CC BY
163
Биомедицина . № 4, 2014, С. 25-30
Оптимизация биомодели сахарного диабета 1 типа
P.A. Клёсов, В.Н. Каркищенко, О.И. Степанова, А.О. Ревякин
ФГБУН«Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская область Контактная информация: Клёсов Роман Алексеевич, klesrom@mail.ru
В работе представлены данные экспериментального моделирования сахарного диабета 1 типа на крысах. Предложены дозы и альтернативный метод введения стрептозотоцина и неполного адъюван-та Фрейнда для получения сахарного диабета 1 типа на генетически не предрасположенных к развитию аутоиммунных заболеваний животных.
Ключевые слова: биомодель, сахарный диабет 1 типа, крысы, стрептозотоцин, неполный адъю-вант Фрейнда.
Введение
Сахарный диабет (СД) 1 типа -острая социальная болезнь XXI века, по-прежнему остаётся одной из наиболее частых причин ранней инвалиди-зации и гибели больных во всех странах мира. По данным экспертов ВОЗ, СД занимает третье место в структуре смертности населения после сердечнососудистых и онкологических заболеваний. В 2000 г. количество больных СД составило более 150 млн чел. Прогнозируется, что к 2025 г. их число достигнет 300 млн чел., причем на долю больных СД 1 типа приходится около 10%. Если признать медленно прогрессирующий аутоиммунный СД взрослых вариантом течения СД 1 типа, то процент больных СД 1 типа станет существенно выше [4]. На данный момент известна одна иммунопатологическая аутоиммунная модель СД 1 типа на генетически здоровых (не предрасположенных) животных, но при
попытке её воссоздания возникла проблема высокой смертности - 65% среди экспериментальных животных от введения активных действующих веществ.
Обычно используемые экспериментальные модели СД 1 типа - аллокса-новая и стрептозотоциновая - являются цитотоксическими, избирательно повреждают Р-клетки поджелудочной железы и сопровождаются фиброзирующей регенерацией поджелудочной железы без сопутствующего развития в ней аутоиммунного повреждения [5].
В результате было принято решение разработать новые подходы и методы создания биомодели сахарного диабета 1 типа у крыс.
Целью эксперимента являлась оптимизация ныне существующей стреп-тозотоциновой биомодели СД 1 типа у крыс и разработка новых методов, позволяющих добиться более качественных результатов в эксперименте.
Материалы и методы
Исследования проводились в Научном центре биомедицинских технологий ФМБА России на белых лабораторных крысах-самцах массой 520-560 г
в возрасте 8-10 мес. Лабораторные животные поступили из филиала НЦБМТ ФМБА России «Андреевка». Животные были взяты в эксперимент методом случайной выборки.
Кормление осуществлялось стандартным полнорационным комбикормом, доступ к воде и корму - свободный. Крысы содержались в вентилируемых клетках системы «Кшг18о8у81ет» при температуре 20-22оС, по 5 особей. Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами лабораторной практики (ОЬР) и Приказом Мин-здравсоцразвития РФ №708н от 23 августа 2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
Животные были поделены на две группы: контрольная группа (п=40) и опытная группа (п=54). Двукратно поочередно в течение 2 недель с интервалом 24 ч вводили в первый день неполный адъювант Фрейнда (А.), во второй день - навеску стрептозотоцина (8^.), растворённого в 1 мл воды для инъекций. Дозировки и объёмы введения представлены в таблице. Введение осуществляли подкожно, в паховую складку [3].
Стрептозотоцин - противоопухолевое средство алкилирующего действия из группы производных нитро-зомочевины, вещество, токсичное для бета-клеток поджелудочной железы. По структуре достаточно напоминает молекулы сахара, чтобы захватываться и транспортироваться внутрь клеток. Ингибирует митоз, преимущественно 02-фазу. Механизм противоопухолевого действия полностью не изучен, но, вероятно, обусловлен образованием ме-тилкарбониевых ионов, которые вызывают алкилирование или связываются с различными внутриклеточными структурами, включая нуклеиновые кислоты. Образует поперечные сшивки между нитями ДНК, что и приводит к ингиби-рованию её синтеза; на синтез РНК и белка влияет в незначительной степени. Оказывает выраженный гипергликеми-ческий эффект, вызывая необратимое повреждение Р-клеток поджелудочной железы [2].
Неполный адъювант Фрейнда -адьювант, представляющий собой масляную эмульсию, содержащую дериваты ланолина (жирные кислоты). Используется для неспецифической активации иммунной системы [2].
Для достоверного доказательства наличия СД 1 типа у экспериментальных животных были проведены исследова-
Таблица
Схема введения препаратов крысам
Группа животных 1-е введение 2-е введение 3-е введение
подкожно, раз в 7 дней
1-й день 2-й день 1-й день 2-й день 1-й день 2-й день
Контрольная группа без введения без введения без введения
Опытная группа 1 мл А. 15 мг/кг Эй. 1 мл А. 20 мг/кг Эй. 1 мл А. 25 мг/кг Эй.
ния в динамике. Гликозилированный гемоглобин (HbAlc) в крови (5 мкл) определяли на приборе NycoCard REDER II (Норвегия), который предназначен для быстрого определения in vitro HbAlc. Данный тест основан на методе борат-ного аффинного анализа. Диапазон измерения - 3-18%.
Помимо этого, вёлся постоянный контроль быстрого определения in vitro HbAlc. Данный тест основан на методе боратного аффинного анализа. Диапазон измерения - 3-18%.
Содержание глюкозы в крови измеряли на приборе Accu-CHEK (Швейцария). Принцип работы прибора основан на фотометрическом определении уровня глюкозы в свежей капиллярной (венозной) крови. Каплю крови (2-5 мкл) наносили на тест-полоску. Диапазон измерения составлял 0,6-33,3 ммоль/л от массы животных и суточного объёма выпитой воды.
Результаты и их обсуждение
В ходе эксперимента показано, что уже на вторую неделю после введения
препаратов у животных опытной группы отмечалось повышение уровня глюкозы в крови до 10,9±0,84 ммоль/л, в то время как уровень НЬА1с оставался в пределах нормы - 3,9±0,22%. Далее, на третью неделю после введения препаратов, отмечалось достоверное и значительное повышение уровня глюкозы в кровидо 18,4±0,68 ммоль/л (рис. 1).
Уровень НЬА1с повысился до 9,2±0,28% на 4-й неделе (рис. 2), и это повышение носит пролонгированный характер. Так, на 9-ю неделю эксперимента средние значения уровня глюкозы у животных опытной группы составляли 31,6±0,45 ммоль/л, а НЬА1с - 9,7±0,36%.
В течение эксперимента велись наблюдения за изменениями массы животных контрольной и опытной групп. Уже с 3-й недели замечено достоверное изменение массы животных опытной группы (501±14,4 г) по сравнению с контрольной группой (645±13,7) г. Масса животных опытной группы уменьшалась на протяжении всего эксперимента: к 9-й неделе средний показатель
урййинь г Лике МНИ. IMOHbAl
сш. Ш L II <1 ж и 1 1 т.
lfifliwia з^мч ^«¡^л Ьиемпи- о неделя Знвд^ч
оСД ■ ИЧСЩЫ
Рис. 1. Динамика уровня гликемии крови лабораторных животных контрольной и опытной групп.
уровеньНЬД1с, %
12 т
а
I " ! е
I *
е 5
о
1 6 Т н*л«пя Эн^нн 9 И*Д«1Й
Рис. 2. Динамика НЬА1с в крови лабораторных животных контрольной и опытной групп.
массы животного составлял 367±19,7 г, в то время как у животных контрольной группы этот показатель составлял 696±21,6г(рис. 3).
Суточный мониторинг объёмов выпитой воды (рис. 4) также показал различия между контрольной и опытной группами. Так, на 2-ю неделю моделирования СД 1 типа у животных опытной группы отмечалось увеличение суточного объёма выпитой воды до 120±4,44 мл, в то время как в конт-
рольной группе аналогичный показатель составлял 40±6,66 мл. Этот факт обнаруживался на протяжении всего эксперимента: на 9-ю неделю средний суточный объём выпитой воды у животных опытной группы доходил до 365±25,5 мл, по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе, составлявшем 40±3,33 мл. Данное наблюдение свидетельствует об одном из клинических симптомов СД 1 типа - полидипсии.
мэсса крысы, г
—I—-^—I——-1—-,—- -1——,—--—I—-^--
гедел* Цфдая 3 неделя * ьедегд ■:, недая б недтн Г вделя я неделя £ нцдап
т;д 1 аНсрш
Рис. 3. Динамика массы животных контрольной и опытной групп.
сугочшн ВЫПИТОЙ еоДыь мП
мл
§ зоо 2 2Ц | :со
; 141 | 1(Ш 50 О
ь
-^ 1
ш 1Н 1 1
Зн^е™ С неделя С чеееяя Тнадэтя Змм-?гя 9 надели
нСД ^ иИч>ма|
Рис. 4. Суточный объём выпитой воды животными контрольной и опытной групп.
Одним из наиболее интересных результатов исследования явилось появление в опытной группе животных гангренозных повреждений хвостов (рис. 5). Из 54 экспериментальных животных данная патология наблюдалась у 11. Причём первые признаки гангренозных процессов проявились на 52 сутки эксперимента, что соответствует 6 годам течения СД 1 типа у человека, и имели
динамику воспалительного процесса, переходящего в некроз. Подобные изменения наблюдались только у животных опытной группы. Появление гангренозных поражений хвостов лабораторных крыс позволяет говорить о создании аналога синдрома диабетической стопы у человека на экспериментальной биологической модели метаболического синдрома СД 1 типа.
Рис. 5. Гангренозные поражения хвостов животных опытной группы.
Выводы
В результате проведённых исследований предложен альтернативный метод моделирования СД 1 типа у крыс. В отличие от методики [1], внутри-брюшинный метод введения заменён на подкожный, как более безопасный и удобный. Цитратный буфер, ввиду его токсичности, заменён на воду для инъекций. Оптимизирована однородность заболевания по группе. В ходе эксперимента доказана адекватность полученной биомодели наличием соответствующего клинического симптомокомлекса, характерного для сахарного диабета 1 типа (гипергликемия, высокий уровень НЬА1с, сильная потеря массы, полидипсия и полиурия). Создана биологическая модель метаболического синдрома СД 1 типа в виде гангренозного поражения хвостов крыс опытной группы, анало-
гичная синдрому диабетической стопы
у человека. Работа по данной теме продолжается.
Список литературы
1. Закирьянов А.Р., Онищенко Н.А., Клименко Е.Д., Поздняков О.М., Великий Д.А.
Способ моделирования сахарного диабета 1 типа у крыс (Патент № RU 02400822).
2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российскаяэнциклопедия. 1994.
3. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / под ред. Н.Н. Каркищенко, С.В. Грачева. - М.: Профиль-2С. 2010. 358 с.
4. Gillespie К.М. Туре 1 diabetes: pathogenesis and prevention. CMAJ. 2006; 175(2).
5. Nir Т., Melton D.A., Dor. Y. Recovery from diabetes in mice by p cell regeneration // Journal of Clinical Investigation. 2007. 117(9): 25532561.
6. Vavra J.J., Deboer C., Dietz A., Hanka L.J., Sokolski W.T. Streptozotocin, a new antibacte-rialantibiotic. 1959. Antibiot. Annu. 7: 230-5.
Optimization of biomodel type 1 diabetes
R.A. Klesov, V.N. Karkischenko, O.I. Stepanova, A.O. Revyakin
The research presents the experimental simulation oftype 1 diabetes in rats. The dose and method ofin-troduction streptozotocine, and incomplete Freund's adjuvant for type 1 diabetes were proposed for animals that are not genetically predisposed to the development ofautoimmune diseases.
Key words: biomodel, type 1 diabetes, rats, streptozotocine, incomplete Freund's adjuvant.
