CC BY
30
ЭКОТОКСИКОЛОГИЯ
УДК 579.64:574.21
DOI 10.24411/0235-2516-2018-10065
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И ПРООКСИДАНТНЫЕ ЭФФЕКТЫ EISENIA FETIDA SAVYGNI, 1826 ПРИ ВНЕСЕНИИ В ПОЧВУ
НАНОЧАСТИЦ ВОЛЬФРАМА
С.В. Лебедев, д.б.н., И.А. Гавриш, Е.А. Сизова, д.б.н., Е.В. Яушева, к.б.н.
Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий РАН, e-mail: [email protected]
Представлены результаты по изучению влияния нарастающих концентраций наночастиц вольфрама (10, 30, 90 и 120 мг/кг сухого вещества) в искусственной почве на адаптационные способности червей, микробиоценоз кишечника червей и почвы до и после вермикультивирования в течение 28 суток. Использовали наночастицы (НЧ) вольфрама (W) размером 50,7±0,3 нм, Z-потенциал - 30,00±0,26 мВ. Предварительный анализ биологической активности НЧ W in vitro проводили в тесте ингибирования бактериальной биолюминесценции. Значения токсикологического параметра ЕС50 свидетельствовали о высокой токсичности НЧ W в низких дозировках при пролонгированном контакте (0,05 М через 170 мин., 0,0125 М через 180 мин.). Внесение в субстрат аналогичных дозировок НЧ W сопровождалось возрастанием биомассы червя при дозах 30-120 мг/кг. Уровень адаптации организма Eisenia fetida выражался в нарастании активности супероксиддисмутазы и снижения уровня каталазы в зависимости от дозовой нагрузки. Уровень белка возрастал во всем диапазоне исследуемых дозировок. При внесении НЧ W в дозировке от 10 до 120 мг/кг зафиксирован бактерицидный эффект, в частности, снижение почвенной микрофлоры на 44,50-82,25%, кишечной микрофлоры Eisenia fetida на 25,8-54,2%. В этой связи низкая концентрация W в первичной фазе действует как катализатор биохимических процессов в организме червя, тогда как c нарастанием концентрации Wусиливался бактерицидный эффект.
Ключевые слова: наночастицы вольфрама, Eisenia fetida, почва, каталаза, супероксиддисму-таза, микроорганизмы.
MICROBIOLOGICAL ACTIVITY AND PROOXIDANT EFFECTS OF EISENIA FETIDA SAVYGNI, 1826 IN THE FIELD OF NANOPARTICLES OF TUNGSTEN
Dr.Sci. S.V. Lebedev, I.A. Gavrish, Dr.Sci. E.A. Sizova, Ph.D. E.V. Yausheva
Federal Research Center for Biological Systems and Agrotechnologies of RAS, e-mail: [email protected]
The results of studying the influence of increasing concentrations of tungsten nanoparticles (10, 30, 90 and 120 mg/kg of dry matter) in artificial soil on the adaptive capacity of worms, microbiocoenosis of intestinal worms and soil before and after vermicultivation for 28 days are presented. Tungsten (W) nanoparticles of 50.7±0.3 nM were used, and the Z potential was 30.00±0.26 mV. A preliminary analysis of the biological activity of nanoparticles W in vitro was carried out in the inhibition test of bacterial bioluminescence. The EC50 toxico-logical parameter values indicated a high toxicity of nanoparticles W at low dosages with prolonged contact (0.05 M after 170 min., 0.0125 M after 180 min.). The introduction of similar doses of nanoparticles W into the substrate was accompanied by an increase in the biomass of the worm at doses of30-120 mg/kg. The level of adaptation of the organism Eisenia fetida was expressed in the growth of activity of superoxidedismutase and decrease in the level of catalase depending on the dose load. The protein level increased throughout the range of dosages tested. At application of nanoparticles W in a dosage from 10 to 120 mg/kg bactericidal effect is fixed, in particular, decrease of soil microflora by 44.50-82.25%, intestinal microflora Eisenia fetida by 25.8-54.2%. In this regard, a nanoparticles of W in the primary phase acts as a catalyst for biochemical processes in the body of the worm, whereas as the W concentration increases, the bactericidal effect increases.
Keywords: nanoparticles of tungsten, Eisenia fetida, soil, catalase, superoxidedismutase, microorganisms.
В последние десятилетия наночастицы (НЧ), благодаря своим уникальным характеристикам, таким как размерность до 100 нм, высокая реакционная способность, высокая степень абсорбции и аккумуляции в организме, стали предметом широкого изучения и применения в различных областях науки и техники. В сельском хозяйстве НЧ используют как наноудобрения, нанопестициды и стимуляторы роста растений [1-4]. Недавние исследования показывают, что производимые наноматериа-лы, в том числе металлы и их оксиды, имеют разностороннее действие на водные и наземные организмы [5-7], а также на широкий спектр почвенных микро- и макроорганизмов [8, 9]. Среди макрофауны почвы обращают на себя внимание дождевые черви как доминирующие представители почвенного сообщества, к тому же они оказывают влияние на многие организмы, такие как растения [9], микроорганизмы [10] и беспозвоночные [11]. Трофоме-таболическая активность дождевых червей во время вермикомпостирования включают в себя не только пищеварение и выделение легкоусвояемых вещества, такие как слизь для микрофлоры [12], но также отбор и транспорт наиболее полезных микроорганизмов в почвенный биоценоз. По этой причине, дождевые черви считаются «инженерами экосистем» [13], а микроорганизмы, в том числе и микроскопические грибы, являются частью рациона дождевых червей [14]. Вышеописанная роль дождевого червя в экосистеме определила его использование в качестве тест-объекта для оценки и прогнозирования риска загрязнения поллютантами, в частности металлами, которые поступая в почву, могут вызвать смертность, снижение рождаемости и роста дождевых червей.
Существует ограниченное число работ о влиянии вольфрама на живые объекты и окружающую среду, и выявляющие преимущественно токсическое действие его соединений [15, 16], но не затрагивающие его наноформы. Вольфрам относится к 3 классу опасности, его используют для производства ламп накаливания и рентгеновских трубок, а также в качестве альтернативы свинца в рыболовных снастях и пулях для охотничьего и стрелкового оружия. Во многом, биологическое действие вольфрама связано с механизмом его окисления при распределении из почвы в воду. В ходе этого процесса вольфрам способен смешиваться с органическими веществами, присутствующими в природных почвах, образуя токсичные сочетания [15]. Известно, что допустимый порог концентрации W в воде составляет 0,05 мг/дм3, а фоновые концентрации в почве - 10 мг/кг. При этом стоит обратить внимание на тот факт, что для вольфрама не определены ПДК в почве.
Цель исследования - оценка адаптационно-приспособительных особенностей организма червя
Eisenia fetida (E. fetida), микрофлоры его кишечника и почвенного микробиоценоза при экспозиции на искусственной почве с различными концентрациями наночастиц W.
Материалы и методы. В исследовании использовали НЧ W, размером 50,7±0,3 нм и дзет-потенциалом - 30,0±0,26 мВ производства ООО «Передовые порошковые технологии» (Россия). Наночастицы получены методом плазмохимиче-ского синтеза. Определение дзета-потенциала частиц проводили на анализаторе размеров частиц и дзета-потенциала Photocor Compact-Z (Россия).
Для исследования была подготовлена стандартизированная искусственная почва (OECD, 1984) путем смешивания 70% кварцевого песка, 20% каолина и 10% измельченного торфа (органический азот - 5,8%, рН была скорректирована до 6,0±0,5 порошкообразным карбонатом кальция (СаСОэ).
Лиозоли наночастиц вольфрама готовили по методу Scott-Fordsmand [17] добавлением испытуемого металла (сухой порошок) в концентрациях 10, 30, 90 и 120 мг/кг в деионизированную воду (10 мл) с последующим диспергированием на ультразвуковом диспергаторе (УЗДН, f-35 кГц, N-300 Вт, Россия) в течение 30 минут. Впоследствии приготовленные лиозоли для каждой повторности и концентрации были смешаны с влажной (40-45%) почвой (500 г), затем доведены дистиллированной водой до влажности 65-70% и перемешаны с помощью миксера.
Предварительную оценку биологической активности НЧ W in vitro проводили в тесте ингибирова-ния бактериальной биолюминесценции. Первоначально пробы суспензий наноматериалов для эксперимента готовили в концентрации 4 М (736 мг/мл) для наночастиц и подвергали обработке ультразвуком в течение 30 мин. Для оценки влияния различных доз наноматериалов из полученной суспензии готовили серию последовательно двукратные разведения в трех повторностях.
В качестве объекта воздействия использовали генно-инженерный люминесцирующий штамм Escherichia coli K12 TG1, конститутивно экспрес-сирующий luxCDABE-гены природного морского микроорганизма Photobacterium leiongnathi 54D10, производство НВО «Иммунотех» (Россия, Москва) в лиофилизированном состоянии под коммерческим названием «Эколюм». Тест проводили по общепринятой методике [18].
Результаты влияния наноматериалов на интенсивность бактериальной биолюминесценции оценивали с использованием формулы:
J _ ^DHKK ^
^Пиин Х^Омкк где Ik и Io - интенсивность свечения контрольных и опытных проб на 0-й и n-й минутах измерения. Учитывали 3 пороговых уровня токсичности: меньше 20 - образец «не токсичен» (тушение лю-
минесценции < 20%); от 20 до 50 - образец относительно токсичен (тушение люминесценции 50%); равно или больше 50 - образец токсичен (тушение люминесценции > 50%).
На основании проведенного теста были определены дозы для вермикомпостирования: 10 мг, 30 мг, 90 мг, 120 мг, соответствующие молярным дозировкам в 0,005 М, 0,015 М, 0,045 М, 0,06 М.
Использованные в исследованиях черви Eisenia fetida были приобретены в ООО «БиОЭра-Пенза» и культивированы в питомнике Лаборатории агроэкологии техногенных наноматериалов Федерального научного центра биологических систем и аг-ротехнологий РАН (Оренбург, Россия). Червей культивировали в конском навозе без каких-либо лекарственных препаратов при 22±2°С. В эксперименте использовали червей массой от 350 до 450 мг. Акклиматизацию проводили в течение 3 суток на почвенном субстрате при постоянной температуре 20°С. Перед постановкой на эксперимент червей промывали дистиллированной водой и помещали на 3 суток в пластиковые контейнеры с влажным субстратом из фильтровальной бумаги для очищения пищеварительного тракта [19], затем червей промывали и взвешивали.
Для проведения исследования была отобрана совокупность червей одинаковой массы, из которых были сформированы группы (n = 10): 1 группа - культивирование червей с добавлением НЧ W в концентрации 10 мг/кг почвы; 2 - с добавлением НЧ W в концентрации 30 мг/кг почвы; 3 - 90 мг/кг почвы; 4 - 120 мг/кг почвы; 5 (контроль) - культивирование червей без внесения НЧ в субстрат. Для каждой концентрации были использованы пластиковые контейнеры длиной 5 см, шириной 4 см и высотой 4 см. Эксперимент проводили в течение 28 суток, при t воздуха 22±2°С, в пяти повторностях. Взвешивание проводили на 0, 14 и 28 день эксперимента. Выживаемость определяли ежедневно, мертвых особей удаляли из субстрата.
Определение антиоксидантной активности ферментов (каталаза (КТ), супероксиддисмутаза (СОД) червей проводили на 28 сутки эксперимента на автоматическом биохимическом анализаторе CS-T240 («Dirui Industrial Co., Ltd», Китай) с использованием коммерческих биохимических наборов Randox (США). Готовили вытяжки из червей путем их гомогенизации в буфере (Tris 50 ммоль/л, DTT 1,0 ммоль/л, EDTA 1,0 ммоль/л, сахароза 250 ммоль/л, рН 7,5). Черви были гомогенизированы на гомогенизаторе тканей Tissue Lyser LT, QIAGEN (QIAGEN, Германия). Полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 15000 об/мин, полученный супернатант разбавляли буферной смесью до 10% гомогената.
Оценку влияния НЧ на численность микрофлоры кишечника червей и почвы проводили на 28
сутки. Очищение кишечника червей от пищи осуществляли выдерживанием червей в пластиковом контейнере на влажной фильтровальной бумаге в течение 3 суток. Для выделения кишечников, очищенных от пищи, червей вскрывали с использованием стерильного скальпеля, отделяли кишечник стерильным пинцетом и помещали в стерильную пробирку. Отбор проб почвы осуществляли в стерильные пробирки.
Микробиологические исследования кишечника червей и почвы проводились в первые сутки после отбора проб [20]. Определение общей численности гетеротрофных микроорганизмов посев проводили на мясо-пептонном агаре (МПА). Микроорганизмы, использующие минеральные формы азота, выделяли на крахмал-аммиачном агаре (КАА). Посев микроорганизмов на среду Чапека осуществляли для выделения микроскопических грибов. В среду с МПА и КАА добавляли нистатин для предотвращения роста грибов в концентрации 40 мкг/мл среды, а в среду Чапека - антибиотик пенициллин (50 мкг/мл среды) для предотвращения бактериального роста. Численность бактерий выражали в колоние-образующих единицах (КОЕ) на 1 г сухой почвы.
Результаты. НЧ W в результате контакта с тест-объектом приводили к полному ингибированию свечения клеток в дозе 1-4 М (184-736 мг/мл) в первые минуты контакта, при дальнейшем разведении в дозе 0,1 М (18,4 мг/мл) через 40 мин., в дозе 0,05 М (9,2 мг/мл) через 170 мин., характеризуя вышеприведенные концентрации как остротоксичные. Увеличение разведения до 0,025-0,00625 М (4,62,3 мг/мл) и сроков контакта до 180 мин. приводило к 50% ингибированию биолюминесценции через 145-170 мин. контакта, отмечая дозы как подострой токсичности. Последующие разведения значимого эффекта на динамику свечения не оказывали. Значения токсикологического параметра ЕС50 свидетельствовали о токсичности НЧ W в дозах свыше 0,0125 М. Снижение свечения бактерий при пролонгировании контакта до 180 мин предполагает наличие хронического токсического эффекта НЧ, требующего времени для развития.
На основании проведенного теста были определены дозы для вермикомпостирования: 10 мг, 30 мг, 90 мг, 120 мг, равные молярным дозировкам в 0,005 М, 0,015 М, 0,045 М, 0,06 М, а также соответствующие низкой, средней и высокой степени токсичности.
Обсуждая механизм возможного действия НЧ W, отметим, что главным образом он связан со способностью вызывать одно- и двуцепочечные разрывы в молекуле ДНК и оказывать мутагенное действие [21, 22]. При этом в работе [22] показано, что наночасти-цы соединения вольфрама проявляют мутагенный эффект, в отличие от таких же микроразмерных соединений, что указывает на большую реакционную способность именно наноразмерных веществ по
сравнению с их микроразмерными аналогами. В меньшей степени токсическое действие наночастиц вольфрама объясняется способностью нарушать ферментативные процессы в клетке и оказывать ци-тотоксический эффект [23-25]. В эффекте токсичности наночастиц вольфрама немаловажную роль может играть развитие окислительного стресса, как было показано для многих наносоединений [26, 27].
На 14 сутки живая масса червя по сравнению с первоначальной массой увеличилась на 16,7%; 15,7%; 25,9% и 15,9% (р < 0,05) при концентрации НЧ W соответственно 10, 30, 90 и 120 мг/кг СВ (рис. 1).
На 28 сутки, в противовес дозе 10 мг/кг, где наблюдалось снижение массы червей на 6%, в диапазоне концентраций 30-120 мг/кг наблюдалось пропорциональное увеличение массы червей на 720% вносимым дозировкам. В целом, по сравнению с предыдущим периодом, на 28 сутки биомасса червей, в основном была меньше, исключение составила дозировка W 120 мг/кг, где было зафиксировано увеличение массы на 20% (р < 0,05), и на 16% на 14 сутки. Таким образом, стимулирование роста биомассы червей на 14 сутки, связанное с поступлением вольфрама из почвы в низких и средних концентрациях, на 28 сутки сменилось уменьшением биомассы, что может быть связано с высокой степенью отдачи ионов в субстрат и, как следствие, высокой проникающей способностью НЧ через пищеварительный тракт червей. Напротив, высокая концентрация НЧ W (120 мг/кг сухой почвы) оказала меньшую степень влияния, основанную на снижении токсичности данной дозировки в почве, за счет способности НЧ при высоких концентрациях формировать агломераты с низкой подвижностью в почве. Растворенные или твердые частицы некоторых органических веществ, также, могут аккумулировать и сорбировать на поверхности НЧ в составе почвенной матрицы и тем самым снижать их биоактивность [28].
Рис. 1. Изменение массы Е./еИйа при различных концентрациях НЧ W при экспозиции в почве, % от начальной массы
100 80 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80 -100
I
Е СОД,%
И каталаза,мкМ /л
10 30 90 120
Концентрация W, мг/кг
Рис.
2. Разница активности антиоксидантных ферментов, % от контроля
В ходе оценки биотоксичности НЧ W в отношении E. fétida исследована активность ферментов антиоксидантной защиты. На 14 сутки активность СОД и КТ была на уровне контроля. На 28 сутки уровень СОД в черве увеличивалась с нарастанием дозы. Дальнейшее увеличение нагрузки до 120 мг/кг приводит к увеличению активности СОД до 85,6%, что выше уровня контроля на 73,2% (рис. 2).
Уровень КТ, как фермента, присутствие которого связано с разложением перекиси водорода на воду и кислород, уменьшался в зависимости от до-зовой нагрузки (на 20,7; 82,2; 54,8; 61,5% при дозе соответственно 10; 30; 90 и 120 мг/кг СВ). По участию ферментов в адаптационно-приспособительных реакциях организма червя, можно судить о действии токсического агента в клетках и активации защитных механизмов. Активность СОД в дождевых червях увеличивается с умеренным экологическим стрессом и уменьшается с тяжелой экологической напряженностью. Из этого следует, что антиоксидантный статус организма червя имеет определенную степень толерантности воздействия НЧ W в зависимости от дозы. В тоже время, наночастицы вольфрама оказывали угнетающее воздействие на активность каталазы, что может свидетельствовать о «выключении» данного механизма обезвреживания активных форм кислорода (АФК) и увеличению окислительного стресса.
Известно, что, действуя как первичная система антиоксидантной защиты, КТ и СОД, катализируют преобразование активных форм кислорода в менее активные или инертные виды [29]. В нашем случае с СОД, влияние НЧ W на ее активность в E. fétida, сопровождалось увеличением, а в случае с КТ уменьшением ее активности в диапазоне концентраций W от 0 до 120 мг/кг. Результаты по изменению активности антиоксидантных ферментов коррелируют с выживаемостью E. fétida. На фоне повышения активности СОД (доза 120 мг/кг), наблюдалось увеличение смертности червей до 10% по сравнению со 100% выживаемостью в других груп-
пах. В тоже время снижение активности каталазы может указывать на ингибирующий эффект НЧ W в отношении данного фермента, что требует проведения исследований.
Способность компонентов почвы вступать во взаимодействие с НЧ металлов, связывать их и снижать биодоступность, нивелирует токсическое НЧ в отношении E. fetida. Растворенные или твердые частицы некоторых органических веществ в почве способны агломерировать и сорбировать на поверхности НЧ, связывать в почвенной матрице, тем самым снижая их биоактивность [30].
Интересно отметить, что при разнонаправленной ферментативной активности уровень белка в черве увеличивался с нарастанием дозы НЧ W и составил 0,36; 0,83; 0,99 и 1,5%, в дозах 10, 30, 90 и 120 мг/л, соответственно, по сравнению с уровнем белка 0,34 мг/л в контрольной группе. Увеличение содержания белка (рис. 3) может являться защитным механизмом при стрессе у животных. Исследования [31] на примере Cd показали увеличение содержания протеинов до 65% в тканях дождевых червей. В другой работе [32] также сообщается, что содержание белка увеличивается при экспозиции с низкими концентрациями Cd. В тоже время, авторы приведенных работ отмечают, что нарушение ферментативных процессов в организме может являться одним из механизмов нарушения обмена белка, что может привести к его избыточному накоплению, а также может иметь место включение механизмов защиты червей. Как известно, дождевые черви являются почвенными организмами, которые имеют высокую устойчивость к тяжелым металлам [33]. Таким образом, концентрации W, используемые в данном исследовании, показали стимулирующее влияние на содержание белка.
При внесении в почву вольфрамата натрия в пересчете на 586 мг/кг сухой почвы не наблюдалось статистически значимого влияния на выживаемость и массу червей, тогда как в проведенном нами иссле
довании получены противоположные результаты, свидетельствующие о потенциальной опасности наночастиц для почвенной биоты.
Результаты количественного учета микроорганизмов почвы и кишечника червей показали, что внесение в почву возрастающего количества нано-частиц вольфрама через 28 суток инкубации приводило к изменению численности микроорганизмов, как в кишечнике червей (рис. 4), так и в самой почве (рис. 5).
По мере увеличения концентрации наночастиц вольфрама с 10 до 120 мг/кг отмечалось снижение общей численности гетеротрофных микроорганизмов в почве с вермикомпостированием на 44,582,25%, в кишечнике E. fetida на 25,8-54,2%.
□ Общая численность гетеротрофных микроорганизмов
□ Микроорганизмы, использующие минеральные формы N а Микроскопические грибы
Рис. 4. Численность микроорганизмов отдельных групп в кишечнике E. fetida после 28-суточного культивирования с НЧ W в различных дозировках, % от контроля
Рис. 3. Содержание белка в тканях E. fetida при внесении наночастиц вольфрама в почву
Рис. 5. Численность микроорганизмов отдельных групп в почве после 28-суточной инкубации с НЧ W в различных дозировках, % от контроля
Количественный анализ микроорганизмов отдельных групп в контрольных пробах показал доминирование по числовому соотношению бактерий, тогда как численность микроскопических грибов была на несколько порядков ниже. Так, внесение НЧ W снижало численность грибов в почве в первой группе на 20%, второй, третьей и четвертой группах на 28; 32; 40% относительно контроля, соответственно. Анализ количества грибов в кишечнике E. fetida контрольной и опытных групп показал снижение их числа на 60; 6% в первой и второй группах, на 33,3; 20% в третьей и четвертой группах, соответственно. В эксперименте было зафиксировано отсутствие устойчивости микроскопических грибов к воздействию НЧ W.
Численность гетеротрофных бактерий, культивируемых на МПА, в контрольных образцах была преобладающей (77,92±7,8% в почве и 49,59±3,71% в кишечнике от общего числа микроорганизмов). С внесением различных концентраций наночастиц вольфрама наблюдалось прямо пропорциональное снижение числа гетеротрофных микроорганизмов. При внесении минимальных дозировок наночастиц их численность в почве и кишечнике червей снизилась на 55,6 и 27,5% по сравнению с контролем. Дальнейшее увеличение дозы вносимых наноча-стиц привело к снижению численности в почве на 68,8; 71,1 и 92,2% во второй, третьей и четвертой опытных группах, соответственно, а в кишечнике численность уменьшилась на 40; 70 и 83,7%. Данные наблюдения показали отсутствие резистентности гетеротрофных микроорганизмов к действию НЧ W, притом в почве это явление было выражено сильнее.
Анализ численности бактерий, выросших на КАА (среда, в том числе, для актиномицетов -главных симбионтов дождевых червей), показал, что данная группа изменяла свою численность не так быстро, как две вышеупомянутые категории микроорганизмов. Численность бактерий при воздействии наночастиц вольфрама характеризовалась снижением в почве на 4,3; 21,7; 43,4 и 47,8% соответственно в 1, 2, 3 и 4 группах; в кишечнике E. fetida на 41,6; 6,6; 33,3 и 5% в 1, 2, 3 и 4 группах в сравнении с контролем.
Стоит отметить, что исследование численности микроорганизмов, использующих минеральные формы азота и, в особенности, актиномицетов -важный показатель, так как отдельные группы ак-тиномицетов являются типичными симбионтами беспозвоночных, в том числе дождевых червей и принимают участие в преобразовании питательных компонентов почвы [34]. В результате, наблюдалась общая тенденция снижения численности микроорганизмов в почве и кишечнике под действием НЧ W по мере увеличения вносимой дозировки. В тоже время, в почве снижение численности микро-
организмов всех групп было более выраженным, что может свидетельствовать о положительном эффекте вермикультивирования и наличии защитных механизмов червей E. fetida. С возрастанием концентрации НЧ W численность микроорганизмов неуклонно снижалась, проявлялся бактерицидный эффект в отношении почвенной и кишечной микрофлоры.
Таким образом, внесение W оказывает угнетающее влияние на почвенный микробиоценоз и микробиоценоз кишечника червей, что может быть обусловлено совокупностью следующих факторов: непосредственным контактом наночастиц вольфрама с клетками микроорганизмов, а также генерацией окислительного стресса под воздействием данных наночастиц.
Результаты работы коррелируют с литературными данными, согласно которым непосредственный контакт НЧ металлов с бактериальными клетками вызывает нарушение целостности бактериальной клеточной мембраны и изменения в работе внутриклеточных систем [35]; таким образом, НЧ металлов способны оказывать бактериостатический и бактерицидный эффекты на клетки микроорганизмов. В другой работе [36] на примере НЧ Cu показана способность проявлять антимикробные свойства по отношению к широкому спектру микроорганизмов, в том числе и патогенным бактериям. Согласно экспериментальным данным, цито-токсичность НЧ Cu обусловлена не только нано-размерностью частиц, высоким значением удельной поверхности и тесным взаимодействием с микробной мембраной, но и образованием выщелоченных медно-пептидных комплексов, за счет которых в несколько раз увеличивается генерация активных форм кислорода, уменьшается жизнеспособность клеток и ингибируется общий рост биомассы [36].
Таким образом, в ходе работы получены новые результаты о биологическом действии НЧ W на морфолого-физиологические показатели красных калифорнийских червей E. fetida, а также in vitro биолюминесцентную тест-систему «Эколюм» и микробиоценоз кишечника червей и почвы при интродукции в нее НЧ W. Показана необходимость и обоснованность комплексной оценки биотоксичности НЧ в различных средах обитания. При биолюминесцентном анализе установлено, что W оказывает токсичный эффект при моделировании острой токсичности, при этом эффект развивается во времени. В эксперименте подтверждено негативное влияние техногенных наноматериалов на примере W на почвенный микробиоценоз, проявляющийся его обеднением, а следовательно, деградацией и снижением плодородия почв. Данный эффект может быть связан с окислительным стрессом, генерируемым под воздействием НЧ W. Показан положитель-
ный эффект применения вермикомпостирования на примере повышения численности микроорганизмов, использующих минеральные формы азота. НЧ W могут быть признаны потенциально токсичными для живых организмов, что требует разработки мер по биоремедиации загрязненных НЧ W почв. Поэтому, данные работы могут
рассматриваться двояко: результаты могут быть использованы как при разработке технологий восстановления антропогеннонарушенных почв, так и при проведении дальнейших исследований НЧ W как потенциального антимикробного агента.
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных научных исследований Российской академии наук (№ 0761-2018-0032).
Литература
1. Спиридонов А.Б., Касаткин В.В., Дородов П.В. Дражирование семян льна-долгунца с использованием электротехнологий и наноудобрений // Научный журнал КубГАУ, 2013, № 92. - С. 447-456.
2. El-Feky S.A., Mohammed M.A., Khater M.S., Osman Y.A., Elsherbini E. Effect of magnetite Nano-Fertilizer on Growth and yield of Ocimum basilicum L. // Int. J. Indigenous Med. Plants, 2013, Vol. 46, № 3. - P. 1286-1293.
3. Массалимов И.А. Сравнение биологических свойств наночастиц серы и известных пестицидов // Башкирский химический журнал, 2013, № 3. - С. 142-144.
4. Bala N., Dey A., Das S., Basu R., Nandy P. Effect of Hydroxyapatite nanorod on chickpea (Cicer arietinum) plant growth and its possible use as nano-fertilizer // Iran J. Plant Physiol., 2014, Vol. 4, № 3. - P. 1061-1069.
5. Yausheva Е., Sizova Е., Lebedev S., Skalny A., Miroshnikov S., Plotnikov A., Khlopko Y., Gogoleva N., Cherkasov S. Influence of zinc nanoparticles on survival of worms Eisenia fetida // Environ. Sci. Pollut. Res., 2016, Vol. 23, № 13. - Р. 13245-13254.
6. Lebedev S., Yausheva E., Galaktionova L., Sizova E. Impact of molybdenum nanoparticles on survival, activity of enzymes, and chemical elements in Eisenia fetida using test on artificial substrata // Environ. Sci. Pollut. Res., 2016, Vol. 23, № 18. - Р. 18099-18110.
7. Kosyan D.B., Rusakova E.A., Sizova E.A., Yausheva E.V., Miroshnikov S.A. Toxic effect and mechanisms of nanoparticles on freshwater infusoria // International Journal of GEOMATE, 2016, Vol. 11, № 23. - P. 2170-2176.
8. Титова В.И., Козлов А.В. Методы оценки функционирования микробоценоза почвы, участвующего в трансформации органического вещества. - Нижний Новгород: НГСХА, 2012. - 64 с.
9. Brown G.G., Barois I., Lavelle P. Regulation of soil organic matter dynamics and microbial activity in the drilosphere and the role of interactions with other edaphic functional domains § // European Journal of Soil Biology, 2000, Т. 36, № 3-4. - P. 177-198.
10. Lavelle P. et al. Mutualism and biodiversity in soils // The significance and regulation of soil biodiversity. - Springer, Dordrecht, 1995. - P. 23-33.
11. Lavelle P. Diversity of soil fauna and ecosystem function // Biology International, 1996, Т. 33. - Р. 3-16.
12. Brown G.G. et al. How earthworms affect plant growth: burrowing into the mechanisms // Earthworm ecology, 2004, Т. 2. - P. 13-49.
13. Jones D.R. et al. Circulation in the gippsland giant earthworm Megascolides australis // Physiological Zoology, 1994, Т. 67, № 6. - P. 1383-1401.
14. Edwards C.A. The importance of earthworms as key representatives of the soil fauna // Earthworm ecology, 2004, Т. 2. -P. 3-11.
15. McInturf S.M., Bekkedal M.Y.V., Wilfong E., Arfsten D., Chapman G., Gunasekar P.G. The potential reproductive, neurobehavioral and systemic effects of soluble sodium tungstate exposure in Sprague-Dawley rats // Toxicol. Appl. Pharmacol., 2011, Vol. 254, № 2. - P. 133-137.
16. Wen-jie L. Characterization of Heavy Metals Contamination and Physicochemical Properties of Soils in Lianhuashan Tungsten Mine Area of Guangdong Province // Chinese Journal of Soil Science, 2014, Vol. 1. - P. 1040.
17. Scott-Fordsmand J.J. et al. The toxicity testing of double-walled nanotubes-contaminated food to Eisenia veneta earthworms // Ecotoxicology and Environmental Safety, 2008, Т. 71, № 3. - P. 616-619.
18. Deryabin D., Aleshina E. Development of the novel luminescent screening assay for nanocarbon biotoxicity detection // Luminescence, 2010, Vol. 25, № 2. - P. 122.
19. Dalby P.R., Baker G.H., Smith S.E. «Filter paper method» to remove soil from earthworm intestines and to standardize the water content of earthworm tissue // Soil Biology and Biochemistry, 1996, Т. 28, № 4-5. - P. 685-687.
20. Методы почвенной микробиологии и биохимии: учебное пособие / под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: Изд-во МГУ, 1991. - 304 с.
21. Thongkumkoon P., Sangwijit K., Chaiwong C., Thongtem S., Singjai P., Yu L. D. Direct nanomaterial-DNA contact effects on DNA and mutation induction // Toxicol. Lett., 2014, Vol. 226, № 1. - Р. 90-97.
22. Hasegawa G., Shimonaka M., Ishihara Y. Differential genotoxicity of chemical properties and particle size of rare metal and metal oxide nanoparticles // J. Appl. Toxicol., 2012, Vol. 32, № 1. - Р. 72-80.
23. Allard P., Darnajoux R., Phalyvong K., Bellenger J. P. Effects of tungsten and titanium oxide nanoparticles on the di-azotrophic growth and metals acquisition by Azotobacter vinelandii under molybdenum limiting condition // Environ. Sci. Technol., 2013, Vol. 47, № 4. - Р. 2061-2068.
24. Vargas-Reus M. A., Memarzadeh K., Huang J., Ren G. G., Allaker R. P. Antimicrobial activity of nanoparticulate metal oxides against peri-implantitis pathogens // Int. J. Antimicrob. Agents, 2012, Vol. 40, № 2. - Р. 135-139.
25. Syed M.A., Manzoor U., Shah I., Bukhari S. H. Antibacterial effects of Tungsten nanoparticles on the Escherichia coli strains isolated from catheterized urinary tract infection (UTI) cases and Staphylococcus aureus // New Microbiol., 2010, Vol. 33, № 4. - Р. 329-335.
26. Leung Y.H., Ng A.M.C., Xu X., Shen Z., Gethings L.A., Wong M.T., Chan C.M.N., Guo M.Y., Ng Y.H., DjuriSic A.B., Lee P.K.H., Chan W.K., Yu L.H., Phillips D.L., Ma A.P.Y. Leung F.C. Mechanisms of Antibacterial Activity of MgO: Non ROS Mediated Toxicity of MgO Nanoparticles Towards Escherichia coli // Small, 2014, Vol. 10, № 6. - Р. 1171-1183.
27. von Moos N., Slaveykova V.I. Oxidative stress induced by inorganic nanoparticles in bacteria and aquatic microalgae-state of the art and knowledge gaps // Nanotoxicol., 2014, Vol. 8, № 6. - Р. 605-630.
28. Ghosh S., Mashayekhi H., Pan B., Bhowmik P., Xing B. Colloidal behavior of aluminum oxide nanoparticles as affected by pH and natural organic matter // Langmuir., 2008, Vol. 24, № 21. - Р. 12385-12391.
29. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. Молекулярно-клеточные механизмы инактивации свободных радикалов в биологических системах // Успехи современного естествознания, 2006, № 7. - С. 29-36.
30 Tourinho P.S., Van Gestel C.A., Lofts S., Svendsen C., Soares A.M., Loureiro S. Metal-based nanoparticles in soil: Fate, behavior, and effects on soil invertebrates // Environ. Toxicol. Chem., 2012, Vol. 31, № 8. - P. 1679-1692.
31. Gruber C., Sturzenbaum S., Gehrig P., Sack R., Hunziker P., Berger B., Dallinger R. Isolation and characterization of a self-sufficient one-domain protein. (Cd)-metal-lothionein from Eisenia foetida // Eur. J. Biochem., 2000, № 267. - Р. 573-582.
32. Li M., Liu Z., Xu Y., Cui Y., Li D., Kong Z. Comparative effects of Cd and Pb on biochemical response and DNA damage in the earthworm Eisenia fetida (Annelida, Oligochaeta) // Chemosphere, 2009, Vol. 74, № 5. - Р. 621-625.
33. Vandecasteele B., Samyn J., Quataert P., Muys B., Tack F. M. G. Earthworm biomass as additional information for risk assessment of heavy metal biomagnification: a case study for dredged sediment-derived soils and polluted floodplain soils // Environ. Pollut., 2004, № 129. - Р. 363-375.
34. Бызов Б.А., Нечитайло Т.Ю., Бумажкин Б.К., Кураков А.В., Голышин П.Н., Звягинцев Д.Г. Культивируемые микроорганизмы из пищеварительного тракта дождевых червей // Микробиология, 2009, т. 78, № 3. - С. 404-413.
35 Li H., Chen Q., Zhao J., Urmila K. Enhancing the antimicrobial activity of natural extraction using the synthetic ultrasmall metal nanoparticles // Sci. Rep., 2015, Vol. 5. - P. 11033.
36 Xiong L., Tong Z.H., Chen J.J., Li L.L., Yu H.Q. Morphology-dependent antimicrobial activity of Cu/CuxO nanoparticles // Ecotoxicol., 2015, Vol. 24, № 10. - P. 2067-2072.
ИНФОРМАЦИОННОЕ СООБЩЕНИЕ
17 января 2019 г. в 15:00 в здании администрации городского округа Серебряные Пруды: 142970, Московская обл., р.п. Серебряные Пруды, ул. Первомайская, д. 11 состоятся общественные обсуждения (в форме слушаний), с гражданами и общественными организациями объектов Государственной экологической экспертизы - материалов проектно-технической документации (ПТД), включая ТЗ и проектов материалов ОВОС на агрохимикаты: Удобрение азотное жидкое марки: 23:3, 26:2, 29:1, регистрант ПАО «КуйбышевАзот»; Удобрение азотно-фосфорно-калийное марки: А, Б, регистрант АО «ОХК «УРАЛХИМ».
Общественные обсуждения (в форме слушаний) материалов ПТД указанных агрохимикатов проводятся с целью прохождения в течение четырех месяцев Государственной экологической экспертизы и последующей Государственной регистрации агрохимикатов, которые будут использоваться на всей территории Российской Федерации.
Объекты ГЭЭ материалов ПТД агрохимикатов рекомендуются к применению на территории России. Материалы ПТД объектов Государственной экологической экспертизы агрохимикатов представляет «ООО НПО Агрохимсоюз»: г. Москва, ул. Большая Академическая, д. 44, корп. 2. Копии материалов ПТД объектов Государственной экологической экспертизы на агрохимикаты доступны для рассмотрения с 17 декабря 2018 г. по 18 февраля 2019 г. с 10:00 до 15:00 в ООО «Сельхозхимия», 142970, р.п. Серебряные Пруды, ул. Мичурина, д. 1. Тел.: 8 496 673 14 45. Письменные предложения направлять в ООО «Сельхозхимия». Приглашаются все желающие. При себе иметь паспорт. Проведение общественных обсуждений обеспечивает вышеуказанная организация совместно с Администрацией городского округа Серебряные Пруды Московской области.
