CC BY
56
МИКРОБИОЛОГИЯ
>>,!;? sv’■ ' ' vs •v■b '■&■': ■'"■ •<:'■-■. ,<4^;
• i-{ ' ■••• •-.* • • *4~ i > • ••’- 'S ь *ц^.ч v**X 4- vS* м ** л .
% vVf Ч'к-чг ,.v,-A4-rj 4 . *Л:
УДК576.851.48:615.277.3].001.6(045)
ВЛИЯНИЕ ДОКСОРУБИЦИНА НА АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК
О.Г. Шаповал - ГОУ ВПО Саратовский ГМУ Росздрава, аспирант кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии. E-mail: meduniv@sgmu.ru
Изучено влияние противоопухолевого препарата доксорубицина и антибиотика из группы аминогликозидов -амикацина на адгезивную активность Escherichia coli.
Методом двукратных серийных разведений в мясо-пептонном бульоне определена антимикробная активность (МИК - минимальная ингибирующая концентрация) обоих препаратов в отношении опытных штаммов. Изучено изменение чувствительности E. coli камикацину в присутствии S и] МИК доксорубицина. После 10 пассажей в мясо-пептонном бульоне при постоянной и возрастающей концентрациях амикацина в присутствии Sиj МИК доксорубицина определена адгезивная активность исходных и пассажных вариантов по способности адсорбироваться на эритроцитах человека I группы, Rh (+).
Установлено, что опытные штаммы чувствительны камикацину (МИК 1,5-6,2 мкг/мл) и не чувствительны к доксорубицину (МИК 1000 мкг/мл). Субингибирующие концентрации этого цитостатика (Sи j МИК) повышали чувствительность опытных штаммов камикацину и разнонаправленно влияли на адгезивную активность пассажных вариантов.
Ключевые слова: адгезивная активность, амикацин, доксорубицин, Escherichia coli.
INFLUENCE OF DOXORUBICIN ON ADHESIVE PROPERTIES OF E.COLI
O.G. Shapoval - Saratov State Medical University, Department Microbiology, Virology and Immunology, Post-graduate. Email: meduniv@sgmu.ru
Influence of antineoplastic drug doxorubicin and amikacin, the aminoglycoside family on adhesive activity of Escherichia coli was studied. Antimicrobial activity (minimum inhibitory concentration-MIC) of both drugs against experimental strains using serial two-fold dilution method was determined. Susceptibility of E.coli to amikacin in the presence of Sand j MIC doxorubicin was studied. After 10 passages in beef-extract broth with constant and increasing doxorubicin concentrations in the presence of Sand j MIC doxorubicin, the adhesive activity of initial and passage variants according to theirability to absorb human erythrocytes I(0) Rh+ was determined. Itwas observed that experimental strains were susceptible to amikacin (MIC 1,5-6,2 mkg/ml) butwere resistantto doxorubicin (MIC 1000 mkg/ml). Subinhibitory concentrations of this cytostatic (S and j MIC) raised the sensitivity of experimental strains to amikacin and differently effected on adhesive activity of passage variants of E.coli.
Key words: adhesive activity, amikacin, doxorubicin, Escherichia coli.
Онкологические больные входят в группу высокого риска по развитию инфекционных осложнений. Это обусловлено иммуносупрессивным воздействием химиотерапевтического и лучевого методов лечения, а также тканью самой опухоли.
Этиологическая структура инфекций в онкологии представлена различными микроорганизмами [5,9]. Среди грамположительных бактерий ведущими патогенами являются микроорганизмы из семейств Staphylococcaceae (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis), Streptococcaceae и Enterococcaceae, среди грамотрицательных бактерий
- представители семейства Ег^егоЬа^епасеае и группа «неферментирующих» бактерий, включающая различные семейства микроорганизмов, получивших характерное название в связи с отсутствием процесса брожения при утилизации углеводов [4].
Если среди возбудителей инфекций кровотока и хирургических ран лидерство сохраняется за грампо-ложительными бактериями, то грамотрицательные бактерии часто вызывают уроинфекции и инфекции респираторного тракта [5,9].
Подавляющее большинство и грамположительных, и грамотрицательных возбудителей инфекции у он-
кологических больных относятся к условно патогенным. Развитие инфекции является следствием реализации потенциальных патогенных свойств этих возбудителей. Известно, что взаимодействие микроба-возбудителя с клетками макроорганизма начинается с адгезии. В связи с этим одними из основных факторов вирулентности грамотрицательных бактерий являются адгезины - структуры, участвующие в прикреплении возбудителя к ткани с последующим развитием колонизации и инвазии. Для грамотрицательных бактерий характерны так называемые фимбри-альные адгезины (специальные белковые нитевидные выросты клеточной стенки - ворсинки), обеспечивающие более эффективную адгезию, чем афим-бриальные адгезины грамположительных бактерий [8]. Процесс специфической адгезии как результат лиганд-рецепторного взаимодействия обеспечивает целый каскад клеточных реакций как со стороны самого микроба, так и со стороны клетки макроорганизма. Нарушение процессов адгезии существенно снижает патогенный потенциал возбудителя.
Возникновение инфекции у онкологических больных на фоне проведения противоопухолевой химиотерапии требует своевременного назначения антимикробных химиопрепаратов. Поскольку представители семейства Enterobacteriaceae, в том числе E.coli, являются одними из основных возбудителей инфекций в онкологии, представляет интерес изучение влияния противоопухолевых и антимикробных препаратов на вирулентность данного вида микроорганизмов, в частности адгезивную активность.
Материалы и методы. Изучено сочетанное влияние противоопухолевого препарата доксорубицина из группы антрациклинов, широко применяемых при химиотерапии опухолей, и антибиотика из группы аминогликозидов - амикацина, эффективного при инфекциях, вызванных грамотри-цательной флорой, на адгезивные свойства кишечных палочек. В опыт было взято 5 штаммов: стандартный - E. coli ATCC 25922 и четыре клинических, выделенные из гнойного отделяемого послеоперационных ран.
В предварительных экспериментах методом двукратных серийных разведений в мясо-пептонном бульоне при концентрации доксорубицина и амикацина от 1000 до
0,37 мкг/мл был установлен уровень антимикробной активности взятых в опыт препаратов - ми -нимальная ингибирующая концентрация (МИК) [7]. Микробная нагрузка составляла 200 тыс. м. т. / мл по стандарту мутности ГИСК им. Т. А. Тарасевича. Контролем служил мясо-пептонный бульон без препарата. Результаты учитывали по наличию или отсутствию видимого роста после инкубации посевов в термостате при t 370С в течение 24 часов. Тем же методом был установлен уровень антимикробной активности амикацина в присутствии субингибирующих концентраций (S и j МИК) доксорубицина. Для изучения развития устойчивости к амикацину и влияния на этот процесс доксорубицина опытные штаммы пассировали в мясо-пептонном бульоне при постоянной и возрастающей концентрации амикацина в присутствии S и] МИК доксорубицина. В этих экспериментах микробная нагрузка составляла 200 тыс. м. т. / мл по стандарту мутности ГИСК им. Т. А. Тарасевича. Всего было проведено 10 пассажей.
У исходных и пассажных вариантов определяли адгезивную активность по их способности адсорбироваться на поверхности эритроцитов человека О (I) группы, ЯИ (+) [1, 6]. Для этого свежие эритроциты дважды отмывали физиологическим раствором хлорида натрия при 300 об./мин в течение 15 минут. Из отмытых эритроцитов в физиологическом растворе готовили взвесь концентрацией 100 млн клеток / мл. Приготовленную эритро-цитную взвесь по 0,1 мл добавляли к 1 мл суточной бульонной культуры изучаемых штаммов, содержащей 3Ч108 м. т. После инкубации смеси втер-мостате при t 370С в течение 30 минут из нее готовили мазки способом «толстая капля», которые высушивали при t 370С, фиксировали в этаноле 15 минут, окрашивали водным фуксином в течение 5 минут и просматривали с использованием масляного иммерсионного объектива (Ч90) микроскопа «Биолам». В каждом мазке подсчитывали количество эритроцитов, участвовавших в адгезии, количество микроорганизмов, адсорбировавшихся на одном эритроците (оценивали по 5 эритроцитов в 5 полях зрения). Из полученных данных рассчитывали средний показатель адгезии (СПА).
Микроорганизмы при СПА 1,01-2,0 считали низкоадгезивными, 2,01-4,0-среднеадгезивными, более 4,0 - высокоадгезивными. Статистическую обработку проводили согласно методике оценки существенности различий между найденными в опыте величинами [2].
Результаты. Все взятые в опыт штаммы Е. соН по значению МИК были высоко чувствительны к амикацину. МИК для штамма Е. соИ АТСС 25922 составила 1,5 мкг/мл, для четырех клинических с лабораторным шифром № 23, № 607, № 733 и № 822 - 6, 2 мкг/мл.
В присутствии] МИК доксорубицина чувствительность к амикацину изменилась лишь у двух взятых в опыт клинических штаммов. Для штамма № 23 она повысилась в 2 раза (МИК 6,2 и 3,1 мкг/мл соответственно), а для штамма № 822 - в 8 раз (МИК 6,2 и
0,75 мкг/мл).
В присутствии S МИК доксорубицина изменения чувствительности отмечены у клинических штаммов Е. соИ. У штаммов № 23 и № 607 они были невелики (в 2 раза), а у штаммов № 733 и № 822 достаточно выражены (в 8-16 раз). Чувствительность стандартного штамма Е. соИ АТСС 25922 не изменялась в присутствии как], так и S МИК доксорубицина (табл. 1).
Как указывалось выше, у исходных и пассажных вариантов изучавшихся штаммов определяли адгезивную активность. Полученные результаты приведены в табл. 2. Из нее видно, что согласно значениям СПА исходно высокой адгезивной активностью обладал штамм № 607 (СПА 5,0), остальные штаммы имели среднюю адгезивную активность (СПА штамма Е. соИ АТСС 25922 3,52, № 23 - 3,32, № 733 - 2,56, № 822 - 2,28). Контрольные варианты трех клинических штаммов существенно отличались от исходных по значению СПА: для штамма № 23 он снизился до 1,72, для штамма № 607 - до 3,52, для штамма № 822 - до 1,84, однако последнее снижение статистически недостоверно. Для штамма № 733 величина СПА повысиласьдо 3,48. Таким образом, пассажи штаммов Е. соИ на питательной среде ведут к изменению их адгезивной активности чаще в сторону снижения.
Это свидетельствует о нестабильности данного признака.
При пассажах с возрастающей концентрацией амикацина адгезивная активность по сравнению с контролем достоверно возросла у трех штаммов: Е. соН АТСС 25922 (СПА 4,72), № 23 (СПА 4,16) и № 822 (СПА 3,16). Для двух штаммов - № 607 и № 733 указанный показатель остался без существенных изменений. Для упомянутых выше трех штаммов та же закономерность отмечена и при пассажах с постоянной концентрацией амикацина. У двух других штаммов отмеченные различия в величине СПА недостоверны.
Пассажи при возрастающей концентрации амикацина в присутствии S МИК доксорубицина у всех опытных штаммов не повлияли на адгезивную активность по сравнению с вариантами, пассированными в этих условиях без цитостатика. Имеющиеся различия несущественны. В то же время при пассажах с возрастающей концентрацией амикацина в присутствии] МИК доксорубицина по сравнению с вариантами, пассированными на среде только с амикацином, у двух штаммов - Е. соН АТСС 25922 и № 607 величина СПА снизилась с 4,72 до 3,52 и с 3,96 до 2,48 соответственно.
При пассажах с постоянной концентрацией амикацина в присутствии S МИК доксорубицина величина СПА стандартного штамма Е. соН АТСС 25922 снизилась с 5,52 до 4,44, а у штамма № 822 произошло ее повышение с 2,8 до 5,68. У трех штаммов № 23, № 607 и № 733 СПА существенно не изменился. Пассажи на средах с постоянной концентрацией амикацина в присутствии] МИК доксорубицина привели к повышению адгезивной активности штаммов № 23, № 607 и № 822 до значений СПА 4,12, 4,76 и 3,84 соответственно при величине этих показателей у вариантов, полученных при пассажах с постоянной концентрацией 3,04, 3,24 и 2,8 соответственно .
Таким образом, в этих экспериментах показана нестабильность признака адгезии у Е. соН. Доксору-бицин в дозах S и] МИК оказывает разнонаправленное действие на экспрессию генов, ответственных за этот признак.
Высокий уровень антимикробной активности амикацина (МИК от 1,5 до 6,2 мкг/мл) в отношении опытных штаммов Е. соН был ожидаем. Именно этим обосновывается высокая эффективность применения новых аминогликозидов в лечении инфекций, вызванных грамотрицательной микрофлорой.
Отсутствие антимикробной активности доксорубицина в отношении опытных штаммов Е. соН было несколько неожиданно. Очевидно, это обусловлено его плохим проникновением внутрь микробных клеток. Наличие большого количества липидов в клеточной стенке грамотрицательных бактерий способствует быстрому связыванию препарата ввиду его высокой биодоступности. Это ведет к его депонированию в периплазматическом пространстве микробной клетки без проникновения в достаточном количестве в цитоплазму. Однако нами установлен синергидный эффект сочетанного действия амикацина и доксорубицина во взятых концентрациях в отношении опытных штаммов Е. соН, поэтому отмеченные изменения адгезивной активности штаммов Е. соН в присутствии S и] МИК доксорубицина при пассажах как с возрастающей, так и с постоянной концентрациями антибиотика могут быть обусловлены проникновением части противоопухолевого препарата через клеточную стенку в микробную клетку вместе с амикацином, играющим роль «проводника». Итогом этого может быть ДНК-тропное действие доксорубицина, в том числе и на структуры, входящие в «острова патогенности», ответственные за синтез адгезинов, и, как следствие, изме-нение синтеза соответствующих белков. Отсутствие общих закономерностей влияния доксорубицина на этот процесс (усиление или ослабление адгезивной активности) обусловлено, очевидно, индивидуальными особенностями каждого опытного штамма и нестабильностью соответствующих генов. Это подтверждают и литературные данные о противоречивом влиянии ДНК-тропных соединений на генетический аппарат бактерий, в том числе и реализацию генетической информации патогенных локусов [3].
Выводы:
1. Доксорубицин обладает низкой антимикробной активностью в отношении Е. соН.
2. Доксорубицин в субингибирующих концентрациях ^ и j МИК) вызывает повышение чувствительности Е. соН к амикацину. Это позволит умеренно снижать дозы антибиотика при лечении инфекций, вызванных данным видом микроорганизмов, у онкологических больных, получающих химиотерапию препаратами антрациклинового ряда.
3. Доксорубицин в субингибирующих концентрациях ^ и] МИК) оказывает разнонаправленное влияние на адгезивные свойства Е. соН. Это может способствовать формированию штаммов с измененной вирулентностью, что следует учитывать в клинической практике
Таблица 1
Сочетанное действие амикацина и доксорубицина на опытные штаммы E. coli
Штамм МИК амикацина, мкг/мл МИК амикацина (мкг/мл) в присутствии доксорубицина
% МИК % МИК
E. coli АТСС 25922 1,5 1,5 1,5
E. coli № 23 6,2 3,1 3,1
E. coli № 607 6,2 3,1 6,2
E. coli № 733 6,2 0,75 6,2
E. coli № 822 6,2 0,37 0,75
Таблица 2
Значения СПА пассажных вариантов кишечных палочек
Условия пассажа СПА после пассажей
E. coli ATCC 25922 № 23 № 607 № 733 № 822
Исх 3,52 3,32 5,0 2,56 2,28
К 3,32 1,72x 3,52x 3,48x 1,84
Амп 5,52xx 3,04xx 3,24 3,2 2,8xx
Амв 4,72xx 4,16xx 3,96 3,36 3,16xx
Амп+Д1/2 4,44 3,56 3,8 2,92 5,68xxx
Амп+Д1/4 4,12xxx 4,12xxx 4,76xxx 3,72 3,84xxx
Амв+Д1/2 4,4 4,52 3,24 3,4 3,76
Амв+Д1/4 3,52xxx 4,96 2,48xxx 3,52 3,6
Д1/2 3,64 4,76xx 4,28 2,92 2,56
Примечание. Амп - постоянная концентрация амикацина; Амв - возрастающая концентрация амикацина; Д1/2 -доксорубицин в концентрации S МИК; Д1/4 - доксорубицин в концентрации j. МИК, К - контроль (пересевы на среде без амикацина и доксорубицина); х- различия контрольного и исходного варианта существенны, “- различия группы и контроля существенны, ххх- различия группы и вариантов Амп и Амв существенны.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Адгезивные свойства лактобактерий и эшерихий в различных отделах желудочно-кишечного тракта человека в норме и патологии / Е.А.Богданова, Ю.В. Несвижский, А.А. Воробьев, М.В. Брюхова // Вестник РАМН. - 2006. -№1. - С. 35-38.
2. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев.
- Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.
3. Воропаева, С .Д. Изучение внехромосомных факторов лекарственной устойчивости у клинических штаммов стафилококков / С.Д. Воропаева // Антибиотики. - 1972. -№ 2. - С. 128-132.
4. Зубков, М.Н. Неферментирующие бактерии: классификация, общая характеристика, роль в патологии человека. Идентификация Pseudomonas spp. и сходных микроорганизмов / М.Н. Зубков // Инфекции и антимикробная химиотерапия. - 2003. - №1. - С. 24-30.
5. Меропенем в лечении тяжелых инфекций у онкологических больных / Н.В. Дмитриева, И.Н. Петухова, Н.С. Багирова и др.// Сопроводительная терапия в онкологии.
- 2005. - №4. - С. 8-13.
6. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т. А. Брилене, Х.П. Ленцнер, А.А. Ленцнер // Лабораторное дело. - 1986. - №4. - С.210-212.
7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам // МУК 4.2.1890 - 04. М.: Изд. отдел Федерального центра Госсанэпиднадзора Минздрава РФ, 2004.- 91 с.
8. Сидоренко, С.В. Инфекционный процесс как «диалог» между хозяином и паразитом / С.В. Сидоренко // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.
- 2001. - №4. - С. 301-315.
9. Таксономическая структура возбудителей инфекции в онкологической клинике / Н. В. Дмитриева, А. З. Смо-лянская, И. Н. Петухова и др.// Современная онкология. -2001. - №3. - С. 93-96.
<x=CC€J##rЗЗЭОО
