CC BY-ND
17
ВЛИЯНИЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ДЕТЕРГЕНТОВ НА СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ
В.А. Телегин
INFLUENCE OF NITROGENATED DETERGENTS ON THE STATE OF MEMBRANES IN TOXICOLOGICAL EXPERIMENT
V.A. Telegin
Управление Роспотребнадзора по Белгородской области
Целью работы являлось изучение структурно-функционального состояния мембран в условиях подострого воздействия на организм белых крыс популяции Вистар новой группы ксенобиотиков на основе полиоксипро-пиленполиолов и обоснование максимально недействующей дозы ксенобиотиков.
The aim of the present work was to study structural and functional state of membranes in the conditions of subacute influence on the body of white rats (Vistar population) of a new group of xenobiotics the basis of polyoxypropylene polyols as well as the substantiation of maximum non-treating dose of xenobiotics.
Постоянно идущие процессы синтеза и распада сложных биоорганических веществ обусловливают стабильность весьма лабильных структур организма, их воспроизводство, обновление и умножение, необходимые для поддержания гомеостаза, ведущим фактором в котором выступает метаболизм. Многочисленные пути метаболизма тесно связаны между собой и лежат в основе всех важнейших функций, характерных для организма [1].
Известно, что предпатологическое и патологическое состояние проявляется функцио-
нальной или структурной дезорганизацией мембрано-структурированых метаболических систем [1, 2]. Среди причин изменения структуры и функции мембран при действии токсических веществ важное место занимает усиление свободнорадикальных процессов и пере-кисного окисления липидов [2], приводящие к разрушению мембранных систем, модификации клеточных белков и развитию ряда патологических состояний [3].
В связи с тесным единством структуры, функции и метаболизма поиск критериально-
№11 (200) ЗНиСО
41
Таблица 1. Влияние ксенобиотиков на интенсивность БХЛ сыворотки крови в подостром периоде под влиянием 1/1 000 ДЛ50 на 45-е сутки наблюдения
Вид БХЛ Группа животных, М ± m
контроль Л-803 Л-С705 Л-10002-2-80
СХЛ 126,7 ± 8,4 230,4 ± 7,2* 244,8 ± 6,2* 265,3 ± 8,6*
Н2О2 - ИХЛ 735,2 ± 14,6 1 479,5 ± 22,3* 1 483,6 ± 28,5* 1 523,7 ± 22,3*
FeCl3 - ИХЛ 658,3 ± 12,7 1 830,4 ± 25,6* 1 794,3 ± 31,6* 1 815,7 ± 36,5*
Люминолзависимая Н,О2 -ИХЛ 1 780,6 ± 27,3 3 252,6 ± 40,8* 3 386,2 ± 60,7* 3 375,8 ± 53,4*
Люминолзависимая FeClз — ИХЛ 1 640,5 ± 23,8 3 163,8 ± 54,2* 3 215,4 ± 44,6* 3 260,7 ± 48,2*
Примечание: * — различия достоверны р < 0,05.
значимых показателей предпатологического состояния организма следует проводить, прежде всего, изучая структурно-функциональное состояние клеточных мембран и механизмов регуляции жизнедеятельности органов-мишеней [2].
Целью работы являлось изучение структурно-функционального состояния мембран в условиях подострого воздействия на организм белых крыс популяции Вистар новой группы ксенобиотиков на основе полиоксипропилен-полиолов и обоснование максимально недействующей дозы ксенобиотиков.
Материалы и методы исследования
Объектами исследования являлась новая группа веществ, имеющая товарное название «Лапролы» и «Лапролаты» с регламентированными физико-химическими свойствами. Изу-
чению подверглись следующие марки соединений: Лапролат-803 (Л-803), Лапрол С-705 (Л-С705) и Лапрол-10002-2-80 (Л-10002-2-80), которые широко используются в различных отраслях народного хозяйства. Учитывая физико-химические свойства полиолов и способность их обладать поверхностно-активным действием, можно допустить влияние ксенобиотиков на белковые и липидные компоненты клеточных мембран, что и определило программу исследований, которая предусматривала изучение мембранных фракций фосфоли-пидов, ионной проницаемости мембран, их вязкость, заряд, полярность, свободноради-кальных процессов, перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков в соответствии с методическими рекомендациями [3, 4]. Согласно литературным данным, интенсивность биохемилюми-
Таблица 2. Интенсивность фосфоресценции сыворотки крови животных, подвергавшихся воздействию ксенобиотиков 1/1 000 ДЛ50 в подостром опыте
Спектры возбуждения (Нм) Группа животных, М ± m
контроль Л-803 Л-С705 Л-10002-2-80
297 4 280,3 ± 72,5 4 620,3 ± 68,3* 4 735,6 ± 55,8* 4 699,7 ± 43,5*
313 3 268 ± 36,3 3 840,5 ± 49,6* 3 796,4 ± 36,7* 3 815,6 ± 27,2*
334 635,4 ± 22,5 830,7 ± 17,2* 788,3 ± 14,5* 815,4 ± 16,3*
365 1 895,6 ± 37,2 2 016,5 ± 22,7* 2 026,2 ± 18,3* 2 205,8 ± 23,7*
404 453,2 ± 14,4 639,2 ± 13,8* 610,7 ± 16,8* 627,3 ± 19,6*
434 610,3 ± 17,6 897,4 ± 12,9* 920,4 ± 21,6* 915,2 ± 16,4*
Примечание: * — различия достоверны р < 0,05.
42
ЖРШ 1 (200)
Таблица 3. Влияние 1/100 ДЛ50 полиоксипропиленполиолов на процентное содержание фракций фосфолипидов в эритроцитах
Показатели, % Вещества, М ± т
контроль Л-803 Л-С705 Л-10002-2-80
ФЭА 21,2 ± 1,6 14,8 ± 1,12* 16,3 ± 1,25* 17,5 ± 1,12*
ФХ 41,4 ± 1,3 58,2 ± 2,3* 54,7 ±2,62* 53,4 ±2,35*
СМ 14,2 ± 1,1 10,2 ± 0,46* 9,15 ±0,72* 8,65 ±0,54*
ФС 11,6 ±0,5 7,1 ±0,54* 7,60 ±0,43* 7,38 ±0,46*
ЛФЭА 1,1 ±0,3 3,5 ±0,26 3,20 ±0,35* 4,15 ±0,52*
ЛФХ 1,4 ±0,4 3,3 ±0,40* 3,6 ±0,27* 4,26 ±0,36
ФИ 6,1 ±0,7 0,89 ±0,06* 0,94 ±0,08* 1,27 ±0,13*
КЛ 0,52 ±0,08 0,91 ±0,03* 0,87 ±0,04 0,76 ±0,05*
Примечание: * — различия достоверны р < 0,05.
несценции (БХЛ) в системе индуцированной перекисью водорода отображает образование наиболее реакционноспособных радикалов (ОН —гидроксильного, 02 — супероксидного анион-радикала кислорода), с которыми взаимодействуют биологические субстраты — белки, липиды, нуклеиновые кислоты и др. [4]. Они инициируют цепной свободнорадикаль-ный процесс, перекисное окисление липидов, протекающие в мембранах клеток, а также ли-попротеинах крови.
Подострый опыт проведен на белых половозрелых крысах популяции Вистар, которым ежедневно — утром натощак внутрижелудочно с помощью металлического зонда, вводились растворы веществ из расчета 1/10; 1/100; 1/ 1 ООО; 1/10 ООО ДЛ50. Продолжительность эксперимента составляла 45 дней. Постановка опыта и наблюдение за функциональным состоянием животных осуществлялось в соответствии с методическими рекомендациями [7, 8]. В экспериментальной части работы использовано 89 белых крыс. Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием критерия Стьюдента-Фишера.
Результаты исследований и их обсуждение
Исследование свободнорадикальных процессов и ПОЛ обнаружило повышение в подо-стром опыте спонтанной (СХЛ) и индуцированной (ИХЛ) хемилюминесценции сыворотки крови, цельной крови и гомогенатов внут-
ренних органов и тканей экспериментальных животных, подвергавшихся воздействию перо-рально 1/10; 1/100; 1/1 000 и 1/10 ОООДЛ50. Наиболее высокие различия интенсивности биохе-милюминесценции наблюдалось при индукции свободнорадикальных процессов лю-минолом и в меньшей степени перекисью водорода и хлорным железом (табл. 1). Недействующей была 1/10 000 ДЛ50.
Результаты исследований свидетельствуют, что ксенобиотики являются индукторами свободнорадикальных процессов и ПОЛ, которые сопровождаются генерацией активных форм кислорода и накоплением гидроперекисей, перекисей, свободных радикалов в условиях истощения антиоксидантной системы (АОС). Известно, что активация оксидативной системы на фоне игибирования АОС, способна привести к развитию в организме структурно-метаболичес-ких нарушений, которые формируют мембранную патологию. Повышение уровней интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции, индуцированной Н202 и РеС13, подтверждает цепной свободнорадикальный характер происходящих изменений в биологических системах, которые впоследствии активируют перекисное окисление липидов. Исследования показывают, что в условиях интоксикации ксенобиотиками образуется супероксидный анион-радикал кислорода и гидроксильный радикал, что свидетельствует о наличии высоких уровней возбужденных электронных состояний в биосистемах. Наличие высоких уровней триплетных
ЖРШ 1 (200)
43
Таблица 4. Влияние ксенобиотиков на текучесть мембран (коэффициент эксимеризации А,-испуск.-470 нм/А,-испуск.-393 нм) под воздействием 1/100 ДЛ50
Вещества Показатели, М ± т
Лимфоциты Эритроциты
Белок-липидные контакты Липидный белок Белок-липидные контакты Липидный белок
контроль 3,75 ±0,21 3,62 ±0,14 2,95 ±0,08 2,92 ±0,04
фом 9 1,82 ±0,06* 1,95 ±0,12* 1,43 ±0,07 1,56 ±0,08*
фом 9—4 1,78 ±0,04* 2,10 ±0,09* 1,54 ±0,06* 1,43 ±0,09*
фом 9—12 1,83 ±0,09* 2,15 ±0,11* 1,37 ±0,04* 1,52 ±0,06*
Примечание: * — различия достоверны р < 0,05.
возбужденных состояний, обусловленных не-спаренными электронами может свидетельствовать об изменении конформации белковых молекул, присутствующих в сыворотке крови, связанных с окислительной их модификацией под влиянием ксенобиотиков. Изучение интенсивности фосфоресценции сыворотки крови опытных групп животных выявило существенные различия их уровней при длинах волн возбуждения 297, 313, 334, 365, 404, 434 нм. Особенно значительным было повышение интенсивности фосфоресценции в длинноволновой (к = 434 нм) и коротковолновой (к = 297 нм) областях возбуждения (табл. 2).
Результаты проведенного эксперимента показывают, что при субхроническом воздействии на организм ксенобиотиков происходит увеличение в системах молекул, находящихся в триплетном возбужденном состоянии, т. е. имеющих два неспаренных электрона. Эти молекулы имеют большую продолжительность жизни и лишь по истечении сравнительно большого отрезка времени (10~4—10~2 с) излучают свет и переходят на низкий невозбужденный синглетный уровень [4, 6, 9]. Проявление в длинноволновой области возбуждения повышенного количества молекул в триплетном состоянии может, по всей видимости, свидетельствовать о разобщении окислительного фосфо-рилирования и тканевого дыхания, которое сопровождается увеличением рассеивания тепла в организме экспериментальных животных под воздействием исследуемых химических веществ. В 1/10 ООО ДЛ50 изменения уровней фосфоресценции у опытных групп животных не наблюдалось.
Наличие высоких уровней триплетных возбужденных состояний, обусловленных присут-
ствием неспаренных электронов, может свидетельствовать об изменении конформации белковых молекул [4, 9], присутствующих в сыворотке крови, что неизбежно связано с нарушением структурно-метаболических процессов и развитием тканевой гипоксии. Исследования обнаружили активацию под воздействием ксенобиотиков окислительных процессов, формирующих развитие в организме дистрофических и деструктивных нарушений со стороны клеточных и внутриклеточных структурно-функ-циональных единиц. Следует отметить, что на фоне увеличения уровней интенсивности био-хемилюминесценции и фосфоресценции, отмечалось повышение содержания в сыворотке крови и печени малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов в опытных группах животных под влиянием 1/0 и 1/100 ДЛ50 (Р < 0,05). 1/1 000 ДЛ50 испытуемых веществ не оказывала влияние на динамику продуктов ПОЛ в эксперименте.
Для изучения фосфолипидного состава определяли фосфатидилхолин (ФХ), сфингоми-елин (СМ), фосфатидилсерин (ФС), лизофос-фатидилэтаноламин (ЛФЭА), лизофосфати-дилхолин (ЛФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭА), фосфатидилинозитол (ФИ), фосфатид-ную кислоту (ФК) и кардиолипин (КЛ).
Результаты исследования выявили, что вещества в 1/10 и 1/100 ДЛ50 существенно нарушили динамику процентного содержания фракций фосфолипидов мембран гепатоцитов, эритроцитов, спленоцитов и лимфоцитов. Действие ксенобиотиков на мембранные фосфоли-пиды различных тканей было сходным. Общим и характерным признаком этих изменений в структуре мембран являлось появление лизоформ фосфолипидов — ЛФХ и ЛФЭА, что слу-
44
ЖРШ 1 (200)
Таблица 5. Влияние ксенобиотиков в подостром опыте на окислительную модификацию белков в 1/100 ДЛ
Вещества Показатели, М ± т
2,4 -динигрофенилальдогидразаны, ед. опт. платн/г белка, к = 380 нм 2,4 -динитрокетогидразоны ед. опт. платн/г белка, 1 = 380 нм
контроль 22,46 ± 1,57 24,80 ±2,10
Л-803 45,63 ± 2,24* 48,25 ±2,78*
Л-С705 46,24 ± 1,85* 47,31 ± 1,96*
Л-10002-2-80 44,52 ± 1,76* 46,58 ±2,15*
Примечание: * — различия достоверны р < 0,05.
жило важным доказательством структурных нарушений и появления высокотоксичных метаболитов обмена липидов. Вместе с тем, следует отметить, что ксенобиотики, снижая процентное содержание фосфатидилсерина в эритроцитах и лейкоцитах, не изменяли его уровни в гепатоцитах и спленоцитах. Наиболее существенные изменения соотношения фракций фосфолипидов наблюдались в эритроцитах, что связано, по всей вероятности, с их низким уровнем репаративных и синтетических процессов, происходящих в мембранах этих безъядерных клеток, которые сопровождались значительным накоплением изоформ фосфолипидов (табл. 3).
В ходе проведенного исследования установлено, что вещества по окончании под острого опыта приводили к снижению текучести мембран и коэфициента эксимеризации пирена в цитоплазматической мембране клеток по сравнению с уровнем контрольной группы животных. Этому процесу в большей степени были подвержены эритроцитарные мембраны, в которых значительные изменения установлены в
липидном бислое и в зоне бело-липидных контактов. В зависимости от дозы воздействия веществ текучесть мембран снижалась до 60 % (табл. 4).
В лимфоцитах снижение текучести мембран затрагивало преимущественно липидный бислой и было максимальным под воздействием 1/10 ДЛ10. Кроме того, следует отметить, что испытуемые ксенобиотики повышали и погруженность белков в липидный бислой мембран эритроцитов и лимфоцитов. В большей мере эти изменения касались также мембран эритроцитов.
Установленные нарушения структурно-функционального состояния мембран можно экстраполировать на активность мембрано-структурированных ферментов, выполняющих важную транспортную функцию субстратов обмена, а также ионов металлов, что является прогностически значимым показателем изменения внутриклеточного метаболизма под воздействием изучаемых препаратов.
Интенсивность флуоресценции 1-анилина-8-нафталинсульфата (1,8-АНС-флуоресцент-
Таблица 6. Влияние ксенобиотиков в подостром опыте на самопроизвольный и индуцированный валиномицином выход ионов К+ из эритроцитов, мин
Вещества Исследуемые показатели, М ± т
Скорость самопроизвольного выхода ионов К+ из эритроцитов Скорость индуцированного выхода ионов К+ валиномицином из эритроцитов Суммарное количество ионов К+ на 1 млн эритроцитов
контроль 0,52 ±0,017 6,2 ±0,28 17,54 ± 1,53
Л-803 6,78 ±0,34* 14,95 ± 1,16* 93,46 ±4,28*
Л-С705 6,80 ±0,45* 15,18 ± 1,43* 91,37 ±5,12*
Л-10002-2-80 6,63 ±0,58* 15,72 ± 1,24* 90,58 ±4,16*
Примечание: * — различия достоверны р < 0,05.
mm Hiii (200)
4E
ный зонд) в лимфоцитах и эритроцитах, отражающая изменение поверхностного заряда плазматических мембран, существенно снижалась в группах опытных животных. Падение уровня флуоресценции может свидетельствовать о том, что исследуемые вещества способны приводить к развитию гиперполяризации клеточных мембран и изменению их физико-химичес-ких свойств. В зависимости от дозы воздействия падение уровня интенсивности флуоресценции находилось в интервале от 30 до 96 %.
Пероральное поступление в организм исследуемых веществ в дозе 1/10 и 1/100 ДЛ50 стимулировало окислительную модификацию белков, которая подтверждалась повышением содержания в сыворотке крови альдо- и кето-гидразонов (табл. 5), что являлось также свидетельством активации ПОЛ.
Эти данные убедительно свидетельствуют, что исследованные ксенобиотики активируют не только перекисное окисление липидов, но и перекисное окисление белковых структур. Длительное воздействие их в условиях под-острого опыта сопровождалось глубокими нарушениями физико-химических свойств мембран, в т. ч. ионной проницаемости. Исследования выявили, что препараты повышали в испытанных дозах 1/10 и 1 /100 ДЛ50 самопроизвольный и индуцированный валиномицином выход ионов К+ из эритроцитов, что также, в комплексе с обнаруженными изменениями, свидетельствовало о нарушении струкрурно-функциональной организации их мембран (табл. 6). Потоки самопроизвольного выхода ионов К+ возрастали в сравнении с контрольной группой наблюдения в 6—9 раз, в зависимости от дозы воздействия. В меньшей степени ксенобиотики изменяли индуцированный валиномицином выход ионов К+, при котором показатели у опытных групп превышали контроль в 2,0—2,2 раза.
Анализ изучения влияния новой группы химических веществ на структурно-функцио-нальное состояние цитоплазматических мембран позволил сделать следующие выводы:
1. ЛапролымарокЛ-803,Л-С705иЛ-10002-2-80 в условиях перорального подострого воздействия 1/10 и 1/100 ДЛ50 стимулируют свобод-норадикальные процессы, перекисное окисление липидов и окислительную модификацию белков, что сопровождалось значительным накоплением в сыворотке крови МДА, диенов, 2,4-динитрофенилальдо- и кетогидразонов.
2. Исследованные ксенобиотики способны в 1/10 и 1/100 ДЛ50 нарушать физико-химичес-кие и структурно-метаболические свойства цитоплазматических мембран — их полярность, проницаемость, вязкость, заряд, гидрофобный объем, что неизбежно приводит к изменению внутриклеточного метаболизма и развитию дистрофических и деструктивных процессов в разных органах и тканях. Недействующей во всех случаях подострого опыта являлась доза 1/1 ОООДЛ50. Наиболее чувствительным при диагностики мембранной патологии оказался метод БХЛ, позволяющий определить струк-турно-метаболическую перестройку в организме и под воздействием 1/1 000 ДЛ50, что обеспечивает надежность установленных пороговых и недействующих доз.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Губский Ю.И. Перекисное окисление мембранных липидов и его регуляция при химическом поражении печени //Коррекция химического поражения печени. Киев: Здоровье, 1989. С. 93-113.
2. Владимиров Ю.А. Чем болеют и от чего умирают клетки //Наука в СССР, 1989. № 2. С. 76-81.
3. Цыганенко А.Я., Шаповал Л.Г. и др. Ток-сиколого-гигиеническая характеристика органических смесей на основе гликолей в связи с проблемой санитарной охраны водоемов. Белгород, 2001. 147 с.
4. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 1980. 320 с.
5. Дубинина Е.Е., Бурмистрова P.O. и др. Окислительная модификация белка. Методы ее определения //Вопросы мед. химии, 1996. Т. 41. Вып. 1.С. 24-26.
6. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. 320 с.
7. Красовский Г.Н. Среднее эффективное время гибели животных как параметр для прогнозирования хронической токсичности веществ //Гигиена и санитария, 1982. № 7. С. 12-14.
8. Елизарова О.Н. Определение пороговых доз промышленных ядов при пероральном введении. М.: Медицина, 1971. 173 с.
9. БашкатоваВ.Г, КосачеваЕ.С., МикоянВ.Д. Прямое измерение окиси азота в мозге крыс методом электронного парамагнитного резонанса при различных конвульсиях //Докл. РАН, 1996. Т. 348 № 1.
С. 119-120. ♦-
