CC BY
22
УДК 616.981.452:612.112
Т.П.Шмелькова, А.Л.Кравцов, Т.Н.Щуковская, М.Н.Ляпин, Т.А.Костюкова, Т.А.Малюкова, Е.М.Г оловко, Н.А.Видяева, Н.П.Коннов
ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЧУМНОГО МИКРОБА НА РАЗВИТИЕ АПОПТОЗА ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В СИСТЕМЕ IN VITRO
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Впервые оценку апоптоза лейкоцитов под воздействием чумного микроба проводили in vitro непосредственно в цельной (дефибринированной) крови человека с использованием в качестве объекта сравнения клеток золотистого стафилококка. Проточно-цитометрический анализ содержания гиподиплоидных (апоптозных) клеток в микрообъемах цельной крови позволил исследовать динамику гибели лейкоцитов при моделировании бактериемии. Цитотоксический эффект чумных микробов на лейкоциты крови человека зависел от вирулентности штамма, исходной микробной концентрации и условий выращивания бактериальной культуры. Полученные в работе экспериментальные данные свидетельствуют о возможности создания теста для дифференцирования in vitro штаммов возбудителя чумы с различной степенью вирулентности и эпидемической значимости.
Ключевые слова: Y. pestis, лейкоциты крови, апоптоз.
Апоптоз играет чрезвычайно важную роль в регуляции инфекционного процесса, и механизмы, используемые патогенными бактериями для «управления» гибелью клеток организма хозяина, являются в настоящее время объектом интенсивного изучения [2]. В связи с этим при различных инфекциях приобретает актуальность и практическую значимость проблема оценки апоптоза клеток иммунной системы [3, 4], которая в клинических условиях наиболее эффективно решается в последние годы за счет использования метода проточной ци-тофлуориметрии [1, 3, 5 ].
Экспериментальные данные, свидетельствующие об оригинальности механизмов индукции апоп-тоза клеток иммунной системы хозяина патогенными иерсиниями, получены, в основном, на моделях возбудителей псевдотуберкулеза грызунов и кишечного иерсиниоза с использованием культур макрофагов лабораторных животных и предварительно выделенных из крови лимфоцитов [10]. Взаимодействие клеток У. рв8й8 с лейкоцитами крови человека с этих позиций фактически не изучено, несмотря на то, что в основе оценки уровня интоксикации (аутоинтоксикации) организма пациентов при острых бактериальных инфекциях лежит определение индекса дегенерации лейкоцитов - доли лейкоцитов (в %), имеющих дегенеративные изменения (дегрануляция ней-трофилов, пикноз и лизис ядер лейкоцитов и др.), являющиеся морфологическими признаками апопто-за [8]. Индексы дегенерации нейтрофилов периферической крови, превышающие 50 %, свидетельствуют, как известно, о высокой вероятности неблагоприятного исхода заболевания, что используется в клинических условиях для прогнозирования исхода инфекционного процесса [1, 4].
Принимая во внимание модуляцию вирулентности и реактогенности живых культур чумного микроба при изменении условий их выращивания [11], целью настоящей работы явилось изучение характера развития апоптоза лейкоцитов крови человека под воздействием чумных микробов с раз-
личными биологическими свойствами посредством метода проточной цитофлуориметрии.
Материалы и методы
В работе использовали высоковирулентный для лабораторных животных штамм Yersinia pestis 231 (Pgm+, pFra+, pCad+, pPst+), его изогенный авиру-лентный вариант КМ 260 (12) (Pgm+, pFra-, pCad-, pPst), а также вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ (Pgm-, pFra+, pCad+, pPst+). Выращивание культур исследуемых штаммов проводили на агаре Хоттингера (рН 7,2) в течение 48 ч при 28 °С. Кроме того, использовали клетки вакцинного штамма EV НИИЭГ, которые получали путем высева исходной агаровой культуры, выращенной при 28 °С, на бульон Хоттингера в концентрации Ы07 м.к./мл и культивирования 18 ч при 37 °С в условиях аэрации, что, по мнению ряда исследователей, приводит к изменению биологических свойств штамма [11]. В качестве объекта сравнения в опытах с возбудителем чумы использовали штамм Staphylococcus а^вш 209 Р, клетки которого выращивали на агаре Хоттингера при 37 °С в течение 24 ч [6]. Бактериальные взвеси различной концентрации готовили по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича на забу-ференном физиологическом растворе, рН 7,4 (ЗФР).
Изменение биологических свойств клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при 37 °С (появление капсулы, синтез повышенного количества мембранных белков), подтверждали данными электронной микроскопии (метод негативного контрастирования), электрофореза фракции общих мембран и цитоплазмы цельноклеточных лизатов в PAAG с 0,1 % SDS по методу Laemmly [13], а также путем микробиологической оценки интенсивности размножения в крови [6] чумных микробов с различными биологическими свойствами [11].
Кровь получали из локтевой вены здоровых не иммунизированных против чумы доноров в количестве 15-20 мл и дефибринировали посредством встряхивания со стеклянными бусами (8-10 шт.) в
течение 15 мин во флаконе емкостью 100 мл. Бактерии добавляли в цельную дефибринированную кровь в количестве 5-10 или 5-10 на 1 мл, что при нормальной концентрации лейкоцитов в крови человека (5-106 в 1 мл) соответствовало микробным нагрузкам около 100 м.к./лейкоцит или 1 м.к./100 лейкоцитов. Образцы крови одного и того же донора, содержащие клетки чумного микроба с различными свойствами, либо клетки золотистого стафилококка, раздельно инкубировали в одинаковых условиях - в течение 48 ч при 37 °С.
Лейкоциты выделяли из 100 мкл крови ранее разработанным нами экспресс-методом: путем быстрого лизиса эритроцитов в деионизованной воде с последующим восстановлением осмотического баланса концентрированным раствором NaCl в ЗФР и осаждением суммарной популяции лейкоцитов центрифугированием [12]. Для быстрого определения относительного содержания в крови лимфоцитов и фагоцитов использовали автоматический (цито-флуориметрический) метод дифференциального подсчета лейкоцитов [14]. После обеззараживания (фиксации) исследуемого материала 70 % этанолом (контроль образцов на специфическую стерильность проводили согласно требованиям СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности») лейкоциты окрашивали по ДНК смесью этидиум бромида и митрами-цина. Гиподиплоидные лейкоциты (в апоптозе) идентифицировали и подсчитывали (в %) методом проточной цитометрии в неоднородной лейкоцитарной популяции как клетки с пониженной интенсивностью ДНК-флуоресценции (менее 2С ДНК на клетку) [5] в различные сроки инкубации - через 1, 2, 3, 4, 5, 8, 24, 48 ч. Для автоматической сортировки лейкоцитов по относительному содержанию ДНК на клетку и построения ДНК-гистограмм применяли коммерческий проточный цитофлуориметр ICP-22 PHYWE германского производства [12].
Результаты и обсуждение
В результате проведенных исследований установлено, что лейкоциты в цельной крови человека, в отличие от выделенных из крови [1, 7], в течение 48 ч инкубации при 37 °С фактически не подвергаются in vitro спонтанному апоптозу. Длительное сохранение жизнеспособности подавляющего числа лейкоцитов в контроле (в отсутствие бактерий) позволило зарегистрировать выраженный цитотокси-ческий эффект низкой дозы клеток вирулентного штамма чумного микроба. Этот эффект через сутки инкубации инфицированной крови при 37 °С еще отсутствовал. Однако через 48 ч инкубации - в 74 % лейкоцитах регистрировали процесс деградации молекулы ДНК, что согласно современным представлениям является основным биохимическим признаком гибели эукариотической клетки [5]. Важно, что при такой низкой исходной микробной нагрузке (всего 1 м.к./100 лейкоцитов) гибель лейкоцитов в крови человека не в состоянии были вызвать как клетки двух других исследуемых штаммов чумного микроба (EV НИИЭГ и КМ 260), так и клетки золотистого стафилококка (таблица).
Из таблицы видно, что ситуация принципиаль-
Интенсивность апоптоза лейкоцитов крови человека in vitro в ответ на клетки чумного микроба с различными биологическими свойствами в сравнении с цитотоксическим эффектом золотистого стафилококка
Индуктор апоптоза Содержание микробных клеток в мл крови (до инкубации) Относительное содержание (в %) гиподиплоидных лейкоцитов (< 2С ДНК) в различные сроки инкубации крови с индуктором апоптоза при 37 °С
S ч 24 ч 4S ч
(M±m) (M±m) (M±m)
Y. pestis EV НИИЭГ 5-108 2S,3±i,4 36,6±G,9 73,4±G,2
Y. pestis КМ 260 (12) 5-108 i4,4±G,2 іЗ,^^ 23,4±1,2
Y. pestis 231 5-108 i2,G±G,i 83,5±1,3 9З, i±i,G
S. aureus 209 Р 5-108 З1,6±3,2 62,3±2,1 66,2±4,4
Y. pestis EV НИИЭГ 5-104 6,3±G,5 1G,6±G,S 9,4±i,2
Y. pestis КМ 260 (12) 5-104 6^,1 S,6±G,4 13,G±G,i
Y. pestis 231 5-104 7,4±G,2 iG^G^ 73,S±i,2
S. aureus 209 Р 5-104 6,G±G,6 9,2±i,G S,9±G,3
Спонтанный апоптоз - З^Ді 9,7±G^ 12,3±2,i
(контроль)
Примечание . n = 3.
но изменяется, когда используется высокая исходная микробная нагрузка, и все присутствующие в крови лейкоциты вступают в контакт с живыми микробными клетками. В этом случае самый интенсивный цитотоксический эффект в течение первых 8 ч инкубации оказывал in vitro золотистый стафилококк. Быстрая гибель клеток первой линии защиты, эффективно осуществляющих фагоцитоз и кил-линг в крови золотистого стафилококка (доля ней-трофилов в крови человека около 60 %) [5], предотвращала в дальнейшем гибель остальных 40 % клеток суммарной лейкоцитарной популяции - лимфоцитов [1]. В аналогичных экспериментальных условиях для чумных микробов была характерна низкая интенсивность повреждения фагоцитов (нейтрофи-лов) крови человека, более выраженная в течение первых 8 ч инкубации в опытах с вирулентным штаммом.
Интенсивный цитотоксический эффект высокой дозы живых чумных микробов, несущих плазмиду вирулентности (pCad), развивался с отсрочкой по времени (после 8 ч инкубации), причем очень быстро в ответ на высоковирулентный штамм 231 (к 24 ч инкубации) и постепенно в ответ на клетки вакцинного штамма EV НИИЭГ (к 48 ч). Бесплаз-мидный (авирулентный) штамм КМ 260 (12) оказывал наименьший повреждающий эффект на лейкоциты цельной крови человека в условиях in vitro.
В отличие от стафилококков, активирующих апоптоз лейкоцитов на начальной стадии развития инфекционного процесса, факультативные внутриклеточные паразиты (иерсинии, шигеллы, сальмонеллы, листерии и др.) способны как подавлять апоптоз для противодействия защитным факторам организма, так и активировать его [2, 7, 15], что полностью согласуется с полученными нами экспериментальными данными.
Особенность динамики гибели лейкоцитов в ответ на клетки вирулентного штамма чумного микроба возможно связана со способностью именно этого штамма вызывать необратимые патологические изменения в организме хозяина в условиях in
vivo, при которых происходит постоянное обновление погибших клеток иммунной системы в результате непрерывного поступления лейкоцитов в кровь и ткани организма из костного мозга [5]. Наши данные не противоречат современным представлениям о том, что для индукции апоптоза клеток иммунной
системы хозяина патогенными представителями рода Yersinia необходим длительный контакт устойчивых к фагоцитозу бактерий с иммунокомпе-тентными клетками [10].
Сравнительный анализ ДНК гистограмм рис. 1 свидетельствует, что причина отсрочки гибели лей-
Рис. і. Динамика индуцированного анонтоза лейкоцитов крови человека в ответ на клетки Y. pestis EV НИИЭГ (З-iG8 м.к./мл крови) с различными биологическими свойствами. *Анонтоз в ответ на клетки S. aureus 2G9 Р - положительный контроль.
На каждой из 32 ДНК гистограмм представлен результат анализа распределения лейкоцитов в 1GG мкл цельной крови человека но клеточному циклу.
По оси абсцисс - содержание ДНК на клетку в условных единицах интенсивности ДНК флуоресценции (каналах). По оси ординат - количество клеток (импульсов) на единицу измерения (канал). Основной ник представлен диплоидными клетками с содержанием ДНК 2С, которые находятся на ностмитотической (Go) и нредсинтетической (G1) стадиях клеточного цикла. Слева от диплоидного ника - лейкоциты, содержащие менее 2С ДНК на клетку
коцитов крови человека в ответ на клетки плазмид-ных штаммов чумного микроба также связана со структурными изменениями, происходящими в микробных клетках при 37 °С. Когда в кровь человека добавляли живые чумные микробы с уже измененными при 37 °С биологическими свойствами, их цитотоксический эффект в течение первых 8 ч инкубации совсем отсутствовал и развивался только в поздние сроки инкубации (к 24 ч), то есть чумные микробы, синтезируя при 37 °С капсулу и повышенное количество мембранных белков (результаты электронной микроскопии и электрофореза в данной работе не представлены), временно утрачивали свои цитотоксические свойства, а затем вновь приобретали их после контакта с лейкоцитами (в присутствии белков плазмы крови и эритроцитов). Временную утрату цитотоксических свойств чумного микроба объясняют структурной модификацией его липополисахарида (ЛПС) при 37 °С [9]. Массовую гибель (апоптоз) лейкоцитов после длительного контакта их с устойчивыми к фагоцитозу иерсиния-ми вызывают Уор-белки, кодируемые плазмидой вирулентности (рСаф и секретируемые в цитоплазму клеток иммунной системы при 37 °С [10].
На модели вакцинного штамма ЕУ НИИЭГ установлено, что чумные микробы, выращенные при 37 °С, в отличие от клеток исходной культуры, выживают и размножаются в крови человека даже при низкой исходной концентрации. Количество живых бактерий в плазме крови резко увеличивалось в ин-
Рис. 2. Динамика роста Y. pestis EV НИИЭГ в крови человека in vitro в зависимости от исходной концентрации и биологических свойств клеток микробной популяции:
А - исходная концентрация Y. pestis EV НИИЭГ 104 м.к./мл крови;
Б - исходная концентрация Y. pestis EV НИИЭГ 108 м.к./мл крови.
О - клетки Y. pestis EV, выращенные при 28 °С; □ - клетки Y. pestis EV с измененными при 37 °С биологическими свойствами
тервале времени от 24 до 48 ч инкубации (рис. 2, А). При повышении исходной микробной нагрузки фагоцитоз и киллинг бактерий, выращенных при 28 °С (в течение первых 8 ч), становился незавершенным. Спустя сутки инкубации крови при 37 °С, независимо от температуры выращивания исходной культуры (28 или 37 °С), в ней присутствовало большое количество живых микробных клеток (рис. 2, Б).
Таким образом, попадая в цельную кровь человека, чумной микроб индуцирует гибель лейкоцитов человека иначе, чем клетки золотистого стафилококка - с длительной отсрочкой по времени, характерной для генерализации инфекционного процесса и инфекционных осложнений, типичных для сепсиса [7]. Динамика гибели лейкоцитов зависит от вирулентности штамма чумного микроба для лабораторных животных, от исходной микробной нагрузки и условий выращивания бактериальной культуры, что может быть использовано для дифференцирования штаммов с различной степенью вирулентности и эпидемической значимости на модели лейкоцитов крови человека в системе in vitro. По данным проточной цитофлуориметрии для более четкого дифференцирования штаммов чумного микроба по биологическим свойствам на модели клеток крови человека результат анализа необходимо учитывать в поздние сроки инкубации (через 24 и 48 ч), а не в течение первых 8 ч контакта бактерий с клетками иммунофагоцитарной системы.
Работа выполнена при поддержке ФЦНТП «Защита от патогенов» (договор № 105-3/04 от 5 ноября 2004 г. к государственному контракту № 01.035.11.53).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бобылева Е.В. Клинико-лабораторный мониторинг за развитием повреждающего воздействия Staphylococcus aureus на лизосомальный и генетический аппараты лейкоцитов крови человека: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 2004. - 23 с. - 2. Зигангирова Н.А., Гинцбург А. Л. // ЖМЭИ. - 2004. - № 6. - С. 106-113. - 3. Ковальчук Л. В., Чередеев А.Н. // Иммунология. - 1998. - № 6. - С. 17-18. -
4. Козинец Г.И., Высоцкий В.В., Погорелов В.М. и др. Кровь и инфекция. - М.: Триада-М, 2001. - 452 с. -
5. Козинец Г. И., Погорелов В. М., Шмаров Д.А. и др. Клетки крови - современные технологии их анализа. - М.: Триада-М, 2002. - 200 с. - 6. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / Под ред. проф. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 365 с. - 7. Маянский А.Н., Маянский Н.А., Заславская М.И. и др. // Иммунология. - 1999. - № 6. -С. 11-20. - 8. Понякина И.Д., Лебедев К.А. // Медицинская иммунология. - 2002. - Т. 4, № 2. - С. 159-160. -9. Тынянова В.И., Зюзина В.П., Демидова Г.В. и др.// Биотехнология. - 2003. - № 6. - С. 10-16. - 10. Сornelis G.R. // Nature Reviews. Mol. Cell. Biol. - 2002. - Vol. 3. - P. 742752. - 11. Fukui M., Ogg J.E., Wessman G.E., Surgella M.J. // J. Bacter. - 1957.- Vol. 74, N 6. - Р. 714. - 12. Kravtsov A.L., Grebenyukova T.P., Bobyleva E.V. et al. // Proc. SPIE. - 2001. - Vol. 4241. - P. 260-267. - 13. Laemmly U.K. // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685. - 14. Melamed M.R., Adams L.R., Zimring A. et al. // Am. J. Clin. Pathol. - 1972. -Vol. 57. - P. 95-102. - 15. Weinrauch I., Zychlinsky A. // Annu. Rev. Microbiol. - 1999. - Vol. 53. - P. 155-187.
T.P.Shmelkova, A.L.Kravtsov, T.N.Shchukovskaya, M.N.Lyapin, T.A.Kostiukova, T.A.Maliukova, E.M.Golovko, N.A.Vidyaeva, N.P.Konnov
Effects of Yersinia pestis Biologic Characteristics on the Development of Human Blood Leucocytes Apoptosis in the in vitro System
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe ", Saratov
Described in the work is the first experience of assessing leucocytic apoptosis caused by the plague pathogen in vitro in the whole (defibrinated) human blood, with Staphylococcus aureus cells used for comparison. The flow-cytometric analysis of hypodiploid (apoptosis) cells in microvolumes of
whole blood made it possible to study the dynamics of leucocyte death in the case of bacteriemic model. The cytotoxic effect of Yersinia pestis upon the human blood leucocytes was defined by the strain’s virulence, the initial concentration of microbial cells, and the cultivation conditions of bacteria. The experimental evidence obtained in the work may be suggestive of a possibility that an assay could be developed to differentiate in vitro among Yersinia pestis strains characterized by varying levels of virulence and epidemic significance.
Key words: Yersinia pestis, blood leucocytes, apoptosis.
nocTynu^a 05.12.05.
