток на лунку) и затем помещали в СО2-инкубатор (5 % СО2). Подсчет количества образованных ЭТ проводили на 3-4 сут культивирования.
Для формирования единичных ЭТ был применен метод «висячей капли» [7]. Для этого использовали ЭС клетки,
Рис. 2 Анализ экспрессии рецепторов GFRal и RET в ЭС клетках мыши линии R1. А — экспрессия рецептора GFRal. M — маркер длин фрагментов, 1 — гиппокамп мыши (положительный контроль), 2 — гиппокамп мыши (контроль на загрязнение геномной ДНК), 3 — ЭС клетки линии R1, 4 — ЭС клетки линии R1 (контроль на загрязнение геномной ДНК). Длина продукта 285 п.н. Б — экспрессия рецептора RET. 5 — гиппокамп мыши (положительный контроль), 6 — гиппокамп мыши (контроль на загрязнение геномной ДНК), 7 — ЭС клетки линии R1, 8 — ЭС клетки линии R1 (контроль на загрязнение геномной ДНК), 9 — вода. Длина продукта 297 п.н.
культивируемые на желатиновой подложке в среде с добавлением LIF (Sigma, США). Клетки обрабатывали трипсином и готовили суспензию с концентрацией 25000 клеток/мл. На крышку чашки Петри диаметром 60 мм (Nunc, Дания) наносили по 50 капель объемом 20 мкл, содержащих по 500 клеток. Для создания влажной атмосферы в чашки наливали по 2 мл раствора Хенкса и затем помещали в СО2-инкубатор (5 % СО2). На третьи сутки культивирования образовавшиеся ЭТ переносили в четырехлуночные плашки (диаметр лунки 15 мм), предварительно покрытые желатином, для дальнейшей дифференцировки.
ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАЛИЧИЯ БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА ГЕНА gdnf ЧЕЛОВЕКА В ТРАНСФИЦИРОВАННЫХ ЛИНИЯХ ЭС КЛЕТОК. Трехдневные ЭТ культивировали в четырехлуночном план-
шете с диаметром лунки 15 мм (Nunc, Дания) (3-4 тела на лунку), обработанном 0.01 % желатином, в 700 мкл среды для культивирования ЭС клеток, не содержащей LIF. На 7 сут культивирования дифференцированные клетки фиксировали 4 % параформальдегидом в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре. После трехкратной отмывки PBS клетки преинкубировали в растворе PBS, содержащем 0.1 % Тритон X-100 и 5 % FBS в течение 15 мин при комнатной температуре. В качестве первичных антител использовали поликлональные куриные антитела против GDNF человека (Promega, США) в разведении 1:30 в растворе PBS-0.1 % Тритон-5 % FBS. Инкубацию проводили в течение ночи при +4 0С. После трехкратной отмывки PBS наносили вторичные биотинилированные антитела кролика против иммуноглобулинов курицы («Имтек»,
Россия) в разведении 1:500 и инкубировали 2 ч при комнатной температуре, а затем обрабатывали конъюгатом пероксидазы со стрептавидином («Имтек», Россия) в разведении 1:400 в течение 1 ч при комнатной температуре. Проявляли реакцию с использованием 0.015 % раствора 3-амино-9-этилкарбазола (Sigma, США) в 50 мМ Трис-цитратном буфере, рН 7.0, содержащем 0.06 % Н2О2. Визуальный контроль за развитием окраски осуществляли под микроскопом Olympus CKX41 (Olympus, Япония). Реакцию останавливали трехкратным промыванием клеток дистиллированной водой.
СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. Результаты обрабатывались с помощью программы «Sigma Plot» (Jandel Scientific, США). Достоверности различий групповых средних значений оценивались с помощью дисперсионного анализа (one-way ANOVA). Результаты представлялись в виде стандартной ошибки среднего (mean + SEM). Достоверными считались значимости различий при p < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На начальных этапах работы в ЭС клетках мыши исходной линии R1 с помощью ОТ-ПЦР определяли наличие экспрессии рецепторов для GDNF - RET и GFRa1 на уровне мРНК. Полученные результаты представлены на (рис. 2А, Б). Из этих данных видно, что ЭС клетки экспрессируют как GFRa1, так и RET, хотя и с разной эффективностью.
В результате трансфекции соответствующими рекомбинантными плазмидами и последующей селекции ЭС клеток были получены две линии: es-gdnf (линия, несущая ген gdnf, слитый с геном «зеленого белка») и es-gfp (контрольная линия только с геном «зеленого белка»). Наличие вставки гена gfp облегчает выявление колоний клеток после проведения трансфекции, а также исследование путей и закономерностей дифференцировки ЭС клеток, особенно в опытах in vivo. В полученных клеточных линиях зеленое свечение наблюдалось более чем у 80 % трансфицированных клеток (рис. 3Б). С помощью Нозерн-гибридизации с использованием меченого фрагмента гена gdnf была показана его экспрессия в клетках линии es-gdnf (рис. 4). Кроме того, как видно из этого рисунка, в ЭС клетках происходит экспрессия и эндогенного гена gdnf. Для выявления син-
Рис. 4. Анализ экспрессии гена gdnf в ЭС клетках с помощью Нозерн-гибридизации.
1. РНК из ЭС клеток, трансфицированных плазмидой 1Р14д, несущей ген gdnf человека, слитый с геном
gfp.
2. РНК из ЭС клеток, трансфицированных плазмидой pEGFP-N1, несущей ген gfp.
3. РНК из нетрансфи-цированных ЭС клеток
теза белкового продукта этого гена дифференцированные клетки линий es-gdnf и es-gfp были окрашены с помощью поликлональных антител к GDNF человека. Результаты проведенных экспериментов представлены на (рис. 5А, Б). Слабая розовая окраска (рис. 5А) обусловлена тем, что ЭС клетки, по-видимому, в небольшом количестве синтезируют собственный GDNF. Косвенное подтверждение этому,
как уже упоминалось, было получено с помощью Нозерн-гибридизации (рис. 4-2, 4-3). Ярко окрашенные кластеры клеток свидетельствуют о синтезе GDNF человека в клетках линии es-gdnf (рис. 5Б).
На следующем этапе было изучено влияние экспрессии гена gdnf человека на пролиферативную активность ЭС клеток. Сравнение пролиферативной активности опытных и контрольных клеток не выявило достоверных различий между ними (данные не приведены). Эти результаты позволяют предположить, что продукт гена gdnf человека не играет существенной роли в регуляции клеточного цикла этих клеток
Был проведен анализ влияния экспрессии этого гена на начальную стадию дифференцировки трансфицированных ЭС клеток - образование ЭТ. В ходе исследования определяли время образования ЭТ и их количество. Результаты этих экспериментов (подсчет ЭТ тел проводили на 3 и 4 день после посева клеток) показали, что клетки линии es-gdnf образуют ЭТ практически одновременно с контрольными, однако количество ЭТ в клетках линии es-gdnf было на 40-45 % меньше, чем в линии es-gfp (рис. 6). Полученные данные указывают на то, что в клетках линии es-gdnf происходит достоверное снижение количества ЭТ по сравнению с контролем, что свидетельствует об ингибирующем влиянии GDNF на ранние стадии дифференцировки ЭС клеток.
Таким образом, в результате проведенных экспериментов была получена и частично охарактеризована линия ЭС клеток мыши, экспрессирующих ген gdnf человека, слитый с геном gfp. Повышенная экспрессия данного гена приводит к замедлению формирования ЭТ, не оказывая влияния на морфологию и пролиферативную активность трансфицированных ЭС клеток. В дальнейшем данная линия клеток может быть использована как для исследования влияния гена gdnf человека на последующие стадии дифференцировки ЭС клеток in vitro, особенно в нейро-
Рис. 6. Влияние экспрессии гена hgdnf на образование эмбриоидных тел, трансфицированными ЭС клетками in vitro. 1, 2 — количество образованных ЭТ на 3 день после посева клеток. 3, 4 — количество образованных ЭТ на 4 день после посева клеток. Белые столбики — контроль (es-gfp). Серые столбики — опыт (es-gdnf) * p < 0.05, n = 30
нальном направлении, так и для экспериментов ги ьгьо с целью осуществления коррекции ряда патологий мозга, связанных с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона.
Настоящая работа была выполнена при частичной поддержке гранта Министерства образования и науки РФ (ГК № 02.512.12.2013) и гранта РФФИ (09-04-01464-а).
Список литературы
1. Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л., Хайдарова Н.В. и др.// Онтогенез. 2003. Т. 34. № 3.
С. 204-210.
2. Павлова Г.В., Модестова Е.А., Венгрова С.П. и др. // ДАН. 2001. Т. 376. № 5. С. 694-696.
3. Павлова Г.В., Ефанов А.А., Башкиров В.Н. и др.// Цитология. 2002. Т. 44. № 11. С. 1104-1108.
4. Bain G., Kitchens D., Yao M., Huettner J.E., Gottlieb D.I. // Dev Biol. 1995. V. 168. № 2.
P. 342-357.
5. Buytaert-Hoefen K.A., Alvarez E., Freed O.R. // Stem cells. 2004. V. 22. № 5. P. 669-674.
6. Fraichard A.,Chassande O., Bilbaut G. et al. // J. Cell Sci. 1995. V. 108. № 10. P. 3181-3186.
7. Guan K., Rohwedel J., Wobus A.M. // Cytotechnology. 1999. V. 30. № 4. P. 211-226.
8. Kawai K., Iwashita Т., Murakami H. et al. // Cancer Res. 2000. 15. V. 60. № 18. P. 52545260.
9. Kawasaki H., Mizuseki K., Nishikawa S. et al. // Neuron. 2000. V. 28. № 1. P. 31-40.
10. Kim J.H., Auerbach J.M., Rodrigues-Gomez J.A. et al. // Nature. 2002. V. 418. № 6893.
P. 50-56.
11. Klug M.G., Soonpaa M.H., Koh G.Y., Field L.J. // J. Clin. Invest. 1996. V. 98. № 1. P 216-224.
12. Lin L.F., Doherty D.H., Lile J.D. et al. // Science. 1993. V. 260. № 5111. P. 1130-1132.
13. Manuilova E.S., Arsenyeva E.L., Khaidarova N.V et al. // IJBS. 2008. V. 4. № 1. P. 29-37.
14. Sariola H., Saarma M. // J. Cell Sci. 2003. V. 116. № 19. P. 3855-3862.
15. Soria B., Roche E., Berna G. et al. // Diabetes. 2000. V. 49. № 2. P. 157-162.
16. Wiles M.V., Keller G. // Development. 1991. V. 11. № 2. P. 259-267.
17. Yue F., Cui L., Johkura K. // Stem cells. 2006. V. 24. № 7. P. 1625-1706.
18. Zeng X, Cai J, Chen J et al. // Stem cells. 2004. V. 22. № 6. P. 925-940.
