CC BY
0
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
BRIEF MESSAGES
УДК 577.32.579
doi: 10.21685/2307-9150-2024-1-8
Влияние бензимидазола на аминокислотный состав гемолимфы имаго Drosophila melanogaster
В. В. Дружинина1, Е. С. Селезнева2, З. П. Белоусова3
1,2'3Самарский национальный исследовательский университет имени академика С. П. Королева, Самара, Россия
1valentina.alex.drug@mail.ru, 2catana7@yandex.ru, 3zbelousova@mail.ru
Аннотация. Актуальность и цели. Среда обитания все больше подвергается антропогенному прессу. Чтобы понять механизмы адаптации насекомых к широко распространенным ксенобиотикам, необходимы модельные эксперименты, позволяющие определить реакцию насекомых как к высокотоксичным дозам, так и к слаботоксичным. Целью работы явился анализ изменения пула аминокислот при действии бензимидазола, производные которого широко используются в фармакологии и сельском хозяйстве. Материалы и методы. Имаго Drosophila melanogaster дикой линии Canton-S подвергали суточному воздействию бензимидазола в концентрациях: 0,0001 мг/мл и 0,001 мг/мл и в дозе LD50. Имаго усыпляли и по 300 штук растирали в фарфоровой ступке с 2 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию наносили на бумажные диски для экспресс-тестов. Затем высушенные образцы помещали в пластиковые пробирки на 0,5 мл и заливали элюирующей жидкостью (6:4 - метанол : вода) и оставляли на сутки при комнатной температуре. Для разделения смесей аминокислот использовали пластинки ВЭТСК Sorbfil с толщиной слоя силикагеля 160 мкм. Мобильная фаза состояла из системы растворителей: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода, в соотношении 3:1:1 по объему. Камеру ТСХ заряжали 25 мл мобильной фазы за 1 час до возгонки. Для окраски использовали универсальный краситель для аминокислот -нингидриновый реагент. Хроматограмму окрашивали под тягой и высушивали, сначала при комнатной температуре, а затем помещали в сушильный шкаф на 1-2 мин для ускорения проявления и сравнивали с тестовой разгонкой аминокислот. Анализировали наличие следующих аминокислот: тирозин (ТИР), метионин (МЕТ), аланин (АЛА), глицин (ГЛИ), пролин (ПРО), цистеин (ЦИС), лизин (ЛИЗ), лейцин (ЛЕЙ), ва-лин (ВАЛ), орнитин (ОРН), гистидин (ГИС), треонин (ТРЕ), фенилаланин (ФЕН). Результаты. В контроле выявилось только 11 аминокислот, из всех проанализированных аминокислот отсутствовали ЦИС и ЛИЗ. Воздействие нетоксичной дозой бензимидазола привело к изменению спектра аминокислот в гемолимфе имаго. При воздействии дозой 0,00001 мг/мл в гемолимфе выявляются только: ГЛИ, ПРО, ВАЛ, ОРН, ФЕН, а при воздействии дозой 0,001 мг/мл выявляется только: ПРО, ВАЛ, ОРН, ФЕН, т.е. не выявляется ГЛИ. При воздействии бензотриазолом в дозе LD50 в гемолимфе исчезли аминокислоты: ВАЛ, ГИС и ТРЕ по сравнению с контролем, зато появились: ЦИС и ЛИЗ, отсутствующие в контроле и при воздействии на имаго обеими нетоксичными дозами бензимидазола. Выводы. В регуляции метаболизма имаго дрозофилы большую роль играет пул свободных аминокислот гемолимфы. Воздействие бензими-дазолом в дозе LD50 вызывает стресс у самцов имаго дрозофилы, что приводит
© Дружинина В. В., Селезнева Е. С., Белоусова З. П., 2024. Контент доступен по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 License / This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.
к появлению цис и лиз. Нетоксичные дозы также вызывают изменение состава свободных аминокислот, что позволяет организмам справиться с токсичностью. Сам адаптивный потенциал формируется в процессе эволюции в результате отбора группы генов, формирующих системы возможных успешных адаптивных ответов.
Ключевые слова: бензимидазол, свободные аминокислоты, хроматография, Drosoph-ila melanogaster
Для цитирования: Дружинина В. В., Селезнева Е. С., Белоусова З. П. Влияние бензи-мидазола на аминокислотный состав гемолимфы имаго Drosophila melanogaster // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. 2024. № 1. С. 82-88. doi: 10.21685/2307-9150-2024-1-8
The effect of benzimidazole on the amino acid composition of the hemolymph of imago Drosophila melanogaster
V.V. Druzhinina1, E.S. Selezneva2, Z.P. Belousova3
1,2,3Samara National Research University named after Academician S.P. Korolev, Samara, Russia
1valentina.alex.drug@mail.ru, 2catana7@yandex.ru, 3zbelousova@mail.ru
Abstract. Background. Habitats are increasingly subjected to anthropogenic press. In order to understand the mechanisms of insect adaptation to widespread xenobiotics, model experiments are needed to determine the response of insects to both highly toxic doses and low toxic doses. The aim of the work was to analyse changes in the amino acid pool under the action of benzimidazole, derivatives of which are widely used in pharmacology and agriculture. Materials and methods. Drosophila melanogaster imago of the wild line Canton-S were exposed daily to benzimidazole at concentrations of: 0.0001 mg/ml and 0.001 mg/ml and LD50 dose. The imago were sedated and 300 each were rubbed in a porcelain mortar with 2 ml of distilled water. The resulting suspension was applied to paper discs for rapid tests. The dried samples were then placed in 0.5 ml plastic tubes and filled with elution liquid (6:4 -methanol: water) and left for 24 hours at room temperature. Sorbfil VETSC plates with a silica gel layer thickness of 160 ^m were used for the separation of amino acid mixtures. The mobile phase consisted of the solvent system: n-butanol - glacial acetic acid - water, in a ratio of 3:1:1 by volume. The TLC chamber was charged with 25 mL of mobile phase 1 h before sublimation. Ninhydrin reagent, a universal dye for amino acids, was used for staining. The chromatogram was stained under draught and dried, first at room temperature and then, placed in a desiccator for 1-2 minutes to speed up the manifestation and compared with the test amino acid dispersion. The following amino acids were analysed: tyrosine (Tyr), methionine (Met), alanine (Ala), glycine (Gly), proline (Pro), cysteine (Cys), lysine (Lys), leucine (Leu), valine (Val), ornithine (Orn), histidine (His), threonine (Tre), phenylalanine (Phe). Results. Only 11 amino acids were detected in the control, of all the amino acids analysed, Cys and Lys were missing. Exposure to a non-toxic dose of benzimidazole resulted in a change in the amino acid spectrum in the haemolymph of imago. When exposed to a dose of 0.00001 mg/ml, only: Gly, Pro, Val, Orn, Phe are detected in haemolymph, and when exposed to a dose of 0.001 mg/ml, only: Pro, Val, Orn, Phe are detected, i.e., no Gly is detected. When exposed to benzotriazole at a dose of LD50, the amino acids Val, Hys and Tre disappeared in haemolymph compared to the control, but Cys and Lys appeared, which were absent in the control and when imago were exposed to both non-toxic doses of benzimidazole. Conclusions. The pool of free amino acids in the hemolymph plays an important role in the regulation of the metabolism of Drosophila imagoes. Exposure to benzimidazole at an LD50 dose causes stress in male Drosophila adults, resulting in the appearance of cis and lys. Non-toxic doses also cause changes in the composition of free amino acids, which allows organisms to cope with toxicity. The adaptive potential itself is formed in the process of evolution as a result of the selection of a group of genes that form systems of possible successful adaptive responses.
Keywords: Benzimidazole, free amino acids, chromatography, Drosophila melanogaster
For citation: Druzhinina V.V., Selezneva E.S., Belousova Z.P. The effect of benzimidazole on the amino acid composition of the hemolymph of imago Drosophila melanogaster. Izvestiya vysshikh uchebnykh zavedeniy. Povolzhskiy region. Estestvennye nauki = University proceedings. Volga region. Natural sciences. 2024;(1):82-88. (In Russ.). doi: 10.21685/23079150-2024-1-8
В течение многих лет происходит изучение адаптаций позвоночных животных к стрессу. Механизмы стресс-реакций у насекомых изучены гораздо хуже. Однако исследование такого рода должны проводиться, потому что среда обитания все более подвергается антропогенному прессу за счет синтезируемых ксенобиотиков.
Вне зависимости от вида ксенобиотиков дозировки их, не вызывавшие летальных эффектов, стимулировали ускорение онтогенетических процессов, повышали жизнеспособность личинок и плодовитость имаго. Сублетальные дозы приводили к векторному отбору в пользу появления генотипов, устойчивых к этим веществам. Сами механизмы таких изменений могут быть различными у разных насекомых. Так, было показано, что независимо от стрессора резко повышается транскрипционная активность генов профенолоксидазы у комнатной мухи и медоносной пчелы и антибактериальных пептидов медоносной пчелы при стрессах [1].
Причины повышения транскрипционной активности именно этой группы ферментов непонятны. Не установлено также, какие факторы выступают в роли стимулирующих транскрипционную активность. Однако известно, что некоторые аминокислоты гемолимфы насекомых влияют на активность ферментов, участвующих в метаболизме нуклеиновых кислот [2] и, следовательно, могут принимать участие в регуляции экспрессии и других генов. Поэтому необходимы модельные эксперименты, позволяющие выявить динамику комплекса свободных аминокислот гемолимфы при воздействии ге-нотоксикантов, чтобы понять механизмы как специфической, так и неспецифической адаптации у насекомых к ксенобиотикам.
Целью работы является анализ изменения комплекса аминокислот гемолимфы насекомых при действии бензимидазола, производные которого широко используются в фармакологии и сельском хозяйстве.
Материал и методы
Имаго самок и самцов Drosophila melanogaster дикой линии Canton-Sœ держали отдельно в популяционных ящиках объемом 250 мл в течение трех суток на стандартном корме. Затем на сутки туда помещали чашки Петри диаметром 2,5 см, в которых на желатиновую подложку наносили суспензию бен-зимидазола. Исследовали две абсолютно нетоксичные дозы бензимидазола -0,0001 мг/мл и 0,001 мг/мл, а также дозу LD50, которая составила для самцов имаго 13,3 мг/мл при суточном воздействии.
Живых самцов имаго усыпляли эфиром, после чего 300 экземпляров растирали в фарфоровой ступке с 2 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию наносили на специальную бумагу для экспресс-тестов, марки 11 (ТУ 13-7308001-721-85, производства Малиновской бумажной фабрики) и высушивали.
Затем бумажные диски с высушенным материалом помещали в пластиковые пробирки на 0,5 мл и заливали элюирующей жидкостью (60 % раствор метанола). Закрытые пробирки оставляли на сутки при комнатной температуре [3].
Для разделения смеси аминокислот использовали пластинки ВЭТСХ 8огЬШ с толщиной слоя силикагеля 160 мкм. Элюат наносили на пластинки с помощью капилляров при постоянном просушивании. Мобильная фаза состояла из системы растворителей: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода, в соотношении 3:1:1 по объему. Камеру ТСХ заряжали 25 мл мобильной фазы за один час до возгонки.
Для окраски использовали универсальный краситель для аминокислот -нингидриновый реагент. Для приготовления красителя 500 мг нингидрина растворяли в смеси 85 мл ацетона и 5 мл уксусной кислоты и смешивали с 1 % раствором ацетата кадмия. Хроматограмму окрашивали под тягой и высушивали, сначала при комнатной температуре, а затем помещали в сушильный шкаф на 1-2 мин для ускорения проявления. Полученную хроматограмму сравнивали с тестом разгонки аминокислот. Анализировали наличие или отсутствие следующих аминокислот: тирозин (ТИР), метионин (МЕТ), аланин (АЛА), глицин (ГЛИ), пролин (ПРО), цистеин (ЦИС), лизин (ЛИЗ), лейцин (ЛЕЙ), валин (ВАЛ), орнитин (ОРН), гистидин (ГИС), треонин (ТРЕ), фенил-аланин (ФЕН).
Результаты и обсуждение
В составе гемолимфы имаго из проанализированных нами аминокислот в контроле выявили только 11 (табл. 1).
Таблица 1
Качественный состав свободных аминокислот в гемолимфе имаго самцов Drosophila melanogaster дикой линии Сап1оп-8
Аминокислоты* Контроль Трехсуточное воздействие бензимилазолом в следующих концентрациях
0,00001 мг/мл 0,001 мг/мл LD50
ТИР + +
МЕТ + +
АЛА + +
ГЛИ + + +
ПРО + + + +
ЦИС +
ЛИЗ +
ЛЕЙ + +
ВАЛ + + +
ОРН + + + +
ГИС +
ТРЕ +
ФЕН + + + +
Примечание. * Обозначения аминокислот: тирозин (ТИР), метионин (МЕТ), аланин (АЛА), глицин (ГЛИ), пролин (ПРО), цистеин (ЦИС), лизин (ЛИЗ), лейцин (ЛЕЙ), валин (ВАЛ), орнитин (ОРН), гистидин (ГИС), треонин (ТРЕ), фенилала-нин (ФЕН).
Как видно из представленных результатов, воздействие в течение суток нетоксичной дозой бензимидазола привело к изменению состава комплекса
аминокислот в гемолимфе имаго. Даже нетоксичная концентрация по-разному влияет при воздействии на имаго. Так, при воздействии дозой 0,00001 мг/мл в гемолимфе выявляются только: ГЛИ, ПРО, ВАЛ, ОРН, ФЕН, а при воздействии дозой на порядок выше (0,001 мг/мл) выявляется только ПРО, ВАЛ, ОРН, ФЕН, т.е. не выявляется ГЛИ.
Исследование воздействия дозой ЬБб0 показало, что в гемолимфе исчезли следующие аминокислоты: ВАЛ, ГИС И ТРЕ. При этом появились ЦИС и ЛИЗ, отсутствующие в контроле и при воздействии на имаго нетоксичными дозами бензимидазола.
Известно, что у насекомых отмечается высокое содержание свободных аминокислот в различных тканях и органах. Обычно в гемолимфе находят 15-16 свободных аминокислот [4, 5]. Состав аминокислот является чутким показателем изменения метаболизма насекомых. Отдельные аминокислоты могут воздействовать непосредственно и на молекулы ферментов. Так, АРГ и ЛИЗ непосредственно влияют на активность кислой РНКазы у вощиной моли и капустной белянки, вызывая ее ингибирование, а ГЛИ - активирование фермента. Повышение активности фермента под влиянием этих аминокислот может быть вызвано различными механизмами. Не исключено, что эти аминокислоты способны активировать транскрипцию соответствующих генов, таким образом, увеличивая число копий соответствующих мРНК. Показано, что аминокислоты могут оказывать мощное воздействие на активность нук-леаз, вызывая деструкцию РНК и ДНК у насекомых. При этом ряд аминокислот может оказывать непосредственное воздействие на молекулы кислых РНКаз и ДНКаз (возможно, в качестве регуляторов эффективности связывания полинуклеотидов в активном центре нуклеаз). Возможно и опосредованное воздействие аминокислот на активность нуклеаз посредством индукции или репрессии их синтеза на уровне транскрипции, как это было показано для фосфатаз насекомых. Таким образом, аминокислоты способны выступать в качестве тонких регуляторов катаболизма РНК и ДНК в тканях и органах насекомых [2].
Влияние аминокислот подобного типа на метаболизм выполняет у насекомых роль адаптаций в постоянно изменяющихся условиях среды. Одним из доказательств этого предположения является быстрое изменение состава фос-фатаз и связанное с этим изменение комплекса свободных аминокислот в гемолимфе насекомых [6].
Воздействие бензимидазолом в дозе ЬБ50 вызывает стресс у самцов имаго дрозофилы. Подтверждением этого вывода могут быть результаты последних исследований, показавших, что аминокислоты ЦИС и ЛИЗ, модифицируясь в редокс-чувствительных белках, являются ключевыми для редокс-сигнализации и реакции на стресс во всех организмах [7].
Полученные нами данные указывают на малую изученность механизмов регуляции метаболизма имаго дрозофилы. Большую роль в регуляции играет комплекс свободных аминокислот гемолимфы, который даже при нетоксичных дозах меняет свой состав, позволяя организму справиться с токсичностью. Возможно, выявленный адаптивный потенциал гемолимфы формируется в процессе эволюции в результате отбора группы генов, формирующих системы адаптивных ответов.
Список литературы
1. Соколянская М. П., Беньковская Г. В., Николенко А. Г. Динамика формирования резистентности личинок комнатной мухи к стресс-факторам различной природы // Агрохимия. 2005. № 9. С. 70-75.
2. Пиункова С. А. Влияние аминокислот на активность фосфатаз и нуклеаз насекомых : дис. ... канд. биол. наук. М., 2000. 191 с.
3. Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. М. : Мир, 2010. 450 с.
4. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты. Пептиды и Белки. М. : Мир, 2010. 362 с.
5. Филиппович Ю. Б., Минина Н. И. Ферменты насекомых // Итоги науки и техники. Сер.: Биологическая химия. М. : ВИНИТИ, 1976. Т. 9. 218 с.
6. Эчкалов А. П. Комплекс кислых фосфатаз насекомых : дис. ... канд. биол. наук. М., 1988. 180 с.
7. Fabian Rabe von Pappenheim, Kai Tittmann. Lysines and cysteines: partners in stress?// Trends Biochem Sci. 2022. Vol. 47. P. 372-374.
References
1. Sokolyanskaya M.P., Ben'kovskaya G.V., Nikolenko A.G. Dynamics of resistance formation in housefly larvae to stress factors of various natures. Agrokhimiya = Agrochem-istry. 2005;(9):70-75. (In Russ.)
2. Piunkova S. A. An effect of amino acids on the activity of insect phosphatases and nucleases. PhD dissertation. Moscow, 2000:191. (In Russ.)
3. Sharshunova M., Shvarts V., Mikhalets Ch. Tonkosloynaya khromatografiya v farmatsii i klinicheskoy biokhimii = Thin layer chromatography in pharmacy and clinical biochemistry. Moscow: Mir, 2010:450. (In Russ.)
4. Deveni T., Gergey Ya. Aminokisloty. Peptidy i Belki = Amino acids. Peptides and Proteins. Moscow: Mir, 2010:362. (In Russ.)
5. Filippovich Yu.B., Minina N.I. Insect enzymes. Itogi nauki i tekhniki. Ser.: Biolog-icheskaya khimiya = Results of science and technology. Series: Biological chemistry. Moscow: VINITI, 1976;9:218. (In Russ.)
6. Echkalov A.P. Insect acid phosphatase complex. PhD dissertation. Moscow, 1988. 180. (In Russ.)
7. Fabian Rabe von Pappenheim, Kai Tittmann. Lysines and cysteines: partners in stress? Trends Biochem Sci. 2022;47:372-374.
Информация об авторах / Information about the authors
Валентина Викторовна Дружинина
студентка,
Самарский национальный исследовательский университет имени академика С. П. Королева (Россия, г. Самара, Московское шоссе, 34)
E-mail: valentina.alex.drug@mail.ru
Valentina V. Druzhinina Student,
Samara National Research University named after Academician S.P. Korolev (34 Moskovskoye avenue, Samara, Russia)
Екатерина Сергеевна Селезнева кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры биохимии, биотехнологии и биоинженерии, Самарский национальный исследовательский университет имени академика С. П. Королева (Россия, г. Самара, Московское шоссе, 34)
E-mail: catana7@yandex.ru
Ekaterina S. Selezneva Candidate of biological sciences, associate professor,
associate professor of the sub-department of biochemistry, biotechnology and bioengineering, Samara National Research University named after Academician S.P. Korolev (34 Moskovskoye avenue, Samara, Russia)
Зоя Петровна Белоусова доктор химических наук, доцент, профессор кафедры неорганической химии, Самарский национальный исследовательский университет имени академика С. П. Королева (Россия, г. Самара, Московское шоссе, 34)
E-mail: zbelousova@mail.ru
Zoya P. Belousova
Doctor of chemical sciences,
associate professor,
professor of the sub-department
of inorganic chemistry,
Samara National Research University
named after Academician S.P. Korolev
(34 Moskovskoye avenue, Samara, Russia)
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов / The authors declare no conflicts of interests. Поступила в редакцию / Received 09.01.2024
Поступила после рецензирования и доработки / Revised 08.02.2024 Принята к публикации / Accepted 12.03.2024
