Физико-химические свойства имидазолидов, их мутагенность, и способность Drosophila melanogaster адаптироваться к ним Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 575.1 /2: 574.2

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИМИДАЗОЛИДОВ, ИХ МУТАГЕННОСТЬ, И СПОСОБНОСТЬ ВЯОБОРШЬЛ МЕЬЛМОСЛБТЕЯ АДАПТИРОВАТЬСЯ К НИМ

© 2009 Е.С. Селезнева, Е.И. Теньгаев, А.В. Шпилько

Самарский государственный университет, г Самара Поступила 27.03.2009

Показали, что имидазол и его метильные и сульфурильные производные различаются по способности индуцировать доминантные летальные мутации у имаго Dгosophila. melaпogasteг как в нетоксичной, так и полулетальной дозах. Мутагенность соединения отрицательно коррелировала с молекулярной массой, молекулярным объемом и величиной суммарного дипольного момента исследуемых соединений. Кратковременное воздействие нетоксичной дозой имидазолидов на имаго не способно развить у Dгosophila. melaпogasteг адапта-ций, снижающих мутагенность соединений. Долговременное воздействие нетоксичной дозой (личиночный период жизни) вызывает у имаго развитие адаптивного ответа, выражающегося в достоверном уменьшении числа доминантных леталей индуцированных полулетальной дозой этих соединений, по сравнению с числом мутаций индуцированных прямым действием соединений. Предварительное воздействие имидазолом в нетоксичной дозе ни кратковременное, ни долговременное не вызывает у Dгosophila. melaпogasteг адаптивного ответа к воздействию имидазолидами в полулетальной дозе. Обсуждается роль физико-химических параметров имидазолидов в развитии адаптивного ответа.

Ключевые слова: Dгosophila. melaпogasteг, адаптации, преадаптации, имидазолиды, доминантные летальные мутации, корреляция, физико-химические параметры веществ

Обилие и разнообразие большого числа пестицидов привело к тому, что они стали важнейшим компонентом среды обитания. Не смотря на попытки создания пестицидов с избирательной токсичностью, все исследования показали, что они действуют на все компоненты биоты экосистем. В результате этого многие виды погибают, а у некоторых возникает устойчивость. Развитие устойчивости не обязательно ведет к увеличению общей приспособленности. Так в популяциях Blatella germanica, подвергнутых периодическому воздействию пиретроидов обнаружена кариотипическая нестабильность [12].

Применение одних и тех же пестицидов приводит к селекции по генам устойчивости к данному ксенобиотику, что побуждает искать новые эффективные пестициды.

Особый интерес представляют собой вещества, которые являются аналогами природных биологически активных веществ, так как они выступают как их конкуренты. К таким соединениям относятся различные производные имидазола.

Биологическая активность производных имидазо-ла чрезвычайно высока. Наиболее распространенным производным имидазола является гистидин, и гиста-мин; аденин и гуанин состоят из двух конденсированных колец пиримидина и имидазола; имидазольное кольцо входит в состав витамина В12 [8]. Выявленные в мускулатуре позвоночных животных эрготонин и карнозин и другие соединения имидазола участвуют в восстанавлении активности многих ферментов [9].

Селезнева Екатерина Сергеевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры зоологии, генетики и общей экологии. E-mail: [email protected]. Теньгаев Евгений Иванович, кандидат биологических наук, доцент той же кафедры. Шпилько Александр Владимирович, студент.

Возможно, поэтому многие синтетические биологически активные соединения являются имидазолидами [1, 6, 7].

Целью данного исследования явился анализ гено-токсичности некоторых производных имидазола и поиск корреляций между их биологической активностью и физико-химическими параметрами, а так же выяснения роли физико-химических параметров в развитии адаптивного ответа. Это позволит в дальнейшем синтезировать высокоэффективные пестициды с избирательной токсичностью.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В табл. 1 приведены физико-химические параметры и названия исследуемых имидазолидов и их краткое обозначение.

Для анализа генотоксичности имидазолидов использовали водные растворы в двух дозах: нетоксичной - это концентрация не вызывающая гемолиз эритроцитов человека (0,001 мг/мл) и LD50 (концентрации представлены в табл.2).

Генотоксичность оценивали по способности индуцировать доминантные летальные мутации. Учет доминантных летальных мутаций у имаго Dгosophila. melaпogasteг проводили по методу Белоконь (1984).

Объектом исследования служили имаго дикой линии Canton-S.

Девственные самки и самцы содержались на стандартном корме, состоящем из 60 г дрожжей, 60 г бананов, 20 г изюма, 60 г манной крупы, 60 г сахара, 8 г агар-агара, 3 мл уксусной кислоты на 1 л воды.

Было проведено несколько серий эксперимента.

1 Серия. Анализ способности имидазолидов индуцировать доминантные летальные мутации.

Для анализа способности соединения индуцировать доминантные летали, соединения использовали в двух концентрациях - 0,001 мг/мл и доза LD50, растворителем служила кипяченая вода.

Для анализа мутагенности соединения для самцов, их в течение 24 часов содержали в популяционных

ящиках, куда были внесены чашки Петри с исследуемым соединением. Затем 900 самцов скрещивали с 600 интактными девственными самками.

Для анализа способности соединения индуцировать доминантные летали у самок их подвергали тем же воздействиям, что и самцов, затем 900 девственных, обработанных исследуемым имидазолидом, са-

мок скрещивали с девственными интактными самцами (600 самцов).

После скрещивания, в течение 12 часов через каждые 2 часа в популяционные ящики, где происходило скрещивание, вносили чашки Петри с кормом для сбора кладки яиц.

Таблица 1. Физико-химические параметры исследуемых соединений

Название соединения Молекулярная масса (г/моль) Молекулярный объем (А3) Энергия гидратации (ккал/моль) Ьо§Р Суммарный дипольный момент (дебай)

Имидазол (Ьт) 68.08 274.26 -8.5 -0.97 3.599

^метилимидазол ^теЬт) 82.11 330.93 -3.89 -0.73 3.927

2-метилимидазол (СтеЬт) 82.11 330.01 -6.4 -0.94 3.699

^имидазолид- метансульфокислоты (Ьп802СНз) 146.16 419.83 -6.55 -1.53 3.53

^имидазолид- бензолсульфокислоты (Ьп802РЬе) 208.23 575.41 -7.49 -1.04 5.1

^имидазолид- тозилсульфокислоты (Ьт802То1) 222.26 629.06 -6.28 -0.88 5.62

Таблица 2. Концентрация водных растворов (в мг/мл) имидазолидов вызывающих в течение суток 50% гибель имаго ОгозорЬИа. melanogasteг

Название соединения Самки Самцы

1т 5,0 3,2

№пе1т 6,1 7,2

СтеЬт 50,0 47,0

1т802СН3 27,0 16,0

1т802РЬе 24,0 37,6

1т802То1 10,4 16,7

После первичного подсчета яиц (под бинокулярной лупой МБС-9), чашки помещали в термостат при +22°С на 30 часов для развития яиц. После этого подсчет проводился вторично с учетом развившихся яиц. Подсчет ДЛМ ведется по формуле:

А - В

% длм = ~а~ *юо%,

где А- общее количество яиц за сутки, В- количество личинок через сутки и плюс неоплодотворенные яйца.

2 Серия. Исследование способности имидазолидов в концентрации 0,001 мг/мл создавать преадаптацию у имаго БгоБорИНа melanogasteг к последующему ге-нотоксичному действию этими же соединениями в дозе ЬБ 0 Преадаптация 1 типа (кратковременная).

Экспериментальные имаго самки и самцы раздельно по 900 штук содержались в популяционных ящиках, в которые помещались чашки Петри с нанесёнными растворами имидазолидов в концентрации 0,001 мг/мл. Через сутки чашки удалялись, и на их место помещались новые с растворами исследуемых соединений в дозе LD50, и воздействие продолжалось ещё сутки. Затем, чашки из популяционных ящиков удалялись, а имаго скрещивались с интактными особями противоположного пола, и производился анализ индуцированных доминантных леталей как описано в 1 серии.

3 Серия. Исследование способности имидазолидов в концентрации 0,001 мг/мл создавать преадаптацию у личинок Dгosophila melanogasteг к последующему генотоксичному действию исследуемых имидазоли-дами в дозе ЬБ ¡о. Преадаптация 2 типа (долговременная)

Личинок Dгosophila. melanogasteг, синхронизированных по вылуплению из яйца, рассаживали в сахарные стаканчики, в которых корм содержал имидазо-лиды в концентрации 0,001 мг/мл. Таким образом, личинки проводили весь личиночный период жизни и стадию куколки на этой среде. Далее отбирали девственных самцов и самок, на которых воздействовали исследуемыми имидазолидами в дозе LD50 по схеме эксперимента для анализа прямого мутагенного действия.

4 Серия. Исследование способности имидазола в концентрации 0,001 мг/мл создавать преадаптацию у имаго Dгosophila melanogasteг к последующему генотоксичному действию исследуемых имидазолидами в дозе ЬБ 50. Преадаптация 3 (кратковременная).

Экспериментальные имаго самки и самцы раздельно по 900 штук содержались в популяционных ящиках, в которые помещались чашки Петри с нанесёнными растворами имидазола в концентрации 0,001 мг/мл. Через сутки чашки удалялись, и на их место помещались новые с растворами исследуемых соединений в дозе LD50, и воздействие продолжалось ещё сутки. Затем, чашки из популяционных ящиков удалялись, а имаго скрещивались с интактными особями противоположного пола, и анализировали число доминантных леталей, как это делалось в серии 1.

5 Серия. Исследование способности имидазола в концентрации 0,001 мг/мл создавать преадаптацию у личинок Dгosophila melanogasteг к последующему генотоксичному действию исследуемыми имидазолидами в дозе ЬD 50 Преадаптация 4 типа (долговременная).

Личинок Dгosophila. melanogasteг, синхронизированных по вылуплению из яйца, рассаживали в сахарные стаканчики, в которых корм содержал имидазол в концентрации 0,001 мг/мл. Таким образом, личинки проводили весь личиночный период жизни и стадию куколки на этой среде. Далее отбирали виргильных самцов и самок, на которых воздействовали исследуемыми имидазолидами в дозе LD5o по схеме эксперимента для анализа прямого мутагенного действия и оценивали число доминантных леталей.

Статистическую обработку полученных результатов производили с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. Оценка связи между генотоксично-

стью соединений и физико-химическими параметрами исследуемых имидазолидов проводилась с помощью корреляционного анализа (Лакин, 1990)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В табл. 3 представлены результаты прямого действия исследуемых соединений на имаго дрозофилы. Как видно из представленных экспериментов все анализируемые производные имидазола и сам имидазол и в нетоксичной дозе, и в дозе LD50 индуцируют доминантные летальные мутации как у самок, так и самцов Dгosophila melanogasteг.

Таблица 3. Способность имидазолидов индуцировать доминантные летальные мутации у имаго Dгosophila melanogasteг

Название Доминантные летали в % индуцированные у

соединений самок самцов

0,001 мг/мл LD50 0,001 мг/мл LD50

Im 18,3±0,2 21,8±0,2 16,0±0,1 19,6±0,1

NmeIm 16,8±0,2 18,3±0,2 12,8±0,3 13,4±0,3

CmeIm 18,8±0,1 21,1±0,1 15,8±0,1 20,2±0,1

ImSO2CH3 26,9±0,3 24,1±0,3 16,0±0,4 19,8±0,4

ImSO2Phe 6,0±0,1 8,36±0,1 5,1±0,3 7,4±0,3

ImSO2Tol 9,0±0,2 10,46±0,2 5,8±0,2 6,74±0,2

Таблица 4. Величины коэффициентов корреляций между исследуемыми параметрами

Физико-химические параметры Индуцированные доминантные летали в % у самок Индуцированные доминантные летали в % у самцов

0,001мг/мл LD50 0,001мг/мл LD50

Молекулярная масса -0,61 -0,79 -0,86* -0,86*

Молекулярный объем -0,68* -0,84* -0,90* -0,85*

Суммарный дипольный момент -0,88* -0,95* -0,97* -0,92*

Примечание: звездочкой отмечены коэффициенты корреляции значимые для p<0,05.

Проведенный полный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что все соединения достоверно для p<0,05 различаются по мутагенности, и в нетоксичной дозе и полулетальной дозе соединения достоверно больше индуцируют мутации у самок, чем у самцов. Кроме того анализ показал, что в полулетальной дозе имидазол и его производные достоверно больше индуцируют доминантных леталей, чем в нетоксичной дозе (р<0,05). Мутагенная активность убывает в следующем ряду:

ImSO2CHз > М = > NmeIm > ImSO2Tol>

ImSO2Phe

Мы провели корреляционный анализ между физико-химическими свойствами исследуемых веществ и их мутагенность. Результаты корреляционного анализа суммированы в таблице 4.

Проведенные исследования показали, не зависимо от дозы способность индуцировать доминантные летали у имаго дрозофилы высоко отрицательно коррелировала с величинами молекулярного объема и суммарного дипольного момента, и не коррелировала с лиофильностью и величиной энергии гидратации. По нашему мнению это является показателем того, что данные соединения попадают в клетки мишени, используя специальные рецепторы, а не с помощью диффузии через мембраны, что согласуется с данными ряда автором о наличии у многих клеток имидазо-линовых рецепторов [10, 11].

Важность данных физико-химических параметров для развития мутагенного ответа были получены и для других классов органических веществ [1, 4].

Анализируя возможность развития адаптивного ответа к мутагенному действию исследуемых соединений, мы провели две серии экспериментов. В одной серии (см. Материалы и методы Серия 2. Преадапта-ция 1) создавалась кратковременным (в течение суток) воздействием на имаго соединениями в нетоксичной дозе и с последующим воздействием этими же веществами в дозе LD50. В другой серии эксперимента (Серия 3. Долговременная преадаптация 2) исследуемые имидазолиды воздействовали на дрозофилу в течение всего личиночного периода жизни, и имаго, подвергнутых такому воздействию подвергались суточному воздействию этими же соединениями в дозе LD50. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 5.

При кратковременной преадаптации с последующим воздействием на имаго дозой LD 50 (Преадапта-ция 1 типа) число индуцированных доминантных ле-талей у самок и самцов достоверно не отличается, однако, как показал проведенный двухфакторный дисперсионный анализ, соединения после преадапта-ции сохранили достоверные различия в способности индуцировать доминантные летальные мутации ф<0,05). Сравнение числа индуцированных доминантных леталей у самок и самцов после преадапта-ции с числом доминантных леталей индуцированных

прямым воздействием дозой ЬБ50 показало, что эти величины достоверно не отличаются для р<0,05.

Таблица 5. Число индуцированных имидазолидами в дозе ЬБ50 доминантных летальных мутаций, после преадаптаций различного типа дрозофилы нетоксичной дозой этих соединений

Исследуемое соединение Преадаптация 1 типа, кратковременная преадаптация 0,001 мг/мл + ЬБ50 Преадаптация 2 типа, долговременная преадаптация 0,001 мг/мл + ЬБ50

самки самцы самки самцы

1т 19,4±0,09 16,0±0,03 13,9±0,1 11,0±0,04

№ше1т 13,5±0,1 9,9±0,02 7,5±0,1 6,3±0,1

Сте1т 17,1±0,2 16,1±0,1 9,2±0,2 7,1±0,1

1ш802СЫз 14,8±0,1 20,0±0,06 11,1±0,05 10,1±0,1

1т802РЬе 7,1±0,08 6,0±0,04 7,2±0,1 6,1±0,03

1т802То1 11,43±0,11 9,13±0,1 6,9±0,06 6,1±0,04

Долговременная преадаптация (преадаптация 2 типа) нетоксичной дозой в течение всего личиночного периода жизни, выявило адаптивный ответ, то есть число индуцированных доминантных леталей у самок и самцов после преадаптации достоверно (р<0,01) меньше, чем при прямом воздействии полулетальной дозой. Кроме того, число индуцированных доминантных леталей у самок и самцов после преадаптации достоверно различалось (р<0,01).

Мы проанализировали, какие из физико-химических параметров являются определяющими в развитии адаптивного ответа. Для этого мы высчитали разницу между числом доминантных леталей при прямом действии и числом доминантных леталей после долговременной преадаптции имидазолидами к самим себе. Затем провели корреляционный анализ между полученной разницей и исследованными физико-химическими параметрами. Обнаружили высокую (достоверно для р<0,05) отрицательную корреляцию с величинами молекулярной массы (г$ = -0,72, гб = -0,83), молекулярного объема(г$ = -0,77, гб = -0,85), суммарного дипольного момента (г$ = -0,87, гб = -0,92). Можно предположить, чем эффективнее соединение взаимодействует с рецепторами на поверхности клеток, тем быстрее развивается адаптивный ответ. В пользу этого говорит, отрицательная корреляция между проанализированными физико-химическими параметрами соединений и адаптивным ответом к ним.

Для того чтобы доказать это предположение и выяснить роль функциональных групп исследуемых имидазолидов в развитии адаптивного ответа, мы провели еще две серии экспериментов, в которых кратковременная и долговременная преадаптации осуществлялись нетоксичной (0,001 мг/мл) дозой имидазола к последующему воздействию имидазоли-дами в дозе ЬБ50. Результаты проведенных экспериментов представлены в табл. 6.

Проведенный полный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что ни кратковременное, ни долговременное предварительное воздействие имида-золом не создает преадаптацию к мутагенному действию имидазолидами, у имаго дрозофилы. Предварительное воздействие нетоксичной дозой имидазола, не только не ослабляли мутагенное действие производных имидазола в дозе ЬБ50, но усиливали его, что говорит по нашему мнению о том, что у БговорИНа те1аподаз1ег существуют несколько отличные механизмы адаптаций к мутагенному действию имидазола и его производных. Усиление мутагенного ответа особенно ярко выражено для имидазолидов, содержащих бензольное кольцо - 1тБ02РЬе и 1тБ02То1, которые при прямом действии демонстрировали самую слабую мутагенность. Это свидетельствует, по нашему мнению о независимом действии этих имида-золидов и имидазола, поэтому наблюдается суммированное действие исследуемых веществ, кроме того, это говорит о возможном существования различных типов имидазолиновых рецепторов.

Подводя итоги проделанным экспериментам можно сказать, что для имидазола и исследованных нами его производных определяющим в развитии мутагенного ответа являются такие параметры как молекулярная масса, молекулярный объем и суммарный ди-польный момент, что свидетельствует в пользу предположения, что на поверхности клеток-мишений существуют специфические рецепторы для имидазоли-дов, и что их несколько типов. Репаративные механизмы к специфическому действию конкретного вещества активируются и запускаются в момент взаимодействия ксенобиотика и мембранного рецептора. По-видимому, косвенным доказательством этого является обнаруженная корреляция между теми же физико-химическими параметрами и адаптивным ответом к генотоксическому действию исследуемых соединений.

Таблица 6. Число индуцированных имидазолидами в дозе ЬБ50 доминантных летальных мутаций, после преадаптаций различного типа дрозофилы нетоксичной дозой имидазола

Исследуемое соединение Преадаптация 3 типа, кратковременная преадаптация 1т 0,001 мг/мл + имидазолиды ЬБ50 Преадаптация 4 типа, долговременная преадаптация 1т 0,001 мг/мл + имидазолиды ЬБ50

самки самцы самки самцы

1т 19,4±0,1 16,0±0,3 13,9±0,1 11,0±0,04

№пе1т 14,8±0,2 13,8±0,1 14,99±0,2 8,99±0,2

Сте1т 16,6±0,1 15,7±0,3 16,2±0,1 13,4±0,5

ImSO2CH3 20,2±0,2 18,7±0,6 17,76±0,8 14,5±0,6

ImSO2Phe 21,1±0,1 19,5±0,1 19,5±0,1 18,8±0,1

ImSO2Tol 23,6±0,2 20,0±0,4 28,4±0,2 10,8±0,1

Кроме того огромную роль в развитии адаптивного ответа играет время воздействия нетоксичной дозой перед последующим воздействием дозой ЬБ50. Кратковременная преадаптация веществ самих к себе не способна индуцировать репаративные системы, долговременная преадаптация напротив развивает адаптивный ответ, выражающийся в том, что число доминантных леталей снижается.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абилев С.И. Выявление и прогнозирование мутационной

активности химических соединений окружающей среды: Автореф. Дис. док. биол. наук. М., 2003 47 с.

2. Альберт А. Избирательная токсичность. Физико-химические основы терапии. М.: Медицина, 1989. Т. 1. 400 с.

3. Белоконь Е.М. Методические указания к определению мутагенной активности химических препаратов на дрозофиле. Львов: ЛГУ, 1984. 26с.

4. Дурнев А.Д. Середенин С.Б. Мутагены. Скрининг и фар-

макологическая профилактика воздействий. М.: Медицина 1998 327с.

5. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990 351 с.

6. Машковский М.Д Лекарственные средства. Вильнюс: Изд-

во ЗАО «Гамта» 1994a Т.1 543 с.

7. Машковский М.Д Лекарственные средства. - Вильнюс:

Изд-во ЗАО «Гамта» 1994b Т.2 527 с.

8. Овчинников ЮА. Биоорганическая химия. М.: Просвеще-

ние, 1987 815 с.

9. Северин С. Е. Проблема биологической активности при-

родных соединений имидазола. // Успехи современной биологии. 1965 Т. 59. С. 165-186.

10. Цырлин В А. Кузьменко НВ., Плисе М.Г. Роль имидазо-линовых рецепторов в центральной регуляции кровообращения (история и современное состояние вопроса). // Вестник аритмологии, 2001 №21. С.18-23.

11. Emsberger P, Graves ME, Graff LM, Zakieh N, Nguyen P, Collins LA, Westbrooks KL, Johnson GG. I1-imidazoline receptors. Definition, characterization, distribution, and transmembrane signaling //Ann N Y Acad. Sci., 1995 - 763 -p.22-42.

12. Ross M.H. Cytogenetics of Blatella germanica: comparison of an insecticide-resistant and insecticide-susceptible field strain // Can. J. Genet. and Cytol. 1986. V. 28, №5. 835-843 pp.

THE PHYSICO-CHEMICAL FEATURES OF IMIDAZOLIDES, THEIR MUTAGENIC ACTIVITY AND DROSOPHILA MELANOGASTER ABILITY TO ADAPT TO THEM

© 2009 E.S. Selezneva, E.I. Tenjgayev, A.V. Shpilko

Samara State University

It was shown that imidazole and its methyl and sulphuril derivates differ on their ability to induce dominant lethal mutations in Drosophila melanogaster imago both in toxic and sub-lethal doses. The mutagenic activity correlated with molecular mass, volume and sum dipole moment of tested substances. The short action of non-toxic imidazolides on Drosophila melanogaster imago did not developed the adaptations decreasing the mutagenic effects of substances. The long-term action of non-toxic doses in larval period of Drosophila melanogaster led to development of adaptive answer expressed in valuable decrease of dominant lethal mutations induced by sub-lethal doses of these substances in comparing with the number of mutations induced by right substances action. The preliminary short or long-term action of non-toxic inimazole doses did not develop the adaptive answer in Drosophila melanogaster in the case of sub-lethal dose. The role of physico-chemical parameters of imidasolides in adaptive answer development.

Key words: Drosophila melanogaster, adaptations, preadaptations, imidazolides, dominant lethal mutations, correlations, physic-chemical parameters

Selezneva Elena Sergeevna, Candidate of Biology, genetics and ecology. E-mail: [email protected]. Elena Sergeevna, Candidate of Biology, senior [email protected]. Shpilko Alexandr Vladimirovich,

senior lecturer of department zoology, Ten'gaev Evgeniy Ivanovich, Selezneva lecturer of also department. E-mail: student.