CC BY
67
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
УДК 615.276.4.03:616.98:579.842.23].015.4.076.9
Кравцов А.Л., Курылина А.Ф., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н.
МОДУЛИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ ПОЛИОКСИДОНИЯ НА РЕАКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ПРОТИВОЧУМНОГО ИММУНИТЕТА
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора России, 410005, г Саратов
Методом проточной цитометрии изучено влияние полиоксидония на реактивность клеток иммунной системы мышей BALB/c, иммунизированных различными дозами живых клеток вакцинного штамма Yersinia pestis EB НИИЭГ. Применяли суправитальную окраску лейкоцитов крови и клеток брюшной полости красителем акридиновым оранжевым для автоматического дифференцирования лимфоцитов и фагоцитов по содержанию цитоплазматических гранул, а также для идентификации и подсчета лимфоцитов с активированным ядерным хроматином. Пролифера-тивную активность клеток определяли после окраски йодистым пропидием по их суммарному количеству на стадиях S и G2 + M клеточного цикла. Результаты учитывали в динамике иммуногенеза (на 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки). Иммуномодулятор оказывал стимулирующий эффект на реактивность клеток иммунной системы, привитых против чумы лабораторных животных, повышая протективную активность чумной вакцины как минимум в 2,7 раза. Это позволяло существенно (в 5 раз) снизить антигенную нагрузку, способную защитить мышей от чумной инфекции.
Ключевые слова: живая чумная вакцина EB; пояиоксидоний; Yersinia pestis; активация хроматина и пролифе-ративная активность лимфоцитов; содержание гранул в фагоцитах; проточная цитоме-трия.
Для цитирования: Кравцов А.Л., Курылина А.Ф., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н. Модулирующий эффект полиоксидония на реактивность клеток иммунной системы при формировании противочумного иммунитета. Иммунология. 2016; 37(6): 320-325. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-320-325
Kravtsov A.L., Curylina A.F., Klyueva S.N., Shchukovskaya T.N.
THE MODULATING EFFECT OF POLYOXIDONIUM ON THE REACTIVITY OF IMMUNE CELLS IN THE FORMATION OF ANTI-PLAGUE IMMUNITY
Federal state healthcare institution «Russian research anti-plague Institute «Microbe» of Rospotrebnadzor of Russia, 410005, Saratov
By flow cytometry we studied the influence of polyoxidonium on the reactivity of the immune system cells of mice ВALB/c, immunized with different doses of live cells of the vaccine strain Yersinia pestis EV, NIIEG. Used supravital coloration of white blood cells and cells of the abdominal cavity dye acridine orange for the automatic differentiation of lymphocytes and phagocytes in content of cytoplasmic granules, as well as for identification and counting of lymphocytes with activated nuclear chromatin. The proliferative activity of cells was determined after staining iodide propidium on their total number of stages S and G2 + M cell cycle. The results were taken into account in the dynamics of immunogenesis (1st, 3rd, 7th and 21th day). Immunomodulator have had a stimulating effect on the reactivity of cells of the immune system, vaccinated against plague in laboratory animals, increasing protective activity plague vaccine at least in 2.7 times. This was significantly (5 times) to reduce the antigenic load, is able to protect mice from plague infection.
Keywords: live plague vaccine EV; polyoxidonium; Yersinia pestis; activation of chromatin and the proliferative activity of lymphocytes; content of granules in the phagocytes; flow cytometry.
For citation: Kravtsov A.L., Curylina A.F., Klyueva S.N., Shchukowskaya T.N. The modulating effect of polyoxidonium on the reactivity of immune cells in the formation of anti-plague immunity.Immunologiya.2016; 37(6): 320-325. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-320-325
For correspondence: Kravtsov Alexander L., E-mail: rusrapi@microbe.ru
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 13.06.16 Accepted 16.08.16
При разработке вакцин нового поколения против бактериальных и вирусных инфекций в последние годы все больше внимания уделяют поиску и созданию эффективных, нетоксич-
Для корреспонденции: Кравцов Александр Леонидович, E-mail: rusrapi@microbe.ru
ных адъютантов, относящихся к структурам, стимулирующим функции клеток врожденного иммунитета и повышающим интенсивность антителообразования в ответ на различные чужеродные антигены [1]. К таким иммуностимуляторам относится, в частности, синтетический полимер полиоксидоний (ПО) [2], который рекомендован как для стимуляции механизмов клеточного иммунитета у вакцинированных людей [3],
ORIGINAL ARTICLE
так и для использования в качестве иммуномодулятора при лечении пациентов с различной патологией [4].
Опубликованы экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу перспективности применения ПО в комплексе с живой чумной вакциной. В модельных опытах по иммунизации лабораторных животных препарат существенно повышал иммуногенную и протективную активность данной вакцины, ускоряя появление и исчезновение лимфоцитов с рецепторами к F1 Yersinia pestis, а также способствуя более раннему развитию антительного ответа [5, 6]. При этом отмечена недостаточная изученность иммуномодулирующего эффекта ПО при противочумной вакцинации, необходимость его дальнейшего, более детального исследования на клеточном уровне.
Цель настоящей работы — оценить с помощью использования проточной цитометрии влияние ПО на реактивность клеток иммунной системы привитых против чумы лабораторных животных.
Материал и методы
В работе использовали иммуномодулятор ПО (НПО «Пе-троваксФарм», Россия), а также штаммы Y. pestis EB НИИЭГ и 231, полученные из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб». Бактерии выращивали на агаре Хоттингера (pH 7,2) в течение 48 ч при 28 °С. Исходную взвесь клеток вакцинного штамма EB НИИЭГ с концентрацией 1 • 109 КОЕ готовили в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) и подкожно вводили инбредным мышам линии BALB/c в двух дозах — 5 • 103 и 25 • 103 КОЕ (в 0,2 мл ЗФР). ПО вводили подкожно в количестве 4 мкг на мышь за 1 ч до вакцинации.
Реактивность клеток иммунной системы оценивали в динамике иммуногенеза (на 1-е, 3-и и 21-е сутки после вакцинации) путем регистрации изменений относительного содержания лимфоцитов и фагоцитов в цельной крови и смывах клеток брюшной полости, а также путем подсчета в неоднородных клеточных популяциях активированных лимфоцитов с измененным после вакцинации состоянием ядерного хроматина. Для этого применяли цитохимический метод, основанный на суправитальной окраске ядерного хроматина и цитоплазматических гранул отдельных клеток красителем акридиновым оранжевым (АО) [7], позволяющий дифференцировать фагоциты по повышенной интенсивности красной флуоресценции их цитоплазмы [8, 9] и одновременно подсчитывать стимулированные лимфоциты с активированным ядерным хроматином, которые, появляясь в крови при формировании у лабораторных животных приобретенного противочумного иммунитета, обладают повышенной интенсивностью свечения комплексов ДНК-АО в зеленой области спектра [10, 11]. Из селезенки животных выделяли сплено-циты на 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки иммуногенеза. После фиксации спленоцитов 70% этанолом их окрашивали йодистым пропидием для получения информации о характере распределения отдельных клеток суммарной неоднородной популяции по клеточному циклу. Пролиферативную активность рассчитывали из соответствующих ДНК гистограмм (рис. 1) как суммарное относительное количество клеток, находящихся на стадиях синтеза ДНК, предмитоза и митоза [12].
Для цитометрии в потоке клеток, суправитально окрашенных красителем АО, применяли коммерческий проточный цитофлуориметр ICP22 PHYWE (Германия) с ртутной лампой в качестве источника света и с 2048-канальным амплитудным анализатором ORTHO INSTRUMENTS (Westwood, Mass, USA) модели 2102 [10, 11]. Оценку показателя проли-феративной активности спленоцитов, окрашенных йодистым пропидием, проводили на лазерном проточном цитометре CyAnTM ADP DakoCytomation (Дания).
Протективную активность используемых доз живых клеток вакцинного штамма чумного микроба и влияние на нее
иммуномодуляции оценивали по относительному количеству животных, выживших после летального заражения дозой 700 ЬБ50 вирулентного штамма 231 чумного микроба, для которого LD50 в опытах на мышах ВАЬВ/с составляла 5 м.к.
Полученные экспериментальные данные статистически обрабатывали по методу Стьюдента; достоверными считали отличия средних величин исследуемых показателей при р < 0,05.
Рис. 1. Пример сравнительной цитофлуориметрической оценки про-лиферативной активности спленоцитов.
Представлены распределения отдельных клеток по клеточному циклу (ДНК-гистограммы), характерные для интактных лабораторных животных (а), а также полученные через сутки после иммунизации мышей дозой 5 • 103 КОЕ Y. pestis EB без ПО (б) и с ПО (с). На каждой гистограмме выделены области, соответствующие пролиферирующим (R3) и апопто-тическим (R6) спленоцитам. Цифры под гистограммами — общее число зарегистрированных клеток в образцах (total), а также соответственно абсолютное (count) и относительное (процент hist) число клеток в областях R3 и R6.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 1
влияние полиоксидония (ПО) на динамику реактивности фагоцитов крови и брюшной полости привитых против чумы животных
Рис. 2. Реакция лейкоцитов крови и клеток брюшной полости мышей BALB/c на противочумную вакцинацию.
На каждой цитограмме по оси абсцисс — относительное содержание на клетку цитоплазматических гранул в условных единицах интенсивности красной флуоресценции молекул красителя АО (каналах от 0 до 32), а по оси ординат — состояние ядерного хроматина клеток иммунной системы в у. е. интенсивности зеленой флуоресценции комплексов АО-ДНК (каналах от 0 до 32). Представлен результат сравнительного анализа в норме лейкоцитов крови (А1) и клеток (лимфоцитов и резидентных макрофагов), присутствующих в смывах из брюшной полости лабораторных животных (А2). Цитограммы В1 и В2 — соответственно результаты анализа лейкоцитов крови и клеток перитонеального лаважа через сутки после иммунизации животных дозой 5 • 103 КОЕ У. pestis ЕВ. Видно, что после вакцинации в крови и брюшной полости животных в большом количестве появляются как активированные (пролиферирующие) лимфоциты с активированным хроматином, так и клетки врожденного иммунитета (фагоциты) с измененным (активированным) состоянием лизосомального аппарата.
результаты
На рис. 2 представлены цитограммы, иллюстрирующие характерные изменения по исследуемым клеточным показателям в крови и брюшной полости привитых против чумы мышей. Видно, что у мышей как у животных с агранулоцитарным типом кроветворения в крови очень мало в норме клеток врожденного иммунитета, способных аккумулировать АО (табл. 3) в первичных (бактерицидных) гранулах (в отличие от фагоцитов крови людей и морских свинок [13]). Кроме того, в крови интактных мышей фактически отсутствовали лимфоциты с функционально активированным ядерным хроматином, обладающие повышенной интенсивностью зеленой флуоресценции (А1). Такие клетки, однако, стабильно появлялись уже на ранней стадии иммуногенеза в периферической крови мышей после противочумной вакцинации (В1). В смывах из брюшной полости интактных животных имелись клетки с более высоким содержанием бактерицидных гранул (резидентные макрофаги в количестве около 20%), а также была выше доля клеток (лимфоцитов) с функционально активированным генетическим аппаратом (А2). После введения в организм живых чумных микробов клеточный состав в брюшной полости животных существенно из-
Группа животных, Сутки после Исследуемый вакцинации материал дозами: Количество фагоцитов, аккумулирующих АО в гранулах, %
5 • 103 КОЕ 25 • 103 КОЕ
Опытная 1 14,4 ± 0,4* 26,2 ± 0,6*
(вакцина + ПО), ЛК 3 10,2 ± 0,3* 23,6 ± 0,6*
21 15,4 ± 0,3* 21,4 ± 2,2*
Контрольная 1 7,4 ± 0,6 14,2 ± 0,2
(вакцина + ЗФР), ЛК 3 5,3 ± 0,5 10,2 ± 1,2
21 31,5 ± 0,3 31,2 ± 3,2
Опытная 1 52,8 ± 1,9 62,9 ± 1,1*
(вакцина + ПО), КБП 3 48,9 ± 1,2 47,6 ± 2,1
21 43,8 ± 2,4* 32,9 ± 1,3*
Контрольная (вак- 1 45,1 ± 2,9 46,9 ± 3,3
цина + ЗФР), КБП 3 48,2 ± 1,0 47,4 ± 1,8
21 33,0 ± 1,5 53,2 ± 0,4
Примечание. * — достоверные различия с контролем; ЛК —
лейкоциты крови; КБП — клетки в смывах из брюшной полости; Фагоциты учитывали на гистограммах как клетки с повышенной красной флуоресценцией цитоплазмы — более 100 у. е. (каналов) при 512 каналах для входного сигнала и напряжении 700 В на фотоумножителе.
менялся (В2): усиливались процессы метаболизма в клетках, связанные с активацией их генетического аппарата, а также возрастала доля клеток врожденного иммунитета, аккумулирующих АО в гранулах, где локализованы ключевые бактерицидные ферментные катионные белки: эластаза, ка-тепсин G, протеаза 3 и миелопероксидаза [13].
Интенсивность реакции клеток иммунофагоцитарной си-
Таблица 2
влияние полиоксидония на протективный эффект исследуемых доз клеток живой чумной вакцины и динамику реактивности ядерного хроматина клеток иммунной системы в процессе иммуногенеза
Группа животных Доля зараженных животных, выживших после вакцинации, % Исследуемый материал Сутки после вакцинации Доля клеток с активированным ядерным хроматином, %
Доза (КОЕ): 5.^ 103 25 • 103 5 • 103 25 • 103
Опытная 40 70 ЛК 1 5,5 ± 0,5 20,0 ± 0,9*
(вакцина + ПО) 3 14,0 ± 0,3* 8,6 ± 1,1
21 9,6 ± 0,6 7,9 ± 0,8*
КБП 1 25,2 ± 3,2* 64,0 ± 2,2
3 12,4 ± 1,9 19,0 ± 1,9
21 17,5 ± 0,2* 13,3 ± 0,7
Контрольная 10 30 ЛК 1 6,9 ± 0,9 7,0 ± 0,6
(вакцина + ЗФР) 3 6,8 ± 0,2 6,0 ± 0,8
21 4,6 ± 0,6 25,3 ± 1,7
КБП 1 13,9 ± 3,5 59,2 ± 1,8
3 17,9 ± 0,6 22,8 ± 1,0
21 13,7 ± 0,2 15,1 ± 0,7
ORIGINAL ARTICLE
Таблица 3
влияние полиоксидония на динамику реактивности фагоцитов и ядерного хроматина клеток иммунной системы в отсутствие вакцинации
Группа животных, исследуемый материал
Сутки после введения ПО
Доля фагоцитов, аккумулирующих в цитоплазматических гранулах АО, %
Доля клеток с активированным ядерным хроматином, %
Контрольная, ЛК — 9,1 ±1,2 6,1±0,75
Опытная (ПО в ЗФР), ЛК 1 3 13, 6 ± 0,7* 8,5 ± 0,3 8,2 ± 0,60 7,4 ± 0,52
21 10,1 ± 1,0 6,5 ± 0,13
Контрольная, КБП — 22,3± 0,6 10,9 ± 0,2
Опытная (ПО в ЗФР), КБП 1 3 21 17.0 ± 1,2* 25,7 ± 1,1 23.1 ± 1,9 11,5 ± 1,3 8,8 ± 0,4 5,2 ± 0,36*
Таблица 4
Эффект, производимый полиоксидонием на динамику проли-феративной активности спленоцитов привитых против чумы животных
Группа животных Сутки после Доля спленоцитов (в %) на стадиях 8 + G2 + М клеточного цикла в зависимости от дозы вакцины
прививки 5 • 103 КОЕ 25 • 103 КОЕ
Опытная (вакцина + ПО)
Контрольная (вакцина + ЗФР)
Контрольная без вакцинации
1 3 7 21 1 3 7 21
41,7 ± 0,3*,**
19,6 ± 0,8 30,2 ± 0,7**
36.6 ± 0,8* 31,0 ± 0,6* 24,0 ± 0,3
26.7 ± 0,4 39,7 ± 0,3 23,2 ± 2,8
24,3 ± 0,7** 33,6 ± 0,7*,**
30.1 ± 0,5* 32,6 ± 0,2 33,5 ± 0,8* 50,8 ± 0,9*
25.2 ± 0,3 24,4 ± 0,2
Примечание.* тактных животных;
— достоверные различия с показателем у ин-** — достоверный эффект ПО при вакцинации.
стемы зависела от дозы вакцины и от срока, прошедшего с момента прививки.
Регистрируемая проточным цитометром клеточная реакция усиливалась на ранней стадии иммуногенеза, если перед вакцинацией лабораторным животным вводили иммуномо-дулятор (табл. 1 и 2). Через сутки ПО вызывал снижение доли фагоцитов с высоким содержанием бактерицидных гранул в брюшной полости при соответствующем увеличении данного показателя в периферической крови (см. табл. 3). В случае, когда иммуномодулятор вводили перед вакцинацией мышей живыми клетками штамма ЕВ чумного микроба, он усиливал миграцию фагоцитов в кровяное русло на начальной стадии иммуногенеза (на 1-е и 3-и сутки) и, наоборот, ограничивал ее через 3 нед после иммунизации. В крови иммуномодулирующий эффект ПО был в большей степени выражен при низкой дозе вакцины. В смывах из брюшной полости через сутки после иммунизации доля фагоцитов повышалась вдвое, и ПО усиливал эту ответную реакцию. К 21-м суткам иммуногенеза стимулирующий эффект ПО на
клетки врожденного иммунитета сохранялся только при низкой дозе вакцины. Для повышенной дозы в этот срок был характерен обратный эффект (см. табл. 1).
При низкой дозе живой чумной вакцины ПО повышал ее протективную активность в 4 раза. Это сочеталось со способностью иммуномодулятора стимулировать функциональную активацию ядерного хроматина клеток иммунной системы в брюшной полости на 1-е и 3-и, а в крови на 3-и и 21-е сутки иммуногенеза. При повышенной иммунизирующей дозе способность ПО усиливать протективный эффект противочумной вакцинации была в меньшей степени выражена (в 2,7 раза) и на клеточном уровне достоверные стимулирующие сдвиги в состоянии ядерного хроматина лейкоцитов под влиянием иммуномодулятора были зарегистрированы в данном случае только в периферической крови (см. табл. 2).
В селезенке привитых против чумы мышей ПО при обеих исследуемых дозах вакцины стимулировал в ранние сроки иммуногенеза пролиферативную активность спленоцитов (табл. 4), в основном за счет клеток на стадии синтеза ДНК (8), как свидетельствуют ДНК-гистограммы, представленные на рис. 1.
Обсуждение
При однократной противочумной вакцинации часто формируется недостаточно напряженный и/или непродолжительный приобретенный иммунитет, что объясняют неспособностью специфических антигенов возбудителя чумы адекватно активировать на ранней стадии иммунологической перестройки клетки врожденного иммунитета организма хозяина [14]. Оценивать функциональную активность фагоцитов при бактериальных инфекциях можно различными методами, и один из них основан на использовании проточной цитоф-луориметрии для регистрации уровня аккумуляции молекул красителя АО в первичных (азурофильных) гранулах клеток врожденного иммунитета [8, 9], где локализованы нейтральные сериновые лейкоцитарные протеазы, осуществляющие киллинг патогенных бактерий и расщепление их факторов вирулентности [15—17], а также регулирующие активность цитокинов, экспрессию рецепторов на поверхности клеток иммунофагоцитарной системы и интенсивность антителоо-бразования в ответ на бактериальные антигены [18].
Ранее в опытах с системой изогенных штаммов, служащих производными вакцинного штамма ЕВ чумного микроба и различающихся от исходного штамма по плазмидному составу, антигенным свойствам и уровню протективности для лабораторных животных, мы установили, что защиту от подкожного заражения высоковирулентным штаммом чумного микроба обеспечивает вакцинация только теми штаммами, включая исходный вакцинный штамм X pestis ЕВ НИ-ИЭГ, которые имеют одновременно две плазмиды — pFra и рСа/Л. При иммунизации живыми клетками таких штаммов в их крови появлялись лимфоциты с активированным ядерным хроматином, обладающие повышенной интенсивностью зеленой флуоресценции комплексов АО—ДНК. Причем реактивность ядерного хроматина лимфоцитов на 3-и и 21-е сутки зависела от реактивности цитоплазматических гранул фагоцитов на 1-е сутки иммуногенеза [19]. Результаты, говорящие о существовании зависимости между про-тективной активностью чумной вакцины и ее способностью активировать в процессе иммуногенеза ядерный хроматин иммунокомпетентных клеток, мы также получили методом проточной цитофлуориметрии в опытах на мышах, привитых различными препаратами капсульного антигена чумного микроба [11].
Зарубежные исследователи, применив проточную цитоф-луориметрию для иммунофенотипирования иммунокомпе-тентных клеток у мышей, иммунизированных живой чумной вакциной, установили факт резкого повышения в крови и органах таких животных относительного количества активи-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
рованных CD4+ Т-лимфоцитов хелперов и цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов, а также выявили зависимость протек-тивного эффекта вакцинации от степени выраженности такой клеточной реакции [20].
Важно, что информация, полученная с помощью дорогостоящих препаратов меченых моноклональных антител (CD-маркеров), согласуется с результатами наших цитофлуориме-трических исследований, в которых относительно недорогой краситель АО позволял оценивать в процессе формирования противочумного иммунитета реактивность не только лимфоцитов, но и фагоцитов. Более того, в наших исследованиях использовали образцы цельной крови без предварительного лизиса в них эритроцитов. Это полностью исключало какие-либо клеточные потери и сдвиги в функциональном состоянии клеточных элементов, связанные с процедурами их выделения.
Изменение регистрируемых в данной работе цитофлуо-риметрических показателей в состоянии также объяснить опубликованные в отечественной печати результаты световой и люминесцентной микроскопии. Так, в работах Л.С. Назаровой и соавт. [21, 22] сообщается о значительном повышении функциональной активности тимоцитов мышей в начальные сроки иммуногенеза при чуме и о появлении в периферической крови субпопуляций Т-клеток с иными, чем у интактных животных, свойствами. Активированные Т-клетки обладали повышенной пролиферативной активностью, аккумулировали в ядрах и цитоплазме большее количество молекул красителя АО и оказывали прямое цитотокси-ческое воздействие на вирулентные чумные микробы. Кроме того, после иммунизации мышей живой чумной вакциной в брюшной полости этих животных в течение недели отмечали резкое повышение относительного количества макрофагов. Функционально активированные клетки, относящиеся к системе мононуклеарных фагоцитов, в большом количестве появлялись на ранней стадии иммуногенеза и в периферической крови. По данным А.К. Киселевой и Г.И. Васильевой [23], активированные перитонеальные макрофаги привитых против чумы лабораторных животных имели функционально измененное состояние лизосомального аппарата, которое оценивалось в мазках визуально и с помощью люминесцентного микроскопа с фотометрической насадкой по уровню аккумуляции в цитоплазматических гранулах отдельных клеток молекул красителя АО.
Заключение
Результаты настоящей работы свидетельствуют, что ПО оказывает модулирующее воздействие на реактивность клеток иммунофагоцитарной системы привитых против чумы лабораторных животных, повышая протективную активность живой чумной вакцины как минимум в 2,7 раза. Они подтверждают перспективность практического применения ПО как средства повышения эффективности противочумной вакцинации.
Основной вывод исследований заключается в том, что за счет введения ПО можно в 5 раз снизить дозу чумной вакцины без потери в уровне реактивности клеток иммунной системы и эффективности защиты организма от чумной инфекции.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
1. Петров Р.В., Хаитов Р.М. Иммуногены и вакцины нового поколения. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2011.
2. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Полиоксидоний: новые аспекты применения. Новые лекарства. 2003; 3: 27—9.
3. Костиков М.П., Ерофеева М.К., Харит С.М. Эффективность и безопасность вакцинопрофилактики гриппа у разных контин-гентов. Terra medica. 2011; (2): 7—12.
4. Пинегин Б.В., Некрасов А.В., Хаитов Р.М. Иммуномодулятор полиоксидоний: механизмы действия и аспекты клинического применения. Цитокины и воспаление. 2004; 3(3): 41—7.
5. Пономарева Т.С., Дерябин П.Н., Каральник Б.В., Тугамбаев Т.И., Атшабар Б.Б., Денисова Т.Г. и др. Влияние полиоксидония на иммуногенную и протективную активность живой чумной вакцины. Иммунология. 2014; 35(5): 286—90.
6. Каральник Б.В., Пономарева Т.С., Дерябин П.Н., Денисова Т.Г., Мельникова Н.Н., Тугамбаев Т.И. и др. Влияние иммуномодуля-ции на иммуногенную и протективную активность живой чумной вакцины. Журн. микробиол. 2014; (6): 108—12.
10. Кравцов А.Л., Наумов А.В., Коровкин С.А., Адамова Г.В., Шве-дун Г.П., Ледванов М.Ю. и др. Использование двухцветной цитофлуориметрии в потоке для быстрого обнаружения и количественной оценки изменений функциональной активности лейкоцитов в процессе иммуногенеза при чуме. В кн.: Микробиология, биохимия и специфическая профилактика карантинных инфекций. Саратов; 1990: 66—74.
11. Киреев М.Н., Кравцов А.Л., Тараненко Т.М., Храмченкова Т.А., Клюева С.Н., Гусева Н.П., Шмелькова Т.П. Сравнительная оценка методом проточной цитофлуориметрии степени активации клеток иммунофагоцитарной системы у мышей, иммунизированных различными препаратами капсульного антигена чумного микроба. Проблемы особо опасных инфекций. 2007; 94(2): 61—4.
12. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. (ред.) Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение. Челябинск; 2008.
13. Кравцов А.Л. Проточно-цитофлуориметрическое исследование бактерицидных гранул в фагоцитах крови животных с различной видовой чувствительностью к экспериментальному заражению чумой. Журн. микробиол. 2015; (1): 23—31.
19. Кравцов А.Л., Шведун Г.П., Ледванов М.Ю. О действии продуктов плазмид Y. pestis на лейкоциты крови морских свинок в процессе иммуногенеза при чуме по данным цитофлуориметрического анализа. Проблемы особо опасных инфекций. 1993; 73(3): 135—46.
21. Назарова Л.С., Исупов И.В., Суриков Н.Н., Павлова Л.П., Тараненко Т.М., Сероглазов В.В. и др. Исследование некоторых функциональных характеристик тимоцитов мышей в процессе иммуногенеза при чуме. В кн.: Профилактика особо опасных инфекций. Саратов; 1988: 13—22.
22. Назарова Л.С., Пионтковский С.А., Исупов И.В., Суриков Н.Н., Голубева И.И. Экспериментальное изучение некоторых видов клеток с литическим потенциалом на начальных этапах противочумного иммунитета. В кн.: Микробиология, биохимия и специфическая профилактика карантинных инфекций. Саратов; 1990: 90—5.
23. Киселева А.К., Васильева Г.И. Влияние иммунизации живой чумной вакциной на количество лизосом в органоспецифиче-ских макрофагах. Цитология. 1990; 32(5): 504—8.
references
1. Petrov R.V., Khaitov R.M. Immunogene and Vaccines of New Generation. Moscow: GEOTAR-Media; 2011. (in Russian)
2. Khaitov R.M., Pinegin B.V. Polioxidonium: new aspects of application. Novye lekarstva.2003; (3): 27—9. (in Russian)
3. Kostikov M.P., Erofeeva M.K., Kharit R.M. The efficiency and safety of the influenza vaccine among different contingents. Terra medica. 2011; (2): 7—12. (in Russian)
4. Pinegin B.V., Nekrasov A.V., Khaitov R.M. Immunomodulator polyoxidonium: mechanisms of action and aspects of clinical applications. Tsitokiny i vospalenie. 2004; 3(3): 41—7. (in Russian)
5. Ponomareva T.S., Deryabin P.N., Karalnik B.V., Tugambaev T.I., Atshabar B.B., Denisova T.G. et al. The impact of polioxidonium on immunogenic and protective activity of alive plague vaccine. Immunologiya. 2014; 35(5): 286—90. (in Russian)
6. Karal'nik B.V., Ponomareva T.S., Deryabin P.N., Denisova T.G., Melnikova N.N., Tugambaev T.I. The impact of immunomodulation on immunogenic and protective activity of alive plague. Zhurn. mikrobiol. 2014; (6): 108—12. (in Russian)
7. Melamed M.R., Adams L.R., Traganos F., Kamentsky L.A. Blood granulocyte staining with acridine orange changes with infections. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(7): 526—30.
8. Traganos F., Darzynkiewicz Z. Lysosomal proton pump activity: supravital cell staining with acridine orange differentiates leukocyte subpopulations. Meth. in Cell Biol. 1994; 41: 185—94.
9. Rothe G., Kellermann W., Valet G. Flow cytometric parameters of neutrophil function as early indicators of sepsis or trauma-related pulmonary or cardiovascular organ failure. J. Lab. Clin. Med. 1990; 115(1): 52—61.
10. Kravtsov A.L., Naumov A.V., Korovkin S.A., Adamova G.V., Shve-dun G.P., Ledvanov M. et al. The use of two-color flow cytometry for the rapid detection and quantification of functional leukocyte activity changes during immunogenesis in plague. In: [Mikrobiologiya, biokhimiya i spetsificheskaya profilaktika karantinnykh infektsiy]. Saratov; 1990: 66—74. (in Russian)
11. Kireev M.N., Kravtsov A.L., Taranenko T.M., Khramchenkova T.A., Klyueva S.N., Guseva N.P., Shmel'kova T.P. Comparative assessment by flow cytometry of immunophagocytic system cell activation degree in mice immunized with the different Yersinia pestis capsular antigen preparations. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2007; 94(2): 61—4. (in Russian)
12. Khaydukov S.V., Zurochka A.V. (ed.) Questions of Modern Flow Cytometry. Clinical Application. Chelyabinsk; 2008. (in Russian)
13. Kravtsov A.L. Flow cytofluorometric assay of phagocyte bactericidal granules in blood of animals with different species sensitivity to experimental plague. Zhurn. mikrobiol. 2015; (1): 23—31. (in Russian)
14. Skowera A., de Jong E., Schuitemaker J., Allen J.S., Wesselly S.C., Griffiths G. et al. Analysis of anthrax and plague biowarfare vaccine interactions with human monocyte-derived dendritic cells. J. Immunol. 2005; 175: 7235—43.
15. Houghton A.M., Hartrel W.O., Robbins C., Gomis-Rbth X.G., Shapiro S.D. Macrophage elastase kills bacteria within murine macrophages. Nature. 2009; 460: 637—41.
ORIGINAL ARTICLE
16. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann С., Fauler B., Uhltmann Y., Weiss D.S. et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 2004; 303: 1532—5.
17. Weinrauch Y., Drujan D., Shapiro S.D., Weiss J., Zychlinsky A. Neutrophil elastase targets virulence factors of enterobacteria. Nature. 2002; 417: 91—4.
18. Pham C.T. Neutrophil serine proteases fine-tune the inflammatory response. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2008; 40(6—7): 1317—33.
19. Kravtsov A.L., Shvedun G.P., Ledvanov M. About the effect of the Y. pestis plasmid products on the guinea pig blood leukocytes during immunogenesis in plague according to flow cytometric analysis. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 1993; 73(3): 135—46. (in Russian)
20. Philipovskiy A., Smiley S. Vaccination with live Yersinia pestis primes cD4 and cD8 T cells that synergistically protect against lethal pulmonary Y. pestis infection. Infect. and Immun. 2007; 75(2): 878—85.
21. Nazarova L.S., Isupov I.V., Surikov N.N., Pavlova L.P., Taranenko T.M., Seroglazov V.V. et al. A study of certain functional characteristics of mice thymocytes during plague immunogenesis. In: [Profilaktika osobo opasnykh infektsi]y. Saratov, 1988: 13—22. (in Russian)
22. Nazarova L.S., Piontkovskiy S.A., Isupov I.V., Surikov N.N., Gol-ubeva I.I. Experimental study of certain types of cells with lytic potential in the initial stages anti-immunity. In: [Mikrobiologiya, biokhimiya i spetsificheskaya profilaktika karantinnykh infektsiy]. Saratov, 1990: 90—5. (in Russian)
23. Kiseleva A.K., Vasileva G.I. Effect of immunization by live plague vaccine on the number of lysosomes in organspecific macrophages. Tsitologiya. 1990; 32(5): 504—8. (in Russian)
Поступила 13.06.16 Принята в печать 16.08.16
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 615.31:547.913.5].07
Шершакова Н.Н., Барабошкина Е.Н., Андреев С.М., Шабанова Д.Д., Смирнов В.В., Камышников О.Ю., Хаитов М.Р.
ОТСУТСТВИЕ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ У ВОДНОГО РАСТВОРА ФУЛЛЕРЕНА C60
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, г Москва
Фуллерен C60 — один из самых мощных нейтрализаторов активных форм кислорода и свободных радикалов, что связано с его высоким сродством к электрону. Именно это свойство делает его привлекательным веществом для изготовления лекарственных препаратов с целью лечения острых и хронических заболеваний. Однако вопрос его токсикологии требует детальных исследований. В частности, он связан с методами получения водных растворов C60, которые непосредственно влияют на агрегатное состояние наночастиц, их размер и химию поверхности. Недавно мы разработали новый диализный метод получения водного раствора фуллерена C60 (dnC60) без использования токсических компонентов, потенциально пригодный для биомедицинского применения. В настоящем исследовании изучены токсические эффекты dnC60 в мышиной модели в зависимости от дозы и способов его введения (внутрибрюшинный, интрагастральный и внутривенный). Показано, что dnC60 токсическим эффектом не обладает при любом способе введения. При использовании же небольших доз у мышей наблюдали более активный набор веса по сравнению с контрольной группой. Гистологический анализ не выявил каких-либо патологических изменений внутренних органов, характерных для токсического поражения.
Ключевые слова: фуллерен C60; острая токсичность; мыши.
Для цитирования: Шершакова Н.Н., Барабошкина Е.Н., Андреев С.М., Шабанова Д.Д., Смирнов В.В., Камышников О.Ю., Хаитов М.Р. Отсутствие острой токсичности у водного раствора фуллерена С. Иммунология. 2016; 37(6): 325-329. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-325-329
Shershakova N.N., Baraboshkina E.N., Andreev S.M., Shabanova D.D., Smirnov V. V., Kamishnikov O. Yu., Khaitov M.R. FULLERENE C60 AQUEOUS SOLUTION DOES NOT SHOW ACUTE TOXICITY NRC Institute of Immunology FMBA, 115478, Moscow
Для корреспонденции: Шершакова Надежда Николаевна, E-mail: nsh18.81@mail.ru
