CC BY
48
УДК 579.61;57.021
DOI: 10.24412/1816-1863-2021-2-15-20
ВЛИЯНИЕ ДОЖДЕВЫХ
ЧЕРВЕЙ НА АНТИБИОТИКО-РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ЕСТЕСТВЕННЫХ И УРБАНИЗИРОВАННЫХ ЭКОСИСТЕМАХ
И. Н. Лыков, д. б. н, профессор, научный руководитель Института естествознания и Медицинского института Калужского государственного университета им. К. Э. Циолковского, linprof47@yandex.ru, г. Калуга, Россия,
М. С. Сикора, Р. Е. Фадеева, студенты Калужского государственного университета им. К. Э. Циолковского, г. Калуга, Россия
СП
х
О
О -1
В статье охарактеризованы микроорганизмы, выделенные из кишечника дождевых червей, и почвы в местах их обитания. Благодаря наличию большого количества питательных веществ, кишечник дождевого червя представляет собой благоприятную среду для активного размножения факультативно-анаэробных микроорганизмов. Дождевые черви формируют почвенную экосистему, положительно влияя на формирование структуры почвы, ее химию и биологию. В связи с этим настоящее исследование было посвящено количественной и качественной оценке микробной ассоциации дождевого червя и прилегающей почвы в естественных и урбанизированных экосистемах. Микроорганизмы выделяли на питательных средах и идентифицировали стандартными микробиологическими методами на основании их морфологических и биохимических характеристик. В образцах почвы и содержимого кишечника дождевых червей мы идентифицировали микроорганизмы рода Bacillus, Acinetobacter, Pseudomonas, Aeromonas, Enterococcus, акти-номицеты и мицелиальные грибы. Установлено, что качественный и количественный состав микрофлоры в естественных и урбанизированных экосистемах имел существенные различия. В естественных экосистемах доминировали мицелиальные грибы и Bacillus, а в городских почвах — Bacillus и Enterococcus. Общее количество микроорганизмов в кишечнике дождевых червей было выше, чем в прилегающих почвах. Различными авторами отмечена способность дождевых ч ервей снижать токсичность загрязняющих веществ. Поэтому нами исследована резистентность выделенных микроорганизмов к антибиотикам. Была выявлена более низкая антибиотикорезистен-тность микроорганизмов кишечника дождевых червей, по сравнению с микрофлорой прилегающей почвы.
In this article, we have characterized microorganisms isolated from the intestines of earthworms and soil in their habitats. Due to the presence of a large amount of nutrients, the intestine of the earthworm is a favorable environment for the active reproduction of facultative anaerobic microorganisms. Earthworms form the soil ecosystem, positively influencing the formation of soil structure, its chemistry and biology. In this regard, the present study was devoted to the quantitative and qualitative assessment of the microbial association of the earthworm and adjacent soil in natural and urbanized ecosystems. Microorganisms were isolated on nutrient media and identified by standard microbiological methods based on their morphological and biochemical characteristics. In soil and intestinal samples of earthworms, we identified microorganisms of the genus Bacillus, Acinetobacter, Pseudomonas, Aeromonas, Enterococcus, actinomycetes, and filamentous fungi. It was found that the qualitative and quantitative composition of microflora in natural and urbanized ecosystems had significant differences. Filamentous fungi and Bacillus dominated in natural ecosystems, and Bacillus and Enterococcus dominated in urban soils. The total number of microorganisms in the intestines of earthworms was higher than in the adjacent soils. Various authors have noted the ability of earthworms to reduce the toxicity of pollutants. Therefore, we investigated the resistance of the isolated microorganisms to antibiotics. A lower antibiotic resistance of microorganisms in the intestines of earthworms was revealed, compared to the microflora of the adjacent soil.
Ключевые слова: естественные и урбанизированные почвы, дождевые черви, микроорганизмы, антибиотикорезистентность.
Keywords: natural and urbanized soils, earthworms, microorganisms, antibiotic resistance.
Многие беспозвоночные являются резервуаром для микроорганизмов. Микроорганизмы м огут длительное время жить и размножаться в кишечнике беспозвоночных, что способствует сохранению бакте-
риальной популяции при неблагоприятных факторах окружающей среды и длительном отсутствии в ней питательных веществ. В этом отношении примечателен симбиоз бактерий и дождевого червя, ко-
15
№2, 2021
О ш
16
№2, 2021
торый поддерживает популяцию микроорганизмов в своем кишечнике и механически перемещает их в различные слои почвы. Дождевые черви относятся к животным, жизнедеятельность которых играет ключевую роль в формировании микробных сообществ почв. В условиях оптимальнои влажности вклад дождевых червеи в почвообразование соизмерим с деятельностью почвенной микрофлоры. Численность дождевых червей колеблется от нескольких десятков до нескольких сотен особей на 1 м2. Они мигрируют на глубину 1,5—2,0 м, перемешивая слои почвы и содействуя ее аэрации [1].
Дождевые черви пропускают сквозь свой кишечник сотни тонн почвы на 1 гектар. В процессе разложения органических веществ, в первую очередь целлюлозы, в пищеварительном тракте червя активное участие принимают симбиотические бактерии. Они обеспечивают червя витаминами, аминокислотами, ферментами [1, 2]. В то же время в пищеварительном тракте червя создаются оптимальные условия, способствующие размножению микроорганизмов. Дождевые черви выделяют в кишечник слизь, состоящую из энергонасыщенных и легко метаболизируемых бактериями соединений. Кроме того, в кишечнике дождевого червя формируются благоприятные физико-химические условия: нейтральный рН, высокая влажность и идеальные температурные условия.
Почвенные микроорганизмы являются основным источником пищи для дождевых червей. Во время питания дождевые черви регулируют рост почвенных микроорганизмов, поедая одни популяции микробов и обеспечивая идеальные условия для роста других. Они эффективно используют полезную микрофлору почвы, уничтожают почвенные патогены и превращают органические отходы в витамины, ферменты, антибиотики, гормоны роста.
Дождевые черви считаются инженерами почвенной экосистемы, так как положительно влияют на формирование структуры почвы, химию и биологию почвы [3, 4]. Они играют важную роль в круговороте питательных веществ [5, 6], углекислого газа и азота [7, 8]. Выделяя сигнальные молекулы, которые обладают гормоноподобным действием, дождевые черви влияют на экспрессию генов растений [9, 10].
Поскольку в кишечнике д ождевых ч ер-вей формируется особый микробиом, влияющий и на почвенную микрофлору, то он может играть важную роль как в снижении устойчивости микроорганизмов к антибиотикам, так и в распространении антибиотикорезистентных микроорганизмов. Имеются данные о том, что дождевые черви, разрушая и минерализуя органические вещества в почве, могут влиять на гены устойчивости к антибиотикам [11].
Объекты и методы исследования
Объектами исследования послужили дождевые ч ерви из различных районов города Калуги (п = 20) и дождевые черви из луговых и лесных массивов за городской чертой (п = 20). Образцы дождевых червей были собраны вместе с прилегающими почвами. Для выделения микроорганизмов содержимое кишечника высевали на питательный агар и среду Сабуро, используя метод серийных разведений. Посевы инкубировали при температуре 28—30 °С в течение трех суток.
Пробы почв были взяты из каждого места обитания дождевых червей (п = 40). Почву собирали с верхнего 10-сантиметрового слоя с помощью небольшого шпателя, который промывали стерильной водой и 70 % этанолом между точками отбора проб. Отбор образцов почвы и их бактериологическое исследование осуществляли в соответствии с ГОСТ 17.4.4.02—2017 «Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа» и Методическими рекомендациями «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы микробиологического контроля почвы» от 24.12.2004. Текстура почвы была от суглинистой до супеси, а рН почвы составлял от 6,0 до 6,8. Не было значительных различий в значениях рН, полученных на всех участках отбора проб. Влажность почвы колебалась от 21,4 до 69,3 %.
Выделенные из образцов бактерии идентифицировали стандартными микробиологическими методами на основании их морфологических и биохимических характеристик.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам осуществляли диффузионным методом с использовани-
Таблица 1
Перечень использованных антибиотиков
№ п/п Наименование Концентрация Обозначение
1 Оксациллин 10 мкг ОКС
2 Кларитромицин 15 мкг KTM
3 Бензилпенициллин 10 ед. ПЕН
4 Ципрофлоксацин 30 мкг ЦОС
5 Новобиоцин 5 мкг НБ
6 Доксициклин 30 мкг ДОК
7 Левофлоксацин 5 мкг ЛФЦ
8 Фосфомицин 200 мкг ФОС
9 Олеандомицин 15 мкг ОЛЕ
10 Неомицин 30 мкг НЕО
11 Тетрациклин 30 мкг TET
12 Ампициллин 10 мкг AMP
13 Левомицетин 30 мкг ЛЕВ
14 Линкомицин 15 мкг ЛИН
ем дисков, пропитанных антибиотиками (табл. 1).
После инкубации были измерены зоны ингибирования роста микроорганизмов. Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием классических методов математической статистики и табличного процессора Microsoft Excel.
Результаты исследования
В образцах почвы и содержимого кишечника дождевых червей мы идентифицировали микроорганизмы родов Bacillus, Acinetobacter, Pseudomonas, Aeromonas, Ente-rococcus, актиномицеты и мицелиальные грибы. Качественный и количественный состав микрофлоры в естественных и ур-
банизированных экосистемах имел существенные различия. Наибольшее количество микроорганизмов выявлено в почвах лиственного л еса, а наименьшее — в почвах урбанизированных территорий. В лиственном лесу доминировали мицелиальные грибы и Bacillus, а в городских почвах — Bacillus и Enterococcus. В мик-робиоме кишечника д ождевых ч ервей преобладали бактерии родов Proteobacteria, Firmicutes, Bacillus и Acinetobacter (табл. 2). Общее количество микроорганизмов в кишечнике дождевых червей было больше, чем в прилегающих почвах, что соотносится с результатами исследований других авторов [12, 13]. Причем общее количество микрофлоры и в кишечнике дождевых червей и в прилегающей почве было больше в естественных экосистемах, чем в городской среде (рис. 1).
Поскольку кишечник дождевого червя представляет собой потенциальный резервуар для почвенных микроорганизмов, вполне вероятно накопление в нем антибиотикорезистентных микроорганизмов с последующим распределением в почве. В литературе имеются данные о том, что дождевые черви в результате мощного ферментативного расщепления в кишечнике органических веществ и микроорганизмов могут снижать относительное количество генов устойчивости к антибиотикам [14]. Для подтверждения этой гипотезы нами исследована сравнительная резистентность к антибиотикам микроорганизмов, выделенных из кишечника дождевых червей и прилегающей почвы.
Установлено, что бактерии, живущие в кишечнике дождевых червей, обладают
СП
s
О
О -1 S
Таблица 2
Качественный состав почвенной микрофлоры и дождевых червей в естественных и урбанизированных экосистемах (%)
Место отбора Bacillus Актиномицеты Acinetobacter Мицелиальные грибы Entero-coccus Firmicutes Proteobacteria
Луг 36 ± 2,0 24 ± 1,1 9 ± 0,1 10 ± 0,4 11 ± 0,8 6 ± 0,5 4 ± 0,3
Лиственный лес 41 ± 2,0 13 ± 0,7 10 ± 0,3 20 ± 0,5 4 ± 0,1 7 ± 0,4 5 ± 0,4
Городские почвы 47 ± 9,1 9 ± 0,9 7 ± 0,2 6 ± 0,5 14 ± 0,7 9 ± 0,5 8 ± 0,3
Дождевые ч ерви 30 ± 8,3 2 ± 0,4 8,5 ± 0,7 5 ± 0,3 1,3 ± 0,1 26,8 ± 11,2 26,4 ± 10,7
в естественных
экосистемах
Дождевые ч ерви 35 ± 7,7 1,2 ± 0,3 7 ± 0,6 8 ± 0,4 0,6 ± 0,1 20,1 ± 9,3 28,1 ± 7,1
в городской среде
17
О ш
меньшей устойчивостью к антибиотикам, чем микроорганизмы в прилегающей почве (рис. 2). Причем в урбанизированных почвах количество антибиотикорезистен-тных микроорганизмов было больше, чем в естественных экосистемах.
Наибольшей устойчивостью выделенные микроорганизмы обладали в отноше-
нии бензилпенициллина, олеандомици-на, линкомицина, оксациллина, кларито-мицина, тетрациклина. Причем процент устойчивых микроорганизмов, выделенных из кишечника дождевых червей, в 1,5—2 раза ниже, чем среди окружающей почвенной микробиоты. Эти данные свидетельствуют о том, что биоремедиация с
4
Й
о „
« 3
Кишечник дождевых червей
Почва
7
6
5
2
1
0
Ш Луг □ Лесной массив И д. Шипово д. Каменка
д. Перцево Л ул. Белинского 1Р ул. Ст. Разина У ул. Маяковского
18
Рис. 1. Общее количество микроорганизмов в кишечнике дождевых червей
и прилегающей почве
Рис. 2. Устойчивость к антибиотикам микроорганизмов, выделенных из почвы и кишечника
дождевых червей
использованием дождевых червей может снижать риск, связанный с присутствием антибиотико -резистентных микроорганиз -мов в почве.
Выводы
1. Общее количество микроорганизмов в кишечнике дождевых червей больше, чем в прилегающих почвах.
2. Наибольшей устойчивостью выделенные микроорганизмы обладают в от-
ношении бензил пенициллина, олеандо-мицина, линкомицина, оксациллина, кла-ритомицина, тетрациклина.
3. Микрофлора кишечника дождевых червей обладает меньшей (в 1,5—2 раза) устойчивостью к антибиотикам, чем почвенные микроорганизмы.
4. Выявлена потенциальная роль дождевых червей в снижении устойчивости к антибиотикам почвенных микроорганизмов.
сп
о
О -1
Библиографический список
1. Лыков И. Н., Шестакова Г. А. Микроорганизмы: Биология и экология. — Калуга: Изд-во «СерНа», 2014 г. — 451 с.
2. Fujii K., Ikeda K. Yoshida S. Isolation and characterization of aerobic microorganisms with cellulolytic activity in the gut of endogeic earthworms // Int. Microbiol. — 2012. — V. 15. — Р. 121—130.
3. Govindarajan B., Prabaharan V. Gut microflora of earthworms: a review // American Journal of Biological and Pharmaceutical Research. — 2014. — V. 1 (3). — P. 125—130.
4. Thakuria D., Schmidt O., Finan D. Gut wall bacteria of earthworms: a natural selection process // ISME J. — 2010. — No. 4. — Р. 357—366.
5. Liu D., Lian B., Wu C. A comparative study of gut microbiota profiles of earthworms fed in three different substrates // Symbiosis. — 2018. — V. 74. — Р. 21—29.
6. Blouin M., Hodson M. E., Delgado E., Baker G., Brussaard L., Butt K. R. A review of earthworm impact on soil function and ecosystem services // Eur. J. Soil Biol. — 2013. — V. 64. — Р. 161—182.
7. Chapuis-Lardy L. A., Brauman L., Bernard A. L., Pablo J., Toucet M. J., Mano L. Effect of the endogeic earthworm Pontoscolex corethrurus on the microbial structure and activity related to CO2 and N2O fluxes from a tropical soil (Madagascar) // Appl. Soil Ecol. — 2010). — V. 45. — Р. 201—208.
8. Hong S. W., Lee J. S., Chung K. S. Effect of enzyme producing microorganisms on the biomass of epigeic earthworms (Eisenia fetida) in vermicompost // Bioresours. Technol. — 2011. — V. 102. — Р. 6344—6347.
9. Lavelle P., Spain A., Blouin M., Brown G., Decaens T., Grimaldi M. Ecosystem engineers in a self-organized soil: a review of concepts and future research questions // Soil. Sci. — 2016. — V. 181— Р. 91—109.
10. Puga-Freitas R., Blouin M. A review of the effects of soil organisms on plant hormone signaling pathways // Environ. Exp. Bot. — 2015. — V. 114. — Р. 104—116.
11. Kelsen Ju. R., Wu G. D. The gut microbiota, environment and diseases of modern society // Gut Microbes. — 2012. — V. 3 (4). — Р. 374—382.
12. Medina-Sauza R. M., Alvarez-Jimenez M., Delhal A., Reverchon F., Blouin M., Guerrero-Analco J. A., Cerdan C. R., Guevara R., Villain L., Barois I. Earthworms building up soil microbiota, a review // Environ. Sci. — 2019. https://doi.org/10.3389/fenvs.2019.00081
13. Suna M., Chao H., Zheng X., Deng Sh., Yec M., Hua F. Ecological role of earthworm intestinal bacteria in terrestrial environments: а review // Science of the total environment. — 2020. — V. 740.
14. Dong Zhu, Manuel Delgado-Baquerizo, Jian-Qiang Su, Jing Ding, Hu Li, Michael R. Gillings, Josep Penuelas, Yong-Guan Zhu. Deciphering potential roles of Earthworms in mitigation of antibiotic resistance in the soils from diverse ecosystems // Environmental Science & Technology. — 2021. DOI: 10.1021/acs.est.1c00811
INFLUENCE OF EARTHWORMS ON ANTIBIOTIC RESISTANCE OF SOIL MICROORGANISMS IN NATURAL AND URBANIZED ECOSYSTEMS
I. N. Lykov, Dr. Habil. (Biology), professor, scientific director of the Institute of Natural Science and the Medical Institute of Kaluga State University named after V. I. K E. Tsiolkovsky, linprof47@yandex.ru, Kaluga, Russia,
M. S. Sikora, R. E. Fadeeva, students, Kaluga State University named after V. I. K. E. Tsiolkovsky, Tsiolkovsky, Kaluga, Russia
19
References
IK
o
1. Lykov I. N., Shestakova G. A. Mikroorganizmy: Biologiya i ekologiya [Microorganisms: Biology and Ecology.]. — Kaluga: SerNa Publishing House, 2014. — 451 p. [in Russian].
2. Fujii K., Ikeda K. Yoshida S. Isolation and characterization of aerobic microorganisms with cellulolytic LQ activity in the gut of endogeic earthworms // Int. Microbiol. — 2012. — V. 15. — Р. 121—130.
3. Govindarajan B., Prabaharan V. Gut microflora of earthworms: a review // American Journal of Biological and Pharmaceutical Research. — 2014. — V. 1 (3). — P. 125—130.
4. Thakuria D., Schmidt O., Finan D. Gut wall bacteria of earthworms: a natural selection process // ISME J. — 2010. — No. 4. — Р. 357—366.
5. Liu D., Lian B., Wu C. A comparative study of gut microbiota profiles of earthworms fed in three different substrates // Symbiosis. — 2018. — V. 74. — Р. 21—29.
6. Blouin M., Hodson M. E., Delgado E., Baker G., Brussaard L., Butt K. R. A review of earthworm impact on soil function and ecosystem services. // Eur. J. Soil Biol. — 2013. — V. 64. — Р. 161—182.
7. Chapuis-Lardy LA, Brauman L., Bernard A. L, Pablo J., Toucet M. J., Mano L. Effect of the endogeic earthworm Pontoscolex corethrurus on the microbial structure and activity related to CO2 and N2O fluxes from a tropical soil (Madagascar) // Appl.Soil Ecol. — 2010. — V. 45. — Р. 201—208.
8. Hong S. W., Lee J. S., Chung K. S. Effect of enzyme producing microorganisms on the biomass of epigeic earthworms (Eisenia fetida) in vermicompost // Bioresours. Technol. — 2011. — V. 102. — Р. 6344—6347.
9. Lavelle P., Spain A., Blouin M., Brown G., Decaens T., Grimaldi M. Ecosystem engineers in a self-organized soil: a review of concepts and future research questions // Soil. Sci. — 2016. — V. 181. — Р. 91—109.
10. Puga-Freitas R., Blouin M. A review of the effects of soil organisms on plant hormone signaling pathways // Environ. Exp. Bot. — 2015. — V. 114. — Р. 104—116.
11. Kelsen Ju. R., Wu G. D. The gut microbiota, environment and diseases of modern society // Gut Microbes. — 2012. — V. 3 (4). — Р. 374—382.
12. Medina-Sauza R. M., Alvarez-Jimenez M., Delhal A., Reverchon F., Blouin M., Guerrero-Analco J. A., Cerdan C. R., Guevara R., Villain L., Barois I. Earthworms building up soil microbiota, a review // Environ. Sci. — 2019, https://doi.org/10.3389/fenvs.2019.00081
13. Suna M., Chao H., Zheng X., Deng Sh., Yec M., Hua F. Ecological role of earthworm intestinal bacteria in terrestrial environments: а review // Science of the total environment. — 2020. — V. 740, https:// doi.org/ 10.1016/ j.scitotenv. 2020. 140008
14. Dong Zhu, Manuel Delgado-Baquerizo, Jian-Qiang Su, Jing Ding, Hu Li, Michael R. Gillings, Josep Penuelas, Yong-Guan Zhu. Deciphering potential roles of Earthworms in mitigation of antibiotic resistance in the soils from diverse ecosystems // Environmental Science & Technology, 2021, DOI: 10.1021/ acs.est.1c00811
20
