CC BY
42
ПРОБЛЕМЫ ПРИКЛАДНОЙ ЭКОЛОГИИ
УДК 575.24
О ГЕНОТОКСИЧНОСТИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИДОВ
© 2000 Е.С. Селезнева1, З.П. Белоусова1, Т.В. Макарова2
1 Самарский государственный университет 2 Самарский муниципальный университет Наяновой
Анализировали генотоксичность синтезированных модифицированных аналогов нуклеозидов: 1-0 -Б-рибофуранозилбензотриазол(1), 1 -Р-Б-рибофуранозилбензоимидазол(11), 1 -b-D-эритрофурано-зилбензоимидазол (III). Обнаружили, что все синтезированные соединения индуцируют рецессивные и доминантные летальные мутации у Drosophila melanogaster, ингибируют бласттрансформа-цию ядер лимфоцитов периферической крови человека и понижают фертильность самок и самцов Drosophila melanogaster. Обсуждается возможность влияния синтезированных соединений на клеточное деление.
В медицине широко используются модифицированные нуклеозиды как антибактериальные и антивирусные препараты [3,8]. Между тем давно известно, что многие из них проявляют генотоксичность так как представляют собой модифицированные предшественники ДНК. Так 4,6-ами-ноурацил индуцирует хромосомные аберрации у У1с1а ГаЪа; 8-азагуанин и 8-азати-мин являются сильными метастатиками для животных клеток; 5-бромурацил - специфический мутаген для прокариот [9]. Аналоги пурина - кофеин, ксантин, ксантозин индуцируют гетероплоидию [7].
Высокая потребность в новых фармакологических препаратах побуждает синтезировать новые модифицированные нуклеозиды, которые необходимо подвергнуть генетическому мониторингу.
Были синтезированы аналоги нуклеозидов: 1-Р-Б-рибофуранозилбензотриазол
(I), 1 -Р-Б-рибофуранозилбензоимидазол
(II), bb-D-эритрофуранозилбензоимидазол
(III), структурные формулы которых приведены на рисунке 1.
Мы предположили, что структурное сходство синтезированных соединений (I,II, III) с природными пуринами послужит причиной появления у них генотоксичных свойств.
Мутагенную активность определяли по способности веществ индуцировать рецессивные и доминантные летальные мутации у дрозофилы [2, 4], а также индуцировать хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови человека [5]. Токсичность веществ определяли по ингибированию бла-сттрансформации лимфоцитов периферической крови человека, стимулированные к клеточному делению ФГА, а также по способности веществ снижать фертильность Drosophila melanogaster.
При анализе мутагенной активности I -III использовали в дозеLD50, которая была
(I)
(II)
(III)
Рис.1. Структурные формулы синтезированных веществ
Таблица 1. Способность веществ индуцировать доминантные летали у имаго РговорИНа те!аподав1ег
Вещество Процент доминантных леталей у самок Процент доминантных леталей у самцов
I 11,04 ± 1,03 9,59 ± 1,02
II 9,20 ± 1,83 8,80 ± 1,08
III 8,94 ± 0,46 9,41 ± 0,46
контроль 3,12 ± 0,67 3,04 ± 0,46
предварительно определена и для имаго Drosophila melanogaster составила для I и II - 1/ 4 от насыщенного водного раствора, для III-1/2 от насыщенного водного раствора. Время воздействия мутагенами - 30 часов.
Для анализа способности I - III индуцировать доминантные летали растворами синтезированных соединений воздействовали либо на самок (900 штук), либо на самцов (900 штук), которых затем скрещивали с интакт-ными особями противоположного пола. Число доминантных летальных мутаций (ДЛМ) оценивали по количеству яиц из которых не вылуплялись личинки. Кладки яиц собирались в течение суток каждые 5 часов.
Результаты эксперимента суммированы в таблице 1.
Статистический анализ с использованием критериев Стьюдента и Фишера показал, что все синтезированные соединения достоверно (для P>99%) индуцируют доминантные летали в опыте по сравнению с контролем. Мы не обнаружили достоверных отличий в действии веществ на самок и самцов, кроме того все веществ индуцировали приблизительно одинаковое количество доминантных летальных мутаций.
Способность I - III вызывать рецессивные летальные мутации в Х-хромосомах самцов Drosophila melanogaster определяли стан-
дартными методом "Меллер-5". Результатом исследования представлены в таблице 2.
Проведенный статистический анализ не выявил отличий между действием веществ, но показал что все вещества достоверно индуцируют рецессивные летальные мутации у самцов Drosophila melanogaster для P>99%.
Анализ способности веществ индуцировать хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови человека, показал что в концентрации, не вызывающей гемолиз эритроцитов - 0,001%, соединения не проявляют мутагенный эффект. Было проанализировано 200 препаратов. Ни в одной из проанализированных нами мета-фазных пластинок мы не обнаружили хромосомных перестроек.
Отсутствие мутагенного ответа на уровне клеточной культуры не говорит о специфичности действия данных веществ, так как на уровне целого организма многие вещества, не проявившие мутагенную активность, проходят дополнительную активацию и становятся мутагенами. Ферментативные системы Drosophila melanogaster обладают такими свойствами, и поэтому рекомендованы для генетического мониторинга. Кроме того, они обладают ферментативной активностью, сходной с таковой у микросомальной фракции ферментов печени млекопитающих, где и про-
Таблица 2. Способность аналогов нуклеозидов индуцировать рецессивные летали в Х-хромосомах самцов Drosophila melanogaster
Вещества Число проанализир ованных хромосом Процент рецессивных леталей
I 1200 3,06 ± 0,99
II 1009 2,85 ± 0,39
III 1100 2,87 ± 0,36
контроль 1150 0,16 ± 0,28
Таблица 3. Способность модифицированных нуклеозидов подавлять бласттрансформацию ядер лимфоцитов периферической крови человека
Вещества Число бласттрансформированных ядер лимфоцитов (в %) в культурах, обработанных соединениями в концентрациях
0% 0,001% 0,0001%
I 94,80 і 1,90 83,00 і 1,10 87,40 і 1,22
II 95,11 і 1,89 73,80 і 1,50 81,80 і 1,50
III 94,78 і 1,90 80,91 і 1,34 85,20 і 1,41
исходит метаболическая активация веществ, и, следовательно, синтезированные нами соединения могут проявить мутагенную активность и в тестах на млекопитающих.
При анализе числа бласттрансформиро-ванных ядер мы обнаружили цитостатичес-кий эффект действия исследуемых аналогов нуклеозидов (табл.3). Результаты анализа цитотоксичности представлены в таблице 3.
Все вещества ингибируют бласттранс-формацию ядер (различия между опытом и контролем достоверны для Р>99%). Разведение в 10 раз не снижает цитотоксического эффекта, кроме того соединения проявляют равное ингибирующее действие.
Так как полученные нами результаты говорят о наличии у I - III генотоксических свойств, то мы предположили, что могут ингибировать и фертильность у тест-объекта. Для этого 1600 самок и самцов, подвергнутых воздействию токсикантов, скрещивали с интактными особями противоположно-
Изменение количества отложенных яиц при воздействии токсикантами на имаго дрозофилы
1200
1000
B00 600 400 200
□ самки
□ самцы
1- 1-р -D-рибофуранозилбензотриазол,
2- 1-р -D-рибофуранозилбензоимидазол,
3- 1-р -D-эритрофуранозилбензоимидазол,
4- контроль
Puc.l. Результаты анализа влияния веществ на фертильность дрозофилы
го пола. Каждые 5 часов подсчитывали число отложенных яиц. Мы обнаружили, что у самок и самцов Drosophila melanogaster снижается количество отложенных яиц (рис.1).
Статистический анализ показал, что вещества достоверно снижают фертильность Drosophila melanogaster , причем если I равнотоксичен как для самок, так и для самцов, у которых в равной степени падала фертильность, то II сильнее подавлял фертильность у самцов, а III - у самок (P>95%). Снижение фертильности по нашему мнению является косвенным показателем эмбриотоксичности исследуемых веществ.
Проведенное исследование показало, что все изученные аналоги нуклеозидов обнаружили генотоксичность и это позволяет предположить, что причиной геноток-сичности служит нарушение процессов клеточного деления. В пользу этого предположения говорят данные полученные другими авторами [1, 6], показавшими, что аналоги предшественников ДНК нарушают нормальную репликацию и таким образом подавляют или изменяют отдельные стадии клеточного деления.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. М.: Мир, 1978.
2. Белоконь Е.М. Методические указания к определению мутагенной активности химических препаратов с помощью тестов на дрозофиле. Львов: ЛГУ, 1984.
3. Ильинских Н.Н., Медведев М.А., Бессуд-нова С.С., Ильинских И.Н. Мутагенез при различных функциональных состояниях организма. Томск: Томский университет, 1990.
З4б
4. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных свойств химических веществ. Женева: ВОЗ, 1989.
5. Хрущов Г.К., Андрес А.Г., Ильина-Какуе-ва В.И. Культура лейкоцитов крови как метод изучения кариотипа человека // Жур-н.эксп.биол. 1931. Т.7. №4.
6. Hung Peng, Siciliano Michael J, Plancet William. Gene deletion, a mechanism of induced mutation by arabinosyl nucleosides.
// Mutat.Res. 1989. №2.
7. Mehra P.N.,Dhiman N. Induced meiotic reductions in roottips. I. Effect of purine derivatives // Cytologia, 1986. V.51. №3.
8. Smith r., Kirkpatrik N. Ribavirin a broad spectrum antiviral agent, N-Y: Academic. Press. 1980.
9. Stoian V., Raicu P. Chromatid aberrations induced by some purine and pyrymidine derivatives in Vicia faba // Rev. roum. biol. Ser. bot. 1973. V.18.
ABOUT GENOTOXICITY OF MODIFIED NUCLOSIDES
© 2000 E.S. Selesneva1, Z.P. Belousova1, T.W. Makarova2
1 Samara State University
2 Najanova’s University, Samara
It was analysed the genotoxicity of synthetic modified analogs of the nucleosides: 1-0-D-ribofuranozilbenzotriazol (I), 1-P-D-ribofuranozilbenzoimidazol (II), 1-b-D-eritrofuranozilbenzoimidazol (III). It was founded that all synthetic compounds induce the recessive and dominant lethal mutations of Drosophila melanogaster, inhibit the blasttransfomation of lymphocyte nucleoses in the periferic human blood, decrease the fertility of females and males of Drosophila melanogaster. The possibility of the influencing of synthetic compounds on the cell division is discussed.
