CC BY
193. Pavlenko, O.B. Lechebnaja jeffektivnost' biologicheskogo preparata pri subklinicheskom mastite u korov [Medical efficiency of biological medicine at subclinical mastitis at cows] / O.B.Pavlenko, B.A.Bulycheva // Jekologicheskie problemy v sel'skohozjajstvennom proizvodstve: materialy molodezhnoj nauchnoj konferencii. - Donskoj gosudarstvennyj agrarnyj universitet, 2002. - P. 92-93.
4. Pavlenko, O.B. Morfofunkcional'noe obosnovanie primenenija probiotikov pri subklinicheskom mastite u korov [Morfofunktsionalny justification of application of probiotics at subclinical mastitis at cows]: abstract from dissertation for Doctor of Veterinary Medicine: 06.02.06 / Pavlenko Ol'ga Borisovna. - Novocherkassk, 2016. - 45 p.
5. Parikov, V.A. Razrabotka i sovershenstvovanie metodov diagnostiki, terapii, profilaktiki mastita u korov [Development and improvement of diagnostic methods, therapies, prophylaxes of mastitis at cows]: dis. v forme nauch. dokl.d-ravet.nauk: 16.00.07 / V.A.Parikov. - Voronezh, 1990. - 52 p.
6. Parikov, V.A. Sostojanie i perspektivy issledovanij po lecheniju i profilaktike mastita u korov [State and prospects of researches on treatment and prophylaxis of a mastitis at cows] / V.A.Parikov // Materialy vserossijskoj nauchnoj i uchebno-metodicheskoj konferencii po akusherstvu, ginekologii i biotehnike razmnozhenija zhivotnyh. - Voronezh, 1994. - P. 223-224.
7. Podbereznyj, V.V. Bioterapija i bioprofilaktika mastita u korov [Biotherapy and bioprevention of mastitis at cows]: abstract from dissertation for Doctor of veterinary Medicine: 16.00.07 / V.V.Podberjoznyj. - Voronezh, 1995. - 45 p.
8. Poljancev, N.I. Mastit u korov v suhostojnyj period i zabolevaemost' teljat dispepsiej [Mastitis at cows during the sukhostoyny period and incidence of calf's of dyspepsia] / N.I.Poljancev, L.G.Podkujko // Veterinarija. - 1987. - № 3. - P. 62-65.
9. Rasputina,O.V. Jetiopatogeneticheskie osobennosti i terapija massovyh boleznej korov i teljat [Etiopatogenetichesky features and therapy of mass diseases of cows and calfs] / O.V.Rasputina, M.N.Shadrina, N.A.Shkil' // Diagnostika, profilaktika i lechenie boleznej zhivotnyh: In-t jeksperim. veterinarii Sibiri i Dal. Vostoka. - Novosibirsk, 2008. - P. 56-60.
10. Jurina, N.A. Ispol'zovanie kormovyh dobavok «Sporotermin» i «Kovelos-sorb» v racionah zhivotnyh [Use of Sporotermin and Kovelos-sorb feed additives in diets of animals] / N.A.Jurina [et al.] // Sbornik nauchnyh trudov Severo-Kavkazskogo nauchno-issledovatel'skogo instituta zhivotnovodstva. - 2014. - Vol. 2, № 3. - P. 255-260.
УДК 619:611.018.54:59.111
ВЛИЯНИЕ АПИФИТОПРЕПАРАТА НА МИКРОБНЫЕ КОНТАМИНАНТЫ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СРЕД
З.Г.Чурина - соискатель.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань (420075, г.Казань, Научныйгородок-2, тел.+7(843) 239-53-20, e-mail: vnivi@mail.ru).
Целью работы явилась оценка антимикробной активности биополимера - хитозана и хитинсодержащего препарата - апифитоэкстракта, полученного на основе биологически активных продуктов пчеловодства (БАПП). Биополимерхитозан был получен из ООО «Фармакор» (Санкт-Петербург), а апифитоэкстракт (АФЭ) - из биологически активной композиции «Вита-Форце» путем этанолового экстрагирования хитинсодержащего препарата. В качестве тест-микробов использовали мезофильные аэробные и факультативно анаэробные микробы (КМАФиМ), выделенные из мышечных экстрактов коров, используемых в биотехнологии для культивирования клеток при производстве вирусных вакцин. Для изучения антимикробного действия, из испытуемых препаратов готовили 0,1-1,0%-ные растворы хитозана и апифитоэкстракта, которые вносили в пробирки, содержащие КМАФиМ в концентрации 2*10 КОЕ/мл и оставляли на 1-48 ч при температуре 22'С. По истечении указанных экспозиций производили посевы из микробных суспензий с испытуемыми препаратами на МПБ и МПА, подсчитывая количество выживших микроорганизмов. Результаты микробиологических исследований показали, оба испытанных препарата обладали достаточно высокой бактерицидной активностью, вызывая гибель тест-микробов через 24 ч после контактирования с 0,44%-ным (хитозан) и 1%-ным (АФЭ) растворами на испытуемых агентах. Таким образом, апифитоэкстракт на основе БАПП обладает высокой антибактериальной активностью и безвредностью и может применяться в качестве антимикробного агента при культивировании клеток взамен антибиотиков - деконтаминантов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: культура клеток, культуральные питательные среды, апипрепараты, биополимеры, хитин,хитозан.
В настоящее время непрерывно происходит расширение области применения биополимеров, в частности, хитина и хитозана, которые широко используются в пищевой, химической промышленности, сельском хозяйстве, ветеринарии, медицине, в частности, в биотехнологии и биомедицине [8, 9, 10, 11].
Известно, что хитин и хитозан и их производные способны ингибировать рост микроорганизмов бактериальной и вирусной природы [12]. Противоми-кробный эффект олигомеров хитозана обусловлен их способностью проникать внутрь бактерий и влиять на их механизм репродукции микробных тел.
Известно, что источником хитина и хитозана являются ракообразные и насекомые, в частности, пчелы. Многочисленные исследования отечественных и зарубежных исследователей показали, что хитин и хитинсодержащие БАПП, оказывают стимулирующий эффект на естетсвенный микробиоценоз кишечника, коррекцию стрептококковой инфекции, на показатели Т- и B-систем организма, иммунного статуса и резистентность организма [1,2,3].
Наряду со способностью апипрепаратов стимулировать клеточный метаболизм и пролиферацию клеток органов и тканей животных invivo, они обладают одновременно важнейшим свойством - инги-бировать рост и размножение патогенных и условно патогенных микроорганизмов (стафилококков, стрептококков, диплококков, вирусов, грибов, эше-рихий, сальмонелл, микобактерий туберкулеза и т.д.) [4, 5, 6, 7].
В связи с отсутствием сведений о влиянии биополимеров (хитина и хитозана) и хитинсодержащих продуктов пчеловодства на культуры клеток и способности их оказывать антибактериальное действие на указанные объекты, нами были проведены настоящие исследования, целью которых явилось изучение антибактериальной активности БАПП на КМАФиМ, которые являются наиболее частыми кон-таминантами питательных сред, используемых при культивировании клеток животных in vitro.
Материалы и методы. В качестве антибактериальных агентов были использованы 0,1-1,0%-ные растворы хитозана и этанолового апифитоэкстрак-та (АФЭ) из биологически активной добавки «Ви-та-Форце».
Смеси образцов хитозана и апифитоэкстрак-та различной концентрации и микробной взвеси мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФиМ, наиболее частых контаминантов ростовых сред для выращивания культур клеток invitro), инкубировали при 37°С и pH 5,5 в течение 1-24 часов. Далее используемые образцы были тестированы посевом на чашки Петри с соответствующими питательными средами (мясо-
пептонный бульон и мясопептонный агар). Чашки с посевами были инкубированы при 37°С при 24-48 ч, после чего учитывали наличие или отсутствие роста тест-культур при соответствующих разведениях тестируемых препаратов.
В качествекритериев оценки антимикробной активности препаратов использовали минимальную бактериостатистическую (МБсК) и минимальную бактерицидную контаминацию (МБцК) через 24 ч инкубации при 37±0,5°С в отношении испытуемых тест-микробов.
Критерием оценки антимикробной активности испытуемых веществ являлось отсутствие изучаемых тест-микробов в посевах проб на МПБ и МПА.
Результаты исследований. На первом этапе изучали влияние хитозана и апифитоэкстракта на мезофильные аэробные и факультативно-аэробные микроорганизмы, выделенные из экстракта мышечной ткани коров, используемых в биотехнологии в качестве добавки в питательные среды согласно ГОСТу Р-50396.1-2010 «Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативных аэробных микроорганизмов». Результаты определения количества микроорганизмов в экстракте показали, что микробная обсемененность его составляла 1,5х103 КОЕ/мл.
Результаты бактериологических исследований по изучению влияния растворов хитозана и апифи-тоэкстракта на мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, выделенные из экстракта мышц коров показали, что антимикробный эффект препаратов в отношении тест-микробов проявляется по разному. Сравнительно низкую активность показывают растворы хитозана при 0,1-0,3%-ных концентрациях, при которых полная гибель микробной популяции за 24 часа не наступала. Ускоренная гибель тест-микробов наступала при концентрации препарата в диапазоне от 0,4 до 0,44%.
Менее чувствительными оказались испытуемые тест-микробы по отношению к хитинсодержащему апифитоэкстракту из биологически активной композиции «Вита-Форце». В присутствии апифитоэкстракта пороговая (минимальная) концентрация препарата, при которой не наблюдается рост микробов группы КМАФиМ, составляет 0,9-1,0%.
С учетом изложенного, считаем возможным и целесообразным представить результаты бактериологических исследований по изучению антибактериальной активности испытуемых препаратов только по эффективным концентрациям, оказывающим бактерицидный эффект по отношению к тестируемым микроорганизмам (табл.).
Из данных таблицы видно, что внесение в суспензию, содержащую 1,5х103 КОЕ/мл КМАФАиМ, растворов хитозана и апифитоэкстракта, оказывало
Таблица
Антибактериальная активность хитозана и апифитоэкстракта в отношении мезофильныхаэробных и факультативно анаэробных микоорганизмов (С=0,44-1,0%)
Экспозиция,ч Объект исследования Обсемененность раствора КМАФАиМ х.10 в третьей степени КОЕ/мл
1 0,44%-ный р-р хитозана 1,01+0,05
1,0%-ный р-р АФЭ 1,13+0,09
2 0,44%-ный р-р хитозана 1,91+0,02х
1,0%-ный р-р АФЭ 1,93+0,03х
3 0,44%-ный р-р хитозана 1,39+0,005хх
1,0%-ный р-р АФЭ 1,41+0,008хх
12 0,44%-ной р-р хитозана 0,05+0,0003ххх
1,0%-ный р-р АФЭ 0,06+0,0003ххх
24 0,44%-ный р-р хитозана 0,001+0,0003ххх
1,0%-ный р-р АФЭ 0,002+0,005ххх
48 0,44%-ный р-р хитозана 0
1,0-ный р-р АФЭ 0
Примечание: х- Р<0,05, хх - Р<0,01, ххх - Р<0,001; исходная концентрация микробов 250 тысяч КОЕ/мл.
бактерицидное действие на микроорганизмы в зависимости от времени контакта испытуемых агентов. При этом наиболее интенсивная гибель микроорганизмов наблюдалась при 3-12-ти часовом контакте их с испытуемыми агентами. Снижение степени обсемененности контаминированного микробами КМАФАиМ раствора при 3-х часовой экспозиции составляла в 2,59 (хитозан) и 2,75 раза (АФЭ) (Р<0,01) соответственно.
Наиболее интенсивная гибель микробных клеток КМАФАиМ под воздействием испытуемых агентов наступала при 12 и 24-часовой экспозиции, когда в контаминированных указанными микроорганизмами суспензиях обнаруживалось 0,05-0,06х103 микробных клеток, что составляет 50-60 микробных клеток на 1 мл раствора. Увеличение срока экспозиции до 24 ч вызывало существенное влияние на жизнеспособность испытуемых микробов - к этому сроку в растворах обнаруживались не более 1-2 микробных клеток на 1 см3.
Учитывая, что бактерицидное действие антибактериальных агентов в значительной степени зависит от температуры среды, и, во-вторых, в биотехнологии культивирование животных клеток осуществляют при температуре 37°С, представлял интерес изучение влияния указанной температуры на степень обсемененности растворов при контакте изучаемых микроорганизмов с испытуемыми агентами.
Результаты изучения влияния температуры на степень обсемененности экстракта мышц коров по-
сле внесения растворов хитозана и апифитоэкстракта из «Вита-Форце» показали, что ингибирование тест-микробов в экстрактах мышц коров, содержащих мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы в присутствии 0,44%-ного раствора хитозана и 1%-ного раствора апифитоэкстракта при температуре 37°С приводило к ускорению гибели тест-микробов, которая наступала при 1000-минутной экспозиции (16,6 часов).
Из сопоставительных данных таблицы и изучения влияния различных температур на тест-микроба показали, что 99,9%-ная гибель тест-микробов при температуре 22°С наступала при 24-часовой экспозиции микробов с испытуемыми агентами в водном растворе, содержащем КМАФАиМ. Повышение температуры инкубирования микроорганизмов в при-сутствиии испытуемых агентов ускоряло их гибель в 1,5 раза, несмотря на то, что изучаемые тест-микробы в этом варианте опыта пребывали в условиях белковой защиты (в экстракте мышц коров).
Заключение. Таким образом, результаты микробиологических исследований по изучению влияния биополимеров хитозана и апифитоэкстракта на биологически активные композиции «Вита-Форце» показали высокую антибактериальную активность биополимеров, ингибируя рост и развитие патогенной и условно-патогенной микрофлоры - потенциальных контаминантов питательных (ростовых) сред для культивирования клеток, используемых в биотехнологии.
Литература
1. Баззаев, Т.В. Апитерапия в лечении гнойных ран / Т.В.Баззаев, С.И.Шишков // Апитерапия сегодня с биологической аптекой пчел в 21 век: материалы II Междунар. науч.-практ. конф. - УФА, 2000. - С. 167-169.
2. Бакиров, А.А. Показатели динамики Т-лимфоцитов, их популяций и B-лимфоцитов при стимуляции организма композиционными формами с продуктами пчеловодства / А.А.Бакиров, Р.Т.Маннапова // Апитерапия сегодня с биологической аптекой пчел в 21 век: материалы II Междунар. науч.-практ. конф. - УФА, 2000. - С. 262.
3. Маннапова, Р.Т. Влияние прополиса и нового препарата из группы пиримидинов на естественную резистентность / Р.Т.Маннапова, Н.В.Гребенькова, В.П.Кривоногов // Апитерапия сегодня с биологической аптекой пчел в 21 век: материалы II Междунар. науч.-практ. конф. - УФА, 2000. - С. 304-307.
4. Антимикробная активность продуктов пчеловодства / В.И.Присакарь, Н.Г.Еремия, Т.С.Чайка, Т.Г.Плот // Апитерапия сегодня: материалы IV науч. конф. по апитерапии. - Рыбное, 1995. - С.38.
5. Изучение антимикробной активности суппозиториев с препаратами прополиса / А.М.Тихонов [и др.] // Апитерапия сегодня с биологической аптекой пчел в 21 век: материалы II Междунар. науч.-практ. конф. - уФа, 2000. - С. 280-281.
6. Шагивалеев, А.Д. Микробиоценоз кишечника лошадей под влиянием прополиса, цеолитов и биотрина / А.Д.Шагивалеев, Р.Т.Маннапова // Апитерапия сегодня с биологической аптекой пчел в 21 век: материалы II Междунар. науч.-практ. конф. - УФА, 2000. - С. 230-232.
7. Шагимухаметов, Р.Б. Иммунный статус, естественный икробиоценоз кишечника и методы коррекции при стрептококкового-криптоспоридиозном заболевании телят / Р.Б.Шагимухаметов // Апитерапия сегодня с биологической аптекой пчел в 21 век: материалы II Междунар. науч.-практ. конф. - УФА, 2000. - С. 209-223.
8. Wang, T. Selected properties of pH-sensitive, biodegradable chitosan-poly (vinyl alcohol) hydrogel / T.Wang, M.Turhan, S.Gunasekaran // Polym. Int. - 2004. - Vol. 53. - P. 911.
9. Tan, T. Preparation of PVA/ chitosan lipase membrane reactor and its application in synthesis of monoglyceride / T.Tan, F.Wang, H.Zhang // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. - 2002. - Vol. 18. - P. 325.
10. Development of Chitosan / Poly(vinyl alcohol) blend membranes as burn dressings / E.Mangala, T.S.Kumar, S.Baskar, K.P.Rao // Trends Biomater. Artif. Organs. - 2003. - Vol. 17, № 1. - P. 34.
11. Sorption Characterization of Poly(vinyl alcohol) Chitosan Interpenetrating Polymer Network Hydrogels / S.J.Kim [et al.] // J. Appl. Polym. Sci. - 2003. - Vol. 90. - P. 86.
12. Uchida, Y Antibacterial activity by chitin and chitosan / YUchida // Fisheries Science. - 2002. - Vol. 68. - P. 170-177.
THE EFFECT OF APIPHYTODRUG ON MICROBIAL CONTAMINANTS OF CULTURE MEDIA
Churina Z.G.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань (420075, г.Казань, Научный городок-2, тел.+7 (843) 239-53-20, e-mail: vnivi@mail.ru).
The aim of the work was to evaluate the activity of biopolymer - chitosan and chitin-containing drug - apiphytoextract produced from biological active products of bee breeding. Chitosan biopolymer was purchased from LLC "Pharmacor", Saint-Petersburg. Apiphytoextract was obtained from biological active composition of "Vita-Force" using ethanol-based extraction of chitin-containing preparation. Mesophilic aerobic and optionally anaerobic microorganisms isolated from calves muscles, which is usually used for cell cultivation at viral vaccines production, were used as test microorganisms. For obtaining antimicrobial effect from the tested drugs 0.1-1.0%-solutions of chitosan and apiphytoextracts were prepared. The solutions were placed into tubes containing mesophilic aerobic and optionally anaerobic microorganisms in concentration of 2*10 CFU/ml for 1-48 hours at 22С. By the end of the exposure time microorganisms were suspended and passed with the tested drugs in meat peptode broth and meat peptode agar followed by counting the number of recovered microorganisms.The microbiological studies showed that the both drugs have sufficiently high bactericidal activity killing test-microbes at 24 hours of exposure to 0.44%-chitosan and 1%-apiphytoextract solutions on test agents. Therefore, the apiphytiextract from biological active products of bee breeding has high antibactericidal activity and safety and can be applied as antimicrobial agent for cell cultivation removing antibiotics-decontaminants.
KEYWORDS: cell culture, cultural nutrient media, apidrugs, biopolymers, chitin, chitosan.
ЕТЕРМНЛРНЫЙ
Врач
References
1. Bazzaev, T.V. Apiterapiya v lechenii gnoynyh ran [Using apitherapy for teating purulent wounds] / T.V.Bazzaev, S.I.Shishkov // Apiterapiya segodnya s biologicheskoy aptekoy pchel v 21 vek - Apitherapy today with biological pharmacy of bees to XXI century: proceedings from 2nd International scientific conference. - UFA, 2000. - P. 167-169.
2. Bakirov, A.A. Pokazateli dinamiki T-limfocitov, ih populyaciy i B-limfocitov pri stimulyacii organizma kompozicionnymi formami s produktami pchelovodstva / A.A.Bakirov, R.T.Mannapova // Apiterapiya segodnya s biologicheskoy aptekoy pchel v 21 vek - Apitherapy today with biological pharmacy of bees to XXI century: proceedings from 2nd International scientific conference. - UFA, 2000. - P. 262.
3. Mannapova, R.T. Vliyanie propolisa i novogo preparata iz gruppy pirimidinov na estestvennuyu rezistentnost' [The effect of propolis and a new drug from the group of pyrimidines on natural resistance]/ R.T.Mannapova, N.V.Greben'kova, V.P.Krivonogov // Apiterapiya segodnya s biologicheskoy aptekoy pchel v 21 vek - Apitherapy today with biological pharmacy of bees to XXI century: proceedings from 2nd International scientific conference. - P. 304-307.
4. Antimikrobnaya aktivnost' produktov pchelovodstva [Antimicrobial activity of bee breeding products]/ V.I.Prisakar', N.G.Eremiya, T.S.chayka, T.G.Plot // Apiterapiya segodnya - Apitherapy today: proceedings from the IV scientific conference on apitherapy. - Rybnoe, 1995. - P. 38.
5. Izuchenie antimikrobnoy aktivnosti suppozitoriev s preparatami propolisa [The study of antimicrobial activity of of suppositories with propolis drugs] / A.M.Tihonov [et al.] // Apiterapiya segodnya s biologicheskoy aptekoy pchel v 21 vek - Apitherapy today with biological pharmacy of bees to XXI century: proceedings from 2nd International scientific conference . - UFA, 2000. - P. 280-281.
6. Shagivaleev, A.D. Mikrobiocenoz kishechnika loshadey pod vliyaniem propolisa, ceolitov i biotrina [Intestinal microbiocenosis in horses under the influence of propolis, zeolites, and biotrin] / A.D.Shagivaleev, R.T.Mannapova // Apiterapiya segodnya s biologicheskoy aptekoy pchel v 21 vek- Apitherapy today with biological pharmacy of bees to XXI century: proceedings from 2nd International scientific conference - UFA, 2000. - P. 230-232.
7. Shagimuhametov, R.B. Immunnyy status, estestvennyy mikrobiocenoz kishechnika i metody korrekcii pri streptokokkovo-kriptosporidioznom zabolevanii telyat [Immune status, natural intestinal microbiocenosis and its correction methods at streptococci and cryptosporadic sickness of calves] / R.B.Shagimuhametov // Apiterapiya segodnya s biologicheskoy aptekoy pchel v 21 vek-Apitherapy today with biological pharmacy of bees to XXI century: proceedings from 2nd International scientific conference. - UFA, 2000. - P. 209-223.
8. Wang, T. Selected properties of pH-sensitive, biodegradable chitosan-poly (vinyl alcohol) hydrogel / T.Wang, M.Turhan, S.Gunasekaran // Polym. Int. - 2004. - Vol. 53. - P. 911.
9. Tan, T. Preparation of PVA/ chitosan lipase membrane reactor and its application in synthesis of monoglyceride / T.Tan, F.Wang, H.Zhang // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. - 2002. - Vol. 18. - P. 325.
10. Development of Chitosan / Poly(vinyl alcohol) blend membranes as burn dressings / E.Mangala, T.S.Kumar, S.Baskar, K.P.Rao // Trends Biomater. Artif. Organs. - 2003. - Vol. 17, № 1. - P. 34.
11. Sorption Characterization of Poly (vinyl alcohol) Chitosan Interpenetrating Polymer Network Hydrogels / S.J.Kim [et al.] // J.Appl. Polym. Sci. - 2003. - Vol. 90. - P. 86.
12. Uchida, Y Antibacterial activity by chitin and chitosan / YUchida // Fisheries Science. - 2002. - Vol. 68. -P. 170-177.
ОРГАНИЗАЦИЯ ВЕТЕРИНАРНОГО ОБСЛУЖИВАНИЯ ДИКИХ ЖИВОТНЫХ В ГОСУДАРСТВЕННОМ АВТОНОМНОМ УЧРЕЖДЕНИИ КУЛЬТУРЫ «КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦИРК»
ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», г. Казань (420029, Казань, Сибирский тракт, 35; e-mail: oevd@ksavm.senet.ru;
тел.: +7(843)-273-97-25).
В системе изучения диких животных разнообразных таксонов особое место занимают специальные исследования, посвященные лечению, профилактике заболеваний, а так же мероприятий по их обслуживанию. Цель исследования состояла в изучении деятельности работы ветеринарной службы в Государственном автономном
УДК: 619:614.2: 636.082.14
С.А.Юсупов - аспирант.
