CC BY
50
■ ФИЗИОЛОГИЯ. ПАТОФИЗИОЛОГИЯ. ДИАГНОСТИКА
ВЛИЯНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ НА БАРЬЕРНУЮ ФУНКЦИЮ КИШЕЧНОЙ СТЕНКИ
ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ
Суслов Андрей Владимирович -кандидат медицинских наук, доцент кафедры «Хирургия» ФГБОУ ВО «Пензенский государственный университет» (Пенза, Россия) E-mail: dr.suslov@rambler.ru https://orcid.org/0000-0003-0613-8556
Ключевые слова:
антибактериальная терапия, эндогенная интоксикация, барьерная функция кишечной стенки, синдром энтеральной недостаточности, кишечная микробиота
Суслов А.В.1, Митрошин А.Н.1, Соломаха А.А.1, Галкина Н.Г.1, Суслова И.С.1, Гришина И.А.1, Чаиркин И.Н.2
1 ФГБОУ ВО «Пензенский государственный университет», Пенза, Россия
2 ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Россия
Энтеральная недостаточность кишечника сопровождает большинство тяжелых хирургических заболеваний, где по мере прогрессирования основного заболевания сам кишечник становится мощным источником эндогенной интоксикации. Назначаемые в комплексной терапии антибиотики за счет воздействия на микробиоту кишечника оказывают влияние на стенку кишки. Следовательно, изучение изолированного влияния антибактериальной терапии на барьерную функцию кишечной стенки позволит углубленно исследовать фундаментальные механизмы развития энтеральной недостаточности кишечника под влиянием антибиотика. Исследование проведено на крысах линии Вистар. Контрольная серия (п=50) - животным ежедневно, на протяжении 10 сут внутримышечно вводили физиологический раствор. Опытная серия (п=50) - животным ежедневно, на протяжении 10 сут внутримышечно вводили цефтри-аксон. Контрольные сроки наблюдения - 1, 5, 10, 15, 20 и 30-е сутки.
В исследовании установлено развитие барьерной дисфункции кишечной стенки на фоне 10-дневной антибактериальной терапии, что сопровождалось развитием синдрома эндогенной интоксикации и формированием деструктивных процессов в слизистой оболочке толстой кишки (р<0,001).
После отмены антибактериальной терапии на протяжении 10 сут (р<0,001) в силу барьерной дисфункции кишечной стенки сам кишечник становится источником эндогенной интоксикации. Установлено наличие высокой корреляционной связи г=0,74 (р<0,05) между деструктивными процессами в кишечной стенке и эндогенной интоксикацией.
Для цитирования: Суслов А.В., Митрошин А.Н., Соломаха А.А., Галкина Н.Г., Суслова И.С., Гришина И.А., Чаиркин И.Н. Влияние антибактериальной терапии на барьерную функцию кишечной стенки // Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. 2019. Т. 7, № 4. С. 78-83. 10.24411/2308-1198-2019-14010 Статья поступила в редакцию 10.10.2018. Принята в печать 31.10.2019.
Effect of antibacterial therapy on the barrier function of the intestinal wall
roRRESPONDENCE
Suslov A.V.1, Mitroshin A.N.1, Solomakha A.A.1, GaLkina N.G.1, Suslova I.S.1, Grishina I.A.1,
SusLov Andrey V. - MD, Associate Chairkin I.N.2
Professor of the Department of Surgery, Penza State University (Penza, Russia) E-mail: dr.suslov@rambler.ru https://orcid.org/0000-0003-0613-8556
1 Penza State University, Penza, Russia
2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia
Enteric intestinal insufficiency accompanies the majority of severe surgical diseases, where as the underlying disease progresses, the intestine itself becomes a powerful source of endogenous intoxication. Assigned in a complex therapy of antibiotics due to the effect on the intestinal microbiota, affect the wall of the bowel. Therefore, the study of the isolated effect of antibacteri-al therapy
on the barrier function of the intestinal wall will allow us to study in depth the funda-mental mechanisms of the development of enteric insufficiency of the intestine under the influ-ence of an antibiotic.
The study was carried out on Wistar rats. Control series (n=50) - live daily, for 10 days intra-muscu-larly injected saline. Experimental series (n=50) - animals daily, for 10 days intra-muscle injected ceftriaxone. The follow-up periods are 1, 5, 10, 15, 20 and 30 days.
The study established the development of barrier intestinal wall dysfunction against a back-ground of 10-day antibacterial therapy, which was accompanied by the development of the syn-drome of endogenous intoxication and the formation of destructive processes in the mucosa of the large intestine (p<0.001).
After the abolition of antibacterial therapy for 10 days (p<0.001) due to barrier dysfunction of the intestinal wall, the intestine itself becomes the source of endogenous intoxication. The presence of high tightness of correlation correlation r=0.74 (p<0.05) between destructive processes in the intestinal wall and endogenous intoxication was established.
Keywords:
antibacterial therapy, endogenous intoxication, barrier function of the intestinal wall, enteric insufficiency syndrome, intestinal microbiota
For citation: Suslov A.V., Mitroshin A.N., Solomakha A.A., Galkina N.G., Suslova I.S., Grishina I.A., Chairkin I.N. Effect of antibacterial therapy on the barrier function of the intestinal wall. Clin Experiment Surg. Petrovsky J. 2019; 7 (4): 78-83. doi: 10.24411/2308-1198-2019-14010 (in Russian) Received 10.10.2018. Accepted 31.10.2019.
На сегодняшний день общеизвестно, что синдром энтеральной недостаточности (СЭН) сопровождает многие тяжелые хирургические заболевания, такие как перитонит, панкреонекроз, кишечная непроходимость, в связи с чем диагностика и лечение данного синдрома является актуальной задачей современной хирургии [1-4].
При развитии СЭН страдает прежде всего барьерная функция кишечной стенки, следствием чего является насыщение организма токсинами бактериального и дисметаболического происхождения, что превращает кишечник в мощный и постоянный источник интоксикации, формирует цепь патологических процессов, приводящих к необратимым изменениям в органах и тканях [5-7].
В настоящее время микробиоте кишечника отводится значительная роль в развитии энтеральной недостаточности, так как именно бактерии и их токсины, находясь в структурной и функциональной связи со слизистой оболочкой кишки, запускают процессы, приводящие к нарушению барьерной функции кишечника [8-10].
Назначаемые в комплексной терапии антибиотики за счет влияния на микробиоту кишечника оказывают влияние на стенку кишки. Следовательно, изучение изолированного влияния антибактериальной терапии (при отсутствии хирургической патологи) на барьерную функцию кишечной стенки позволит углубленно исследовать фундаментальные механизмы развития энтеральной недостаточности кишечника.
Цель работы - изучить изменения, формирующиеся в стенке толстой кишки под влиянием антибактериальной терапии.
Материал и методы
Экспериментальное исследование было проведено на крысах линии Вистар в возрасте 5 мес, массой около 250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария, за 2 мес до исследования переводили на унифицированный рацион питания.
Животные были разделены на 3 серии. Первая серия (п=10) - животные перед введением антибиотика были выведены из эксперимента, полученные от них данные использовали в качестве нормы. Остальные животные были разделены на 2 серии. Контрольная серия (п=50) - животным ежедневно на протяжении 10 сут внутримышечно вводили физиологический раствор 1,0 мл. Опытная серия (п=50) - животным ежедневно на протяжении 10 сут внутримышечно вводили цефтриаксон 15 мг/кг в сутки.
В динамике наблюдения (1, 5, 10, 15, 20 и 30-е сутки) в стерильных условиях осуществлялся забор биоматериала (кишечного содержимого и стенки кишечника) от средней трети толстой кишки на бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевали на питательные среды в соответствии с правилами, изложенными в методических указаниях [14]. Использовались традиционные питательные среды для выделения неферментирующих грамотрицательных бактерий (НГОБ, в том числе псевдомонад), энтеробактерий, бифидобактерий, лактобактерий, клостридий, эше-рихий, энтерококков, стафилококков, дрожжепо-добных грибов.
Культивирование бактерий проводили при температуре 37,0 °С в течение 18-24 ч, грибов - при
30 °С в течение 1-7 сут. Биохимическую идентификацию осуществляли в автоматизированном режиме на тест-системах производства ВюМепеих, включающих до 47 анализируемых признаков и свойств [9]. Общее количество микробных клеток в пересчете на 1 г фекалий животных подсчитывали в камере Горяева. Количество живых микроорганизмов (КОЕ) в суспензиях фекалий животных определяли путем высева соответствующих 10-кратных серийных разведений на плотные питательные среды и подсчетом выросших колоний.
Участки кишки, с которых забирали кишечное содержимое для бактериологического исследования, направляли на гистологию. Фрагменты ткани стенки кишки фиксировали в 10% нейтральном формалине 18-24 ч. Затем образцы проходили обработку в аппарате закрытого типа для проводки операционного и биопсийного материала по стандартной программе (изопреп-парафин). Далее образцы заливали в парафиновые блоки. С блоков делали срезы, которые затем окрашивали гематоксилином и эозином в аппарате по стандартной методике. Срезы заключали под покровное стекло, и исследовали препараты методом световой микроскопии.
В контрольные сроки оценивали эндогенную интоксикацию по содержанию молекул средней массы (МСМ). Сыворотку крови смешивали с 10% раствором трихлоруксусной кислоты в соотноше-
нии 1:2, центрифугировали 30 мин при скорости 3000 об/мин. Затем 0,5 мл супернатанта смешивали с 4,5 мл дистиллированной воды и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 280 нм. Результат выражали в условных единицах.
В качестве антибактериального препарата использовали антибиотик III поколения цефалоспо-ринового ряда широкого спектра действия для парентерального введения - цефтриаксон ^-6-альфа, 7-бета^)-7-2-амино-4-тиазолил(метоксиимино) ацетиламино-8-оксо-3-(1,2,5,6-тетрагидро-2-метил-5,6-диоксо-1,2,4-триазин-3-ил)тиометил-5-тиа-1-азабицикло4.2.0окт-2-ен-2-карбоновая кислота) -препарат в виде динатриевой соли ОАО «Биосинтез».
Опыты на животных выполняли в соответствии с правилами лабораторной практики ^Р) (приказ № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики»); порядком гуманного обращения с животными («Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные приказами Минздрава СССР № 742 от 13.11.1984 «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и № 48 от 23.01.1985 «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных»), а также основывались на положениях Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации.
Рис. 1. Влияние антибактериальной терапии на гистологию стенки кишки
Fig. 1. The effect of antibiotic therapy on intestinal histology
Контроль 10-е сутки 20-е сутки
5-е сутки 15-е сутки 30-е сутки
Контрольные сроки
п Медиана I I 25-75% Мин-Макс
Статистический анализ результатов исследования осуществляли с использованием программы Б^Ь'БИса 6.0. Для выявления различий нескольких независимых групп, распределение которых отличается от нормального, использовали критерий Краскела-Уоллиса и медианный тест. Для оценки степени взаимосвязи использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Статистически достоверными считались результаты при значениях р<0,05.
Результаты и обсуждение
При бактериологическом исследовании установлено, что на фоне парентерального введения цефтриаксона развиваются качественные и количественные изменения в структуре толстокишечной микробиоты. Так, антибиотикотерапия привела к уменьшению энтерококков, бифидо- и лактобак-терий на 2-3 порядка и увеличению количества условно-патогенной микрофлоры на 30-е сутки исследования.
При гистологическом исследовании выявлено увеличение глубины крипт толстой кишки, что связано с разрушением части клеток эпителиального пласта (рис.1).
Медиана глубины крипт толстой кишки составила 244 мкм. После начала приема антибиотиков глубина крипт толстой кишки увеличивается до 253 мкм (р>0,05). Еще через 5 дней на 10-е сутки антибактериальной терапии происходит дальней-
шая деструкция клеток, и глубина крипт достигает 265 мкм (р<0,001). С 10-х суток лекарственный препарат был отменен, однако восстановление нормальной структуры происходило медленно. На 15-е сутки эксперимента глубина крипт толстой кишки составляет 263 мкм (р<0,001). На 20-е и 30-е сутки эксперимента глубина крипт уменьшалась и соответственно достигала 261 (р=0,0027) и 254 мкм (р>0,05).
Прием антибактериальных препаратов сопровождался эндогенной интоксикацией как в период проведения антибактериальной терапии, так и после отмены антибиотика. На протяжении 10-дневного курса антибактериальной терапии МСМ 280 достоверно превышали контроль на 113 и 185% (р<0,001) соответственно. После отмены цефтриаксона через 5 сут содержание МСМ 280 достоверно превышало контроль на 123% (р<0,001), через 10 дней выраженность эндогенной интоксикации составляла 127% (р=0,028) относительно контроля. К 30-м суткам эксперимента (20-е сутки после отмены антибиотика) исследуемый показатель достоверно от контроля не отличался (р>0,05).
Для оценки степени взаимосвязи гистологических изменений кишечной стенки с выраженностью эндогенной интоксикации использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. При проведении корреляционного анализа установлено наличие высокой тесноты связи г=0,74 (р<0,05) (рис. 2).
Таким образом, в ходе исследования было установлено, что антибактериальная терапия запускает ряд патологических механизмов, приводящих к развитию энтеральной недостаточности, и прежде всего к барьерной дисфункции стенки толстой кишки. Так, установлено, что антибактериальная терапия на протяжении первых 10 сут достоверно (р<0,001) вызывает деструкцию эпителиальной выстилки толстого кишечника, с последующим сохранением цитодеструктивных процессов на протяжении 10 дней (5-е и 10-е сутки после отмены антибиотика) (р<0,001), и только к концу эксперимента гистологические изменения в опытной группе достоверно не отличаются от контрольной (р>0,05).
Изменения гистологической структуры стенки кишки сопровождались изменениями качественного и количественного состава микробиоты кишечника. Установлено, что на 20-е сутки после отмены антибиотика происходит рост условно-патогенной микрофлоры. В результате развивается воспалительная реакция в кишечной стенке, что приводит к развитию воспалительного повреждения эпителия кишечника, тем самым опосредуется развитие барьерной дисфункции кишечной стенки и насыщение организма токсинами внутрикишеч-ного происхождения. Проведенное исследование нашло полное подтверждение данному обстоятельству, так как цитодеструктивные процессы продолжают развиваться в кишечной стенке и после отмены антибактериальной терапии ^<0,05).
Эндогенная интоксикация на фоне 10-дневной антибактериальной терапии носила восходящую динамику, что не только подтверждает гибель бактерий под действием антибиотика (очевидный факт), но и свидетельствует о развитии барьерной недостаточности кишечной стенки, так как именно на 10-е сутки антибиотикотерапии развиваются максимальные деструктивные процессы
в кишечной стенке. После отмены антибиотика препарат не оказывает влияния на микрофлору кишечника, но за счет деструктивных процессов в кишечной стенке эндогенная интоксикация в организме сохраняется ^<0,05), что полностью подтверждает нарушение барьерной функции кишечника. И только на 30-е сутки эксперимента эндогенная интоксикация в опытной группе не отличалась от контрольной, что в динамике эксперимента соответствует стабилизации и репарации эпителиальной выстилки кишечной трубки. Проведенный корреляционный анализ показал высокую тесноту связи (г=0,74) между цитодеструктивными процессами в кишечной стенке и эндогенной интоксикацией при антибактериальной терапии.
Заключение
В исследовании установлено развитие барьерной дисфункции кишечной стенки на фоне 10-дневной антибактериальной терапии, что сопровождается эндогенной интоксикацией и деструктивными процессами в слизистой оболочке толстой кишки ^<0,001).
После отмены антибактериальной терапии на протяжении 10 дней ^<0,001) в силу барьерной дисфункции кишечной стенки сам кишечник становится источником эндогенной интоксикации.
Установлено наличие высокой тесноты корреляционной связи г=0,74 ^<0,05) между деструктивными процессами в кишечной стенке и эндогенной интоксикацией.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-34-60130мол_а_дк.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Литература
1. Косинец В.А. Синдром энтеральной недостаточности: патогенез, современные принципы диагностики и лечения // Новости хир. 2008. Т. 16, № 2. С. 130138.
2. Власов А.П., Суслов А.В., Анаскин С.Г., Шиби-тов В.А. и др. Энтеропротекторная терапия при панкре-онекрозе // Фундам. исслед. 2013. № 3-1. С. 41-45.
3. Ильченко Ф.Н., Ляшенко Н.В., Гончарук В.А. На-зоинтестинальная интубация и энтеросорбция в комплексе мероприятий по коррекции синдрома энтераль-ной недостаточности // Таврический мед.-биол. вестн. 2014. Т. 17, № 3 (67). С. 28-31.
4. Федосеев А.В., Муравьев С.Ю., Бударев В.Н., Абуварда Ф.Х. и др. К вопросу диагностики ранних при-
знаков полиорганной дисфункции у больных с синдромом энтеральной недостаточности // Вестн. экспер. и клин. хир. 2012. Т. 5, № 1. С. 60-64.
5. Парахонский А.П. Роль бактериальной транслокации в развитии хирургического сепсиса // Успехи соврем. естествознания. 2007. № 7. С. 45-46.
6. Баймаков С.Р., Хужаева Ш.А., Юнусход-жаева Х.Г. Изучение бактериальной транслокации при острой кишечной непроходимости // Соврем. медицина: актуальные вопросы. 2016. № 8 (50). С. 27-34.
7. Предко В.А., Якубцевич Р.Э., Спас В.В. Кишечник, как источник бактериемии, токсинемии и развития синдрома полиорганной недостаточности // Журн. Гродненского гос. мед. ун-та. 2007. № 4 (20). С. 3-7.
8. Суслов А.В., Семенова Е.Ф., Митрошин А.Н., Моисеева И.Я. Экспериментальное исследование формирования микроэкологических, морфо-функциональных и иммунологических нарушений на фоне проводимой антибактериальной терапии // Инфекц. бол. 2017. Т. 15, № 4. С. 55-59.
9. Волков Д.В., Стадников А.А., Тарасенко В.С., Чу-кина О.В. и др. Морфофункциональное состояние тон-
кой кишки при синдроме энтеральной недостаточности на фоне экспериментального перитонита и антиокси-дантной терапии // Соврем. пробл. науки и образования. 2016. № 2. С. 105.
10. Бондаренко В.М., Рябиченко Е.В. Кишечно-мозговая ось. Нейронные и иммуновоспалительные механизмы патологии мозга и кишечника // Журн. микробиол. 2013. № 2. С. 112-120.
References
1. Kosinets V.A. Enteric insufficiency syndrome: pathogenesis, modern principles of diagnosis and treatment. Novosti khirurgii [News of Surgery]. 2008; 16 (2): 130-8. (in Russian)
2. Vlasov A.P., Suslov A.V., Anaskin S.G., Shibi-tov V.A., et al. The enteral insufficiency therapy at pancreatonecrosis. Fundamental'nye issledovaniya [Fundamental Researches]. 2013; (3-1): 41-5. (in Russian)
3. Il'chenko F.N., Lyashenko N.V., Goncharuk V.A. Nasointestinal intubation and enterosorption in complex of measures for enteric insufficiency syndrome correction. Tavricheskiy mediko-biologicheskiy vestnik [Tavric Medical and Biological Bulletin]. 2014; 17 (3): 28-31. (in Russian)
4. Fedoseyev A.V., Murav'yev S.Yu., Budarev V.N., Abuvarda F.Kh., et al. About diagnosis of early signs of multiple organ dysfunction syndrome in patients with enteric insufficiency syndrome. Vestnik experimental'noy i klinicheskoy khirurgii [Bulletin of Experimental and Clinical Surgery]. 2012; 5 (1): 60-4. (in Russian)
5. Parakhonskiy A.P. The effect of bacterial translocation in the development of surgical sepsis. Uspekhi sovremennogo estestvoznaniya [Successes of Modern Natural Science]. 2007; (7): 45-6. (in Russian)
6. Baymakov S.R., Khuzhayeva Sh.A., Yunusk-hodzhayeva Kh.G. Study of bacterial translocation in acute intestinal obstruction. Sovremennaya meditsina:
aktual'nye voprosy [Modern Medicine: an Actual Questions]. 2016; 8 (50): 27-34. (in Russian)
7. Predko V.A., Yakubtsevich R.E., Spas V.V. Intestines as a source of bacterial toxemia and a source of the development of multiple organ failure syndrome. Zhurnal Grodnenskogo gosudarstvennovo meditsinskogo univer-siteta [Journal of Grodno State Medical University]. 2007; 4 (20): 3-7. (in Russian)
8. Suslov A. V., Semenova E.F., Mitroshin A.N., Moi-seyeva I.Ya. An experimental study of the formation of mi-croecological, morphofunctional and immunological disorders against the background of antibacterial therapy. Infektsionnye bolezni [Infectious Diseases]. 2017; 15 (4): 55-9. (in Russian)
9. Volkov D.V., Stadnikov A.A., Tarasenko V.S., Chukina O.V., et al. Morphofunctional state of the small intestine in case of enteric insufficiency syndrome on the background of experimental peritonitis and antioxidant therapy. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya [Modern Problems of Science and Education]. 2016; (2): 105. (in Russian)
10. Bondarenko V.M., Ryabichenko Ye.V. Gut-brain axis. Neural and immuno-inflammatory mechanisms of the pathology of the brain and intestines. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2013; (2): 112-20. (in Russian)
