CC BY
58
200
УДК 575.826
Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2010. № 4(78).
ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНОЙ РЕАКЦИИ
ПЯОвОРШЬА МЕЕЛИОСАЯТЕЯ К ГЕНОТОКСИЧНОСТИ БЕНЗАЗОЛИДОВ РАЗЛИЧНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ
© 2010 Е.С. Селезнева, Е.И. Теньгаев1
Обнаружили, что бензимидазол и его производные достоверно различаются по способности индуцировать доминантные летальные мутации у ПтоворНИа те1аподавЬег как в полулетальной, так и в нетоксичной дозах. Самцы дрозофилы более чувствительны к мутагенному действию бензими-дазолидов, чем самки. Мутагенность отрицательно коррелировала с величинами молекулярной массы и молекулярного объема и положительно — с величиной энергии гидратации.
Кратковременное и долговременное воздействие нетоксичной дозой анализируемых веществ создавало преадаптацию к последующему генотоксическо-му действию соединений в дозе ЬВво. Выявили возможность преадаптации нетоксичной дозой бензимидазола к генотоксичности его производных.
Ключевые слова: доминантные летальные мутации, БговорЬИа те1аподавЬег, производные бензимидазола, адаптации.
Введение
Адаптивные проявления на фенотипическом уровне являются отражением событий, происходящих на генотипическом уровне: изменение генной экспрессии, появление мутаций. Сами мутации могут быть различными, однако появление рецессивных и доминантных летальных мутаций является характеристикой действующего ксенобиотика.
Воздействие ксенобиотиков в течение длительного времени может привести к появлению резистентности к ним. Резистентные к ксенобиотикам организмы возникают либо в результате появления мутаций устойчивости к данному виду химических веществ, либо в результате селекции по генам резистентности. Конкретные механизмы резистентности могут быть самыми различными, но особый интерес вызывает факт, что к одним соединениям возникает устойчивость в течение од-ного-двух поколений, а к их аналогам никогда. Именно поэтому в последние годы ведутся интенсивные исследования, посвященные вопросам выяснения механизмов резистентности.
■^Селезнева Екатерина Сергеевна ([email protected]), Теньгаев Евгений Иванович ([email protected]), кафедра зоологии, генетики и общей экологии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.
Бензазолиды широко распространены как природные соединения с высокой биологической активностью [9], они также широко используются в качестве лекарственных препаратов [7] и пестицидов [3, 8, 12].
Многие бензимидазолиды обладают мутагенной активностью [10], следовательно, представляют собой опасность для природных экосистем. В последние годы появились сведения о возникновении резистентности к действию пестицидов, производных бензимидазола [2, 13]: это активировало исследователей по поиску связей между строением соединений и способностью организмов адаптироваться к негативному воздействию.
Целью данного исследования явился анализ генотоксичности бензимидазоли-дов и способности БговорНИа ше1аподавЬег адаптироваться к ним.
Материал и методы исследования
Объектом исследования служили 7-10-дневные имаго БговорНИа шеЫподавЬег дикой линии Сап1юп-8.
В двух дозах — ЬБбо и нетоксичной дозе для всех исследуемых веществ (0,001 мг/мл) исследовали мутагенность бензимидазола и его производных. В табл. 1 приведены дозы ЬБбо, условные обозначения и названия исследуемых веществ.
Таблица 1
Концентрации бензимидазолидов (в мг/мл), вызывающих 50 % гибель в течение суток имаго БговорЬИа шеЫподавЬег
Условные
Названия соединений обозначения Доза ЬБбо
соединений самки самцы
Бензимидазол 1 14,5±0,1 13,3±0,1
М-метилбензимидазол 2 24,1±0,3 18,4±0,3
2-метилбензимидазол 3 26,2±0,1 22,1±0,1
М- бензимидазолид метансульфо- 4 10,9±0,4 8,1±0,2
кислоты
N бензимидазолид бензолсульфо- 5 8,3±0,2 7,1±0,2
кислоты
N бензимидазолид толуолсульфо- 6 6,1±0,1 7,5±0,1
кислоты
М-бензилбензимидазол 7 19,1±0,3 14,0±0,3
2-бензилбензимидазол 8 33,4±0,4 29,2±0,12
5,6-диметилбензимидазол 9 20,0±0,1 19,0±0,1
М-5,6-диметилбензимидазолид ме- 10 25,3±0,3 22,1±0,3
тансульфокислоты
Было проведено несколько серий экспериментов.
1 серия. Анализ способности бензимидазолидов в нетоксичной (0,001 мг/мл) и полулетальной дозе (ЬБ$о) индуцировать доминантные летальные мутации у имаго дрозофилы по методу предложенному Е.М. Белоконь [1]. Мутагенность анализировали отдельно для самок и самцов.
2 серия. Исследование способности бензимидазолидов в концентрации 0,001 мг/мл создавать преадаптацию у имаго БговорЬИа теЫподавЬет к последующему генотоксичному действию этими же соединениями в дозе ЬБ^о-Преадаптация 1 типа (кратковременная).
Девственные имаго самки и самцы раздельно по 900 штук содержались в попу-ляционных ящиках, в которые помещались чашки Петри с нанесенными растворами бензимидазолидов в концентрации 0,001 мг/мл. Через сутки чашки удалялись, и на их место помещались новые с растворами исследуемых соединений в дозе ЬБ5о, и воздействие продолжалось еще сутки. Затем чашки из популяционных ящиков удалялись, а имаго скрещивались с интактными особями противоположного пола по 500 интактных самцов к самкам и 500 интактных девственных самок к самцам. В течение следующих 12 часов производили сбор яиц на чашки Петри с кормом для анализа индуцированных доминантных леталей.
3 серия. Анализ способности бензимидазолидов в концентрации 0,001 мг/мл создавать преадаптацию у личинок БговорЬИа те1аподавЬет к последующему генотоксичному действию исследуемых бензимидазолидов в дозе ЬП5о- Преадаптация,
2 типа (долговременная).
Девственных самок и самцов имаго, личиночный период жизни которых, начиная с вылупления из яйца, прошел на среде, содержащей бензимидазолиды в концентрации 0,001 мг/мл, подвергали воздействию этими же бензимидазоли-дами в дозе ЬБ5о, затем анализировали число индуцированных доминантных летальных мутаций (ДЛМ).
4 серия. Исследование способности бензимидазола в концентрации 0,001 мг/мл создавать преадаптацию у имаго БговорЬИа те1аподавЬет к последующему генотоксичному действию исследуемыми соединениями в дозе ЬБ5о. Преадаптация
3 типа.
Девственных имаго разного пола первоначально подвергали воздействию бен-зимидазолом в дозе 0,001 мг/мл, а затем исследуемыми бензимидазолидами в дозе ЬБ5о, потом анализировали число индуцированных доминантных леталей
5 серия. Исследование способности бензимидазола в концентрации 0,001 мг/мл создавать преадаптацию у личинок БговорЬИа те1аподавЬет к последующему генотоксичному действию исследуемых бензимидазолидов в дозе ЬБ5о. Преадаптация,
4 типа.
Девственных самок и самцов имаго, личиночный период жизни которых, начиная с вылупления из яйца, прошел на среде, содержащей бензимидазол в концентрации 0,001 мг/мл, подвергали воздействию исследуемыми же бензимидазо-лидами в дозе ЬБ5о, затем анализировали число индуцированных ДЛМ.
Статистическую обработку полученных результатов производили с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Оценка связи между генотоксичностью соединений, их способность развивать у БтоворЬИа теЫподавЬет преадаптацию и физико-химическими параметрами исследуемых бензимидазолидов проводилась с помощью корреляционного анализа [4].
Результаты и их обсуждение
Ранее проведенные, а также повторные исследования показали, что все представленные вещества индуцируют доминантные летальные мутации у самок и самцов БтоворЬИа те1аподавЬет (табл. 2).
Таблица 2
Количество ДЛМ, индуцированных бензимидазолидами у имаго
Drosophila melanogaster
Вещества ДЛМ в % (доза LD50) ДЛМ в % (нетоксичная доза)
у самок у самцов у самок у самцов
1 9,7±1,0 10,6±1,0 2,6±0,5 3,8±0,6
2 18,7±1,3 24,2±1,4 7,2±0,9 8,7±0,9
3 22,6±1,4 28,9±1,5 8,2±0,9 14,6±1,2
4 12,5±1,1 18,2±1,3 3,4±0,6 5,7±0,8
5 9,1±1,0 9,9±1,0 1,4±0,4 2,4±0,5
6 11,1±1,0 13,2±1,1 1,6±0,4 2,8±0,5
7 7,5±0,9 9,7±1,0 2,2±0,5 2,9±0,6
8 5,1±0,7 6,0±0,8 1,6±0,4 1,8±0,4
9 18,8±1,3 22,1±1,4 2,8±0,5 3,3±0,6
10 18,9±1,3 19,3±1,3 3,1±0,6 3,9±0,6
Контроль 0,22±0,16 0,34±0,19 0,21±0,16 0,31±0,19
Все соединения достоверно различались по мутагенности, самцы более чувствительны к мутагенному действию, чем самки Drosophila melanogaster (p < 0,001).
Соединения в нетоксичной дозе индуцируют достоверно меньше мутаций у особей обоих полов, чем в дозе LD50 (p < 0, 001).
Метильные и сульфурильные производные бензимидазола более мутагенны, бензильные — менее мутагены, чем бензимидазол, однако в нетоксичной дозе различия в мутагенности выражены слабее.
Обнаруженная связь между мутагенной активностью соединения и наличием в бензимидазолиде метильной и сульфурильной группы совпадает с полученными нами ранее результатами по анализу цитогенетической активности бензимидазо-лидов при действии ими на лимфоциты периферической крови человека [10]. Однако в данном исследовании зависимости мутагенности от количества метильных групп мы не обнаружили. Мутационный процесс, индуцированный химическими мутагенами, зависит от особенностей метаболизма тест-объекта. Именно поэтому чрезвычайно важно строение вещества, которое позволяет эффективно взаимодействовать с молекулами мишенями. Возможно, анализируемые нами соединения подвергались метаболитической трансформации в пищеварительных путях самок и самцов, что изменяет "картину", наблюдаемую при прямом действии этих соединений на лимфоциты человека.
Обнаруженная нами зависимость мутагенности от строения соединения совпадает с результатами других исследователей, работавших с другими веществами [5, 6, 11].
Известно, что существует возможность активации репаративных систем предварительным воздействием нетоксичной дозой яда.
Мы проанализировали способность нетоксичных доз исследуемых веществ развивать преадаптацию к действию соединениями в дозе LD50. Результаты проведенных экспериментов суммированы в табл. 3.
Проведенный полный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что после кратковременной преадаптации нетоксичной дозой исследуемых бензимидазо-лидов разница в чувствительности к мутагенному действию соединений у имаго разных полов сохранилась (p < 0,05). Можно предположить, что механизмы воз-
действия на системы резистентности различны, так как сохраняются достоверные различия в числе индуцированных доминантных леталей разными бензимидазо-лидами (р < 0,02).
Таблица 3
Число доминантных леталей в % индуцированных бензимидазолидами в дозе ЬО50 после преадаптации различного типа нетоксичной дозой
исследуемых веществ
Исследуемое Преадаптация 1 типа, крат- Преадаптация 2 типа, дол-
соединение ковременная преадаптация говременная преадаптация
0,001 мг/мл + ЬБ50 0,001 мг/мл + ЬБ50
самки самцы самки самцы
1 2,7±0,5 3,2 ±0,6 6,6±0,8 8,7±0,9
2 6,9±0,8 10,3±1,0 8,68±0,9 7,93±0,9
3 7,5±0,9 9,9±1,0 6,4±0,8 11,1±1,0
4 8,2±0,9 6,5±0,8 6,4±0,8 9,9±1,0
5 5,2±0,7 6,1±0,8 1,6±0,4 2,8±0,5
6 5,8±0,8 6,4±0,8 3,2±0,6 4,6±0,7
7 2,6±0,5 3,4±0,6 1,9±0,5 2,8±0,5
8 2,0±0,5 2,3±0,5 1,2±0,4 1,6±0,4
9 7,9±0,9 16,3±1,2 7,8±0,9 8,3±0,9
10 9,1 ±0,96 18,1±1,3 6,9±0,8 7,2±0,9
После кратковременного воздействия нетоксичной дозой и последующим воздействием дозой ЬБ50 число доминантных леталей достоверно уменьшалось у имаго обоих полов по сравнению с прямым действием дозой ЬБ50 (р < 0, 01). Необходимо отметить, что число индуцированных ДЛМ после преадаптации достоверно отличалось от числа ДЛМ, индуцированных нетоксичной дозой (р < 0, 01) у самок, и не отличалось от таковой у самцов.
Число доминантных леталей индуцированных дозой ЬБ50 после долговременной преадаптации и числом ДЛМ достоверно уменьшилось (р < 0,001) у имаго обоих полов по сравнению с числом ДЛМ индуцированных прямым действием бензимидазолидов в дозе ЬБ50. Таким образом можно утверждать, что предварительное воздействие нетоксичной дозой исследуемыми соединениями вызывает развитие состояния преадаптированности к генотоксичности этих веществ.
Чтобы понять, что в строении бензимидазолидов влияет на активацию репара-тивных процессов при преадаптации, мы провели еще одну серию экспериментов (табл. 4).
Как показали проведенные эксперименты, кратковременная преадаптация нетоксичной дозой бензимидазола имаго дрозофилы к последующему воздействию бензимидазолидами в дозе ЬБ50 достоверно уменьшила количество индуцированных ДЛМ по сравнению с прямым действием этих соединений в дозе ЬБ50 (р < < 0,01). Число ДЛМ после преадаптации бензимидазолом было достоверно выше, чем при прямом воздействии этими веществами в нетоксичной дозе (р < 0,01).
Количество индуцированных ДЛМ дозой ЬБ50 после преадаптации 3 типа у особей разных полов достоверно различалось (р < 0, 01).
Долговременная преадаптация личинок нетоксичной дозой бензимидазола показала, что последующее воздействие на имаго бензимидазолидами в дозе ЬБ50 индуцирует достоверно различное число ДЛМ у имаго разных полов (р < 0, 001).
Количество индуцированных ДЛМ при этом достоверно выше, чем число ДЛМ, индуцированных прямым действием нетоксичной дозой бензимидазолидов, однако достоверно меньше, чем при прямом действии этими соединениями в дозе ЬОбо (р < 0, 001).
Мы сравнили эффективность кратковременной преадаптации бензимидазоли-дами с такой же, создаваемой бензимидазолом, а также долговременной преадап-тацией веществ самих к себе с таковой, создаваемой бензимидазолом, и обнаружили, что преадаптация, создаваемая бензимидазолом, менее эффективна (р < 0,01), при этом различия в количестве индуцированных ДЛМ бензимидазолидами при всех типах преадаптации достоверны (р < 0,01). Это обстоятельство позволяет предположить, что преадаптация создается не только селекцией особей к гено-токсичности веществ (долговременная преадаптация), но и активацией различных репаративных систем.
Таблица 4
Число доминантных леталей в % индуцированных бензимидазолидами в дозе ЬОбо после преадаптации различного типа нетоксичной дозой
бензимидазола (1)
Исследуемое Преадаптация 3 типа, крат- Преадаптация 4 типа, дол-
соединение ковременная преадаптация говременная преадаптация
0,001 мг/мл (1)+ ЬБ50 бензи- 0,001 мг/мл(1) + ЬБ50 бензи-
мидазолиды мидазолиды
самки самцы самки самцы
1 2,7±0,5 3,2±0,6 6,6±0,8 8,7±0,9
2 6,9±0,8 10,9±1,0 7,6±0,9 8,8±0,9
3 7,8±0,9 11,9±1,1 7,9±0,9 8,9±0,9
4 6,9±0,8 8,9±0,9 7,2±0,9 9,9±1,0
5 7,1±0,9 9,1±1,0 6,7±0,8 8,8±0,9
6 7,5±0,9 9,9±1,0 3,9±0,6 6,7±0,8
7 7,9±0,9 4,5±0,7 2,4±0,5 4,9±0,4
8 2,8±0,5 3,9±0,6 2,3±0,5 3,1±0,6
9 8,1±0,9 16,3±1,2 7,1±0,9 8,7±0,9
10 9,2±1,0 18,0±1,3 7,2±0,9 7,8±0,9
Возможно, различия связаны с механизмами, определяющими скорость поступления веществ к мишеням. По-видимому, анализируемые бензимидазолиды проникают в клетки, используя различные рецепторы, например имидазолиновые [14] или другие, которые существуют в силу того, что известны многие природные высокоактивные производные бензимидазола — пурины, витамины, гормоны, поступающие экзогенно, поэтому в процессе эволюции возникли многочисленные шунты, способные уменьшить негативное воздействие экзогенных бензимидазолидов.
Мы проанализировали, какие из физико-химических параметров являются определяющими в развитии генотоксичности и резистентности к генотоксичности исследуемых бензимидазолидов.
Для данной группы соединений способность в нетоксичной дозе индуцировать ДЛМ высоко отрицательно коррелировала с величинами молекулярной массы и молекулярного объема (г = —0,7), в дозе ЬБбо — отрицательно коррелировала с величиной молекулярной массы (г = —0, 6) и положительно коррелировала с величиной энергии гидратации (г = 0, 7).
Способность соединений вызывать адаптивный ответ при кратковременной преадаптации коррелировала с теми же физико-химическими параметрами, с которыми коррелировал мутагенный ответ. Способность развивать резистентность при долговременной преадаптации положительно коррелировала только с величиной энергии гидратации (r = 0, 7).
Таким образом, можно утверждать, что механизмы адаптации к ксенобиотикам в личиночный период жизни отличаются от таковых на имагинальной стадии, в развитии адаптивного ответа огромная роль принадлежит способности специальных шунтов отличать ксенобиотик от их природных аналогов, используемых дрозофилой в собственном метаболизме.
Отсутствие значительной корреляции между числом индуцированных доминантных леталей, возникающих после действия бензимидазолидами на имаго дрозофилы, и величиной липофильности, показывающей способность веществ растворяться в мембранах и таким образом проникать внутрь клеток, косвенно подтверждает наличие на поверхности клеток-мишений рецепторов, отсутствие корреляций с величиной дипольного момента говорит о большом полиморфизме как ре-цепторных систем, так и систем резистентности.
Подводя итог проведенным экспериментам, можно отметить, что длительное воздействие бензимидазолом и его производными способно развить адаптивный ответ к их генотоксичности. Степень и скорость развития адаптивного ответа определяются строением вещества и его способностью взаимодействовать с мембранными рецепторами клеток мишеней, о чем говорит корреляция с некоторыми физико-химическими параметрами, влияющими на проникновение веществ в клетки.
Литература
[1] Белоконь Е.М. Методические указания к определению мутационной активности химических препаратов на дрозофиле. Львов: Изд-во Львовского гос. ун-та, 1984. 26 с.
[2] Жуковский А.Г., Буга С.Ф. Чувствительность популяций гриба F. nivale, паразитирующего на озимой тритикале к фундазолу // Защита растений: сб. научн. тр. Минск, 2003. Вып. 27. С. 84-89.
[3] Кадыров Г.Ш. Химия и пестицидная активность бензимидазолидов // Регуляторы роста растений и гербициды. Ташкент: ФАН, 1978. С. 65-123.
[4] Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.
[5] Любимова И.К., Абилев С.К., Мигачев Г.И. Влияние некоторых структурных особенностей в молекулах производных пирена и его гетероциклических аналогов на мутагенную активность // Генетика. 1995. Т. 31. № 1. С. 128-132.
[6] Любимова И.К., Абилев С.К., Мигачев Г.И. Взаимосвязь между мутагенной активностью и химической структурой в ряду производных бифенила // Генетика. 1995. Т. 31. № 2. С. 268-272.
[7] Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 т. М.: Медицина, 1993. T. 2. 736 с.
[8] Мельников И.Н. Пестициды, химия, технология и применение. М.: Химия, 1987. 721 с.
[9] Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987. 815 с.
[10] Селезнева Е.С. Изменение цитогенетической активности гетероциклических азолов при введении в их строение метильных групп // Татищевские чтения: актуальные проблемы науки и практики. Сер.: Актуальные проблемы
экологии и охраны окружающей среды: материалы 5 юбилейной междунар. конф. Тольятти: Изд-во "Татищевский университет", 2008. С. 21-217.
[11] Синтез и исследование мутагенной активности ди(индено/2,1-Ь/индолил)-, ди(индено/2,1-Ь/пиролил)метанов и диметилсиланов / И.Э. Нифантьев [и др.] // Известия РАН. Сер.: Химическая. 2001. № 5. С. 1369-1375.
[12] Спектр фармакологической активности и токсикологические свойства производных бензимидазола / А.А. Спасов [и др.] // Химико-фармацевтический журн. 1999. № 5. С. 6-17.
[13] Analysis of variation within Microdochium nivale from wheat: evidence for a distinct sub-group / A.K. Lees [et al.] // Mycol. Res. 1995. V. 99. P. 103-109.
[14] I1-imidazoline receptors. Definition, characterisation, distribution and transmembrane signalling / P. Ernsberger [et al.] // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1995. Jul 12. V. 763. P. 22-42.
Поступила в редакцию 20/IV/2010;
в окончательном варианте — 20/IV/2010.
PECULIARITIES OF DROSOPHILA MELANOGASTER ADAPTIVE REACTION TO A BENZAZOLIDE GENOTOXICITY OF VARIOUS MOLECULAR STRUCTURE
© 2010 E.S. Selezneva, E.I. Tengaev2
It was found out that benzimidazole and its derivatives authentically differ in their ability to induce dominant lethal mutations at Drosophila melanogaster both in semilethal, and in nontoxical doses as well. Drosophila fly males are more sensitive to a mutagen benzimidazole action, than females. Mutagenecity correlated negatively with values of the molecular weight and molecular volume, and positively - with value of the hydration energy. Short-term and long-term influence by a nontoxical dose of substances are analyzed, a preadaptation to the subsequent genotoxic action of substances in dose LD50 is created. A preadapta-tion possibility by a benzimidazole nontoxical dose to its derivatives genotoxicity have been revealed.
Key words: dominant lethal mutations, Drosophila melanogaster, benzimidazole
derivatives, adaptations.
Paper received 20/IV/2010. Paper accepted 20/IV/2010.
2Selezneva Ekaterina Sergeevna (catana7ayandex.ru), Tengaev Yevgeniy Ivanovich ([email protected]), Dept. of Zoology, Genetics and General Ecology, Samara State University, Samara, 443011, Russia.
