CC BY
39
Биомедицина • № 4, 2015, С. 16-22
Влияние аллотрансплантации лимфоцитов селезёнки на развитие сахарного диабета 1 типа
P.A. Клёсов, В.Н. Каркищенко, О.И. Степанова, Е.Б. Шустов
ФГБУН«Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская область Контактная информация: Клёсов Роман Алексеевич, [email protected]
В работе представлены данные по аллотрансплантации спленоцитов от крыс с сахарным диабетом 1 типа генетически здоровым животным, у которых был сформирован симптомокомплекс, соответствующий клиническим, биохимическим и гистологическим проявлениям данного заболевания. Экспериментально доказано наличие переноса иммунной информации в процессе формирования у животных сахарного диабета 1 типа.
Ключевые слова: биомодель, сахарный диабет 1 типа, крысы, спленоциты, лимфоциты.
Введение
Сахарный диабет 1 типа (СД 1 типа) -метаболическое заболевание, характеризующееся гипергликемией, в основе которого лежит деструкция Р-клеток, приводящая к абсолютному дефициту инсулина. Разрушение Р-клеток (в большинстве случаев - среди людей европейской популяции) имеет аутоиммунную природу (с участием клеточного и гуморального звена иммунной системы) [6].
При манифестации СД 1 типа почти всегда обнаруживается воспалительная реакция в поджелудочной железе - инсу-лит. Иммуногистохимическое исследование показало [7], что в островках Лан-герганса поджелудочной железы крыс с аутоиммунным СД 1 типа среди клеток инфильтрата преобладают Т-лимфоци-ты, В-лимфоциты, натуральные киллеры и макрофаги. При этом инфильтрат образуется только в тех островках, в которых есть Р-клетки. В островках, продуцирующих глюкагон, соматоста-тин, но не содержащих Р-клеток, нет и инфильтрата. Такая локальность, то-
чечность реакции, указывает на то, что причиной ее являются компоненты и свойства, присущие только Р-клеткам. Как показывают многие наблюдения, специфичность повреждения Р-клеток может быть следствием клеточной аутоиммунной реакции.
Известно, что в условиях хронического патологического процесса во всех органах иммунной системы (костный мозг, тимус и селезенка) [2] наступают морфофункциональные изменения, которые характеризуются развитием вторичного иммунодефицитного состояния с ослаблением клеточного и гуморального иммунитета, цитокиновым дисбалансом, перераспределением иммунных клеток в организме и нарушением их информационной и миграционной активности [3]. При хроническом заболевании в тканеспецифическом повреждении органах активно участвуют Т-лимфоциты. Именно Т-лимфоцитам присуща способность активно участвовать в переносе иммунной информации о патологическом процессе [1].
Целью работы являлась оценка возможности переноса лимфоцитами селезёнки патогенетической иммунной информации генетически здоровым животным и создание аутоиммунной биомодели СД 1 типа.
Материалы и методы
Исследования проводились в ФГБУН НЦБМТ ФМБА России на белых лабораторных крысах-самцах популяции линий массой 242±8,3 г в возрасте 2-3 мес. Животные поступили из филиала «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России и были взяты в эксперимент методом случайной выборки.
Кормление осуществлялось стандартным полнорационным гранулированным (экструдированным) комбикормом для лабораторных животных ПК-120 ГОСТ Р 51849-2001 Р.5, доступ к воде и корму - свободный. Крыс содержали в микроизоляторной системе Яа1г18о8у81ет по 5 особей, при температуре 20-22°С. Содержание животных осуществлялось в соответствии с Правилами надлежащей лабораторной практики (ОЬР) и Приказом Минздравсоц-развития РФ №708н от 23 августа 2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Животные были разделены на контрольную (п=20) и экспериментальную группы (п=25). Исходно все животные были генетически здоровы.
Источником спленоцитов, несущих иммунную информацию о патологическом процессе при формировании СД 1 типа, была группа крыс, у которых предварительно был создан аутоиммунный СД 1 типа [4]. Аутоиммунный процесс формировался путём последовательного введения животным стрептозотоцина и неполного адъюванта Фрейнда. Вери-
фикация СД 1 типа была подтверждена клиническими, биохимическими и гистологическими методами.
Для проведения аллотрансплантации спленоцитов под эфирным наркозом у крыс с моделью СД 1 типа проводили ла-паротомию и спленэктомию. Селезенку переносили в стерильный стеклянный гомогенизатор с физиологическим раствором в объеме 15 мл. Тщательно гомогенизировали селезенку до практически полного ее разрушения, затем этот раствор наслаивали на раствор Ficоll-Раquе (1,077 г/см3). Пробирку центрифугировали в течение 40 мин при 500 об/мин. После центрифугирования супернатант удаляли, клетки (лимфоциты) из интерфазы собирали и ресуспендировали в физиологическом растворе для отмывки от раствора Ficоll-Раquе. Производили подсчет выделенных клеток (рис. 1). Выделенные спленоциты вводили вну-трибрюшинно [5] в количестве 450-550 тыс. клеток в 0,5 мл физиологического раствора.
Рис. 1. Выделенные и подготовленные для введения Т-лимфоциты (селезенки) крыс с СД 1 типа, ув. х200.
Для выявления клинических, биохимических и гистологических признаков СД 1 типа у экспериментальных животных были проведены исследования в динамике.
17
Вюше&сте • № 4, 2015
Гликозилированный гемоглобин (HbAlc) в крови (5 мкл) определяли на приборе NycoCard REDER II (Норвегия). Тест основан на методе борат-ного аффинного анализа, диапазон измерения - от 3 до 18%.
Содержание глюкозы в крови измеряли на приборе Accu-CHEK (Швейцария). Принцип работы прибора основан на фотометрическом определении уровня глюкозы в свежей капиллярной (венозной) крови. Каплю крови наносили на тест-полоску. Диапазон измерения составлял от 0,6 до 33,3 ммоль/л.
Проводился постоянный контроль массы тела животных и суточного объёма выпитой воды.
Для гистологических исследований использовался микроскоп Nikon Eclipse TS 100 (Япония) с программным обеспечением, срезы окрашивались гематоксилин-эозином.
Результаты и их обсуждение
В ходе исследования было показано, что уже на третью-четвёртую не-
дели после введения спленоцитов у животных экспериментальной группы отмечалось развитие клинических признаков СД 1 типа (полиурия, полифагия, снижение веса). На 4-ю неделю эксперимента замечено достоверное снижение массы тела животных экспериментальной группы (219±7,2 г) по сравнению с животными контрольной группы (276±9,6 г).
Через 3 мес. после аллотранс-плантации спленоцитов клинические и морфологические показатели животных экспериментальной группы имели достоверные отличия от таковых, полученных в контрольной группе (повышение уровня глюкозы в крови до 13,5±0,76 ммоль/л, в то время как уровень НЬА1с оставался в пределах нормы - 4,1±0,34%). К 5-му мес. исследования отмечалось достоверное и значительное повышение уровня глюкозы в крови до 26,3±0,88 ммоль/л (рис. 2) и повышение уровня НЬА1с до 9,4±0,25% (рис. 3).
уровень глюкозы, ммоль/л
1 неделя 2 неделя 3 неделя 4 неделя 2 месяц 3 месяц 4 месяц 5 месяц
□ СД 1 ■ Норма
Рис. 2. Динамика изменения содержания глюкозы в крови после аллотрансплантации спленоцитов.
Рис. 3. Динамика изменения НЬА1с в крови лабораторных животных после аллотрансплантации спленоцитов.
Масса животных экспериментальной группы уменьшалась на протяжении всего эксперимента: так, к 5-му мес. она составляла 174±12,5 г, в то время как у животных контрольной группы -364±18,4 г (рис. 4).
При гистологическом исследовании органов, участвующих в патогенезе СД 1 типа, получены следующие результаты.
В гистологической картине органов животных контрольной группы отличий от нормы не выявлено.
Поджелудочная железа (рис. 5): дольковое строение поджелудочной железы экспериментальных животных сохранено. Экзокринная часть представлена панкреатическими ацинуса-ми, вставочными внутри- и междоль-ковыми протоками, между ацинусами отмечаются сосуды умеренного кровенаполнения (кровеносные капилляры, междольковые артериолы и артерии), единичные нервные стволики. Инсули-новые островки не просматриваются. Протоки поджелудочной железы выст-
Рис. 4. Динамика изменения массы тела животных после аллотрансплантации спленоцитов.
19
Biomedicine • № 4, 2015
Рис. 5. Ткань поджелудочной железы крыс через 5 мес. после переноса спленоцитов от крыс с аутоиммунным СД 1 типа. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. х200. А - контрольная группа; Б - экспериментальная группа.
ланы однорядным кубическим эпителием с базально-расположенными небольшими ядрами без видимых ядрышек. В некоторых полях зрения умеренное разрастание соединительной ткани в строме с ее разволокнением, перекалибровкой долек.
Печень (рис. 6): полнокровие центральных вен, синусоидов, мелко-, сред-некапельная жировая дистрофия гепа-тоцитов экспериментальных животных. Гепатоциты всех отделов долек в состоянии выраженной, преимущественно мелкокапельной, жировой дистрофии, с признаками пылевидного ожирения гепатоцитов. Отмечаются признаки гибели части гепатоцитов, преимуще-
ственно центральных отделов долек, с кариопикнозом и фрагментацией ядер, появлением гиперплазированных двуя-дерных гепатоцитов.
Почка (рис. 7): выраженное полнокровие капиллярных петель клубочков, коллапс капиллярных петель клубочков, некроз эпителия дистальных и проксимальных канальцев экспериментальных животных. Эпителий проксимальных и дистальных канальцев некротизиро-ван, слущен в просвет (плазморексис, плазмолизис, кариорексис, кариолизис), отмечаются участки фокального и тотального тубулорексиса. Выраженный отек стромы мозгового вещества, выраженное полнокровие сосудов мозгового
Рис. 6. Ткань печени крыс через 5 мес. после адаптивного переноса спленоцитов от крыс с аутоиммунным СД 1 типа. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. х200. А - контрольная группа; Б - экспериментальная группа.
Рис. 7. Ткань почки крыс через 5 месяцев после адаптивного переноса спленоцитов от крыс с аутоиммунным СД I типа. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. х200. А - контрольная группа; Б - экспериментальная группа.
вещества с мелкими и крупными пери-тубарными кровоизлияниями.
Селезёнка (рис. 8): нарушение ги-стоструктуры селезёнки экспериментальных животных за счёт обширных участков некрозов без полиморфно-клеточной инфильтрации, обширных участков апоптоза, полнокровие сосудов красной пульпы. По периферии селезёночной артерии отмечаются остаточные скопления малых лимфоцитов, полнокровие сосудов красной пульпы, гиалиноз трабекул.
Полученные биохимические и морфологические показатели животных
экспериментальной группы соответствуют типичной картине СД 1 типа.
Выводы
1. Клинические и биохимические исследования, проводившиеся на крысах, перенесших аллотрансплантацию спленоцитов от животных со сформированным аутоиммунным СД 1 типа, выявили стойкие изменения исследуемых показателей, свидетельствующие о развитии СД 1 типа, проявлявшиеся в стойком и достоверном снижении массы животных, стабильной гипергликемии, полидипсии и полиурии.
Рис. 8. Ткань селезёнки крыс через 5 мес. после адаптивного переноса спленоцитов от крыс с аутоиммунным СД 1 типа. Окраска гематоксилин-эозином. Ув. х200. А - контрольная группа; Б - экспериментальная группа.
21
Вюше&сте • № 4, 2015
2. Типичные для СД 1 типа изменения начинаются через 3-4 недели после аллотрансплантации.
3. Через 5 мес. после аллотрансплан-тации спленоцитов генетически здоровым животным проявляются структурно-морфологические изменения в поджелудочной железе, почках, печени и селезёнке.
4. Метод аллотрансплантации спленоцитов может быть рекомендован для биомоделирования СД 1 типа у генетически здоровых животных.
Список литературы
1. Бабаева А.Г., Геворкян Н.М., Зотиков Е.А.
Роль лимфоцитов в оперативном изменении программы развития тканей. - М.: Изд. РАМН, 2009. 107 с.
2. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В.
и др. Состояние пулов стволовых клеток при экспериментальном сахарном диабете // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2006. № 3. С. 123-127.
3. Кветной И.М., Ярилин A.A., Полякова
B.О., Князькин И.В. Нейроиммуноэндокри-нология тимуса. - СПб. 2005. 157 с.
4. Клёсов P.A., Каркищенко В.Н., Степанова О.И., Ревякин А.О. Оптимизация биомодели сахарного диабета 1 типа // Биомедицина. 2014. № 4. С. 25-30.
5. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / под ред. Н.Н. Каркищенко, С.В. Грачева. - М.: Профиль-2
C. 2010. 358 с.
6. Genuth S., et al. Follow-up report on the diagnosis of diabetes mellitus // Diabetes Care. 2003.No. 26. P. 3160-3167.
7. Yoon J. W., Jun H.S. Autoimmune destruction of pancreatic beta cells // Am. J. of Therapeutics. 2005. No. 12(6). P. 580-591.
Effect of transplantation of the spleen lymphocytes in the development of type 1 diabetes
R.A. Klesov, V.N. Karkischenko, O.I. Stepanova, E.B. Shustov
The paper presents data on transplantation of splenocytes of rats with type 1 diabetes to genetically healthy animals that have been generated syndrome, appropriate clinical, biochemical and histological manifestations of the disease. Experimentally proved the existence of the transfer immune information in the formation oftype 1 diabetes in animals.
Key words: biomodel, type 1 diabetes, rats, splenocytes, lymphocytes.
