CC BY
29
УДК 633.112.9:631.524.8
ВЛИЯНИЕ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНА У1У1РАКОиБ-1 НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ПРОРАСТАНИЮ НА КОРНЮ У ЯРОВОЙ ТРИТИКАЛЕ*
Н.К. МАЙЕР, М.Г. ДИВАШУК, П.Ю. КРУПИН, А.А. СОЛОВЬЁВ (Кафедра генетики, центр молекуля рной биотехнологии)
В работе представлены результаты анализа аллельного состояния гена VI-‘и1рагоиз-1 двух серий сестринских линий яровой тритикале, полученных путем отбора устойчивых и неустойчивых растений в Е3. Показано, что у линий — потомков неустойчивых форм большая часть растений (83,3%) имеют аллель Vp-1Ba. Среди линий — потомков устойчивых растений 35% линий характеризуются наличием аллеля Vp-1Bc, 45% — наличием аллеля Vp-1Ba, 25% — являлись гетерозиготами по этому гену, что, вероятно, обусловлено доминантной природой устойчивости и отбором в Е3 наряду с гомозиготами гетерозигот по данному гену. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования 8Т8-маркера Vp-1B в селекции на устойчивость к прорастанию на корню у тритикале.
j+>7%";% с+о"а: тритикале, прорастание на корню, замещения хромосом, БТБ-маркер, селекция с использованием молекуля рных маркеров (МАБ).
Тритикале — культура, обладающая большим потенциалом продуктивности и способная обеспечить стабильность рынка зерна. Однако одним из факторов, сдерживающих её широкое распространение, является склонность к доуборочному прорастанию зерна в колосе. Эта проблема особенно актуальна дл районов Нечерноземья, где прохладная влажная погода во врем уборки часто вызывает прорастание на корню. Предуборочное прорастание наносит значительный вред: снижается урожай, ухудшается конечное качество зерна, снижается посевна ценность семенного материала [9]. Один из путей решения данной проблемы — создание устойчивых форм тритикале.
Устойчивость к прорастанию на корню вл етс комплексным признаком, детерминируемым множеством генетических факторов, проявление которых в значительной степени под-
вержено влия нию абиотических условий.
На пшенице выя влено несколько QTL (локусов количественных признаков) и генов, влия ющих на данный признак. При этом стоит отметить, что различные авторы локализуют эти QTL на разных хромосомах. Так, у пшеницы к насто щему времени они локализованы на всех хромосомах кроме 1 Б [3, 5, 8]. У ржи QTL устойчивости к прорастанию на корню также локализованы на всех 7 хромосомах, при этом степень их про влени варьировала по годам исследований [12, 14].
Однако использование QTL устойчивости к прорастанию на корню в селекции и генетических исследовани х весьма затруднено из-за прив зки QTL к конкретной комбинации И]Ь, в которой он был картирован.
Ген Уіьіратоп8-1 (Ур-1) является одним из важных регуляторов поздне-
* Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» гК № 02.740.1l.0286.
го эмбриогенеза у кукурузы и пшеницы [6]. Фенотипы мутантов кукурузы по гену Vp-1 свидетельствуют, что ген выполн ет две различных функции: перва — обеспечение созревания зародыша, вторая — обеспечение перехода семени в покой и репресси прорастания . Ген Vp-1 клонирован и секвенирован у нескольких видов растений. Три гомолога гена Vp-1 клонированы у пшеницы [15]. Они локализованы в длинных плечах хромосом третьей гомеологичной группы — ЗА, ЗВ и 3Б [10]. Анализ структуры и экспрессии этих трех генов показал, что каждый из них потенциально кодирует полноразмерную цепь аминокислот. Однако некорректный сплайсинг про-матричной РНК приводит к аберрантным продуктам трансл ции. Изучение структуры транскриптов у исходных и родственных видов свидетельствует, что изменени транскрипции произошли при введении пшеницы в культуру [7]. Исследование уровня экспрессии гена Vp-1 в созревающих зародышах устойчивых и неустойчивых сортов выя вило положительную кор-реля цию между покоем семя н и чувствительностью к АБК [10]. Встраивание гена Vp-1 из Avena fatua в мя гкую пшеницу приводило к повышению устойчивости к прорастанию на корню [7].
Исследование последовательностей генов Vp-1 геномов А и Б не выя вило полиморфизма. По гену Vp-1 из генома В обнаружен полиморфизм по его структуре. Аллель Vp-1Bb, 845 п.н., содержал инсерцию 193 п.н. в третьем интроне гена. Аллель Vp-1Bc, 569 п.н., имел делецию 83 п.н. в той же области. Эти аллели содержались в 90% сортов, устойчивых к прорастанию на корню. У 90% сортов, неустойчивых к прорастанию на корню, в этом гене делеции и инсерции отсутствовали, они имели аллель Vp-1B=, 652 п.н. [15]. Анализ европейских сортов мягкой пшеницы показал, что наряду с этими аллел ми встречаетс новый ал-
лель этого гена Vp-1Bd, 627 п.н., с де-лецией 25 п.н. в том же регионе [13].
Полиморфизм по гену Vp-1B позволил разработать БТБ-маркер, ассо-циирующийс с устойчивостью к прорастанию. Данный маркер вл етс эффективным кодоминантным маркером, позволя ющим выя вля ть все аллели гена Vp-1B, и рекомендуется для использовани в МАБ-селекции с
применением молекул рных маркеров [13, 15].
На кафедре генетики РГАУ -МСХА имени К.А. Тимирязева ведет-с работа по созданию линий ровых тритикале, устойчивых к прорастанию на корню. При объединении в одном геноме генетических систем пшеницы и ржи возникает проблема их взаимодействия между собой и определения роли каждой системы в устойчивости к прорастанию. Изучение проя вления генов пшеницы в геноме тритикале я вля ется важным этапом в улучшении самой тритикале.
Материалы и методы
Материалом служили две группы сестринский линий ровой тритикале, созданные на кафедре генетики РГАУ - МСХА имени К.А. Тимиря-зева. Первая группа (И) я вля ется потомством Е5 (13) отобранных в Е3 растений, устойчивых к прорастанию на корню, вторая — неустойчивых (Б). Эти линии получены от скрещивания сорта АЬасо (геномная формула ААВВИИ) с линией гескаплоидной тритикале 131/7.
ДНК выдел ли из молодых листьев и корешков по методу [2] с некоторыми модификаци ми.
В работе использовали БТБ-мар-кер на ген Viviparous-1, локализованный на хромосоме 3В [15], а также ББИ-маркер Хдшш 482, локализованный на хромосоме 2Б.
Все праймеры синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва).
Продукты ПЦР раздел ли в 1,5%-м агарозном геле с буфером ТВЕ при на-
пря женности поля 6 V/см. В качестве маркера размеров использовали «100 bp leader» (Fermentas).
После окрашивания бромистым этидием продукты ПЦР визуализировали с помощью трансиллюминатора и документировали цифровой камерой «Samsung».
Результаты и их обсуждение
В ходе наших исследований с помощью молекуля рных маркеров были проанализированы две группы сестринских линий ровой тритикале. Перва группа представл ет собой потомство отобранных в F3 растений, устойчивых к прорастанию на корню (R), вторая — неустойчивых (S).
Анализ аллельного состояния гена Vp-1 у набора сестринских линий выя вил расщепление между линия ми как среди форм, отобранных из устойчивых растений, так и неустойчивых (таблица). Среди линий — потомков устойчивых растений — 35% характеризуются наличием аллеля Vp-1Bc, 45% — наличием аллеля Vp-1Ba,
25% являлись гетерозиготами по этому гену. Среди линий — потомков неустойчивых форм — лишь 16,7% характеризуютс аллельным состо -нием Vp-1Bc, в то время как остальные 83,3% — аллельным состоянием Vp-1Ba.
Эти результаты свидетельствуют о преобладании в поздних поколени х аллеля Vp-1Ba у потомков, отобранных из попул ции F3 неустойчивых (S) растений. Среди потомков устойчивых растений из попул ции F3 наблюдает-с расщепление и нар ду с обеими гомозиготами встречаютс гетерозиготы по данному гену (рисунок).
Подобное распределение аллелей гена Vp-1 может быть вызвано доминантной природой устойчивости к прорастанию на корню, что привело к отбору в F3 как гомозигот Vp-1Bc/ Vp-1Bc, так и гетерозигот Vp-1Bc/ Vp-1Ba, которые могли обладать сходным фенотипическим про вле-
Аллельное состояние гена Ур-1 у серии сестринских линий яровой тритикале
Линии от устойчивых форм Линии от неустойчивых форм
линия аллель гена Vp1B3* линия аллель гена Vp1B3
R-1 Vp-1Bc S-21 Vp-1Bc
R-2 Г S-22 Vp-1Ba
R-3 Г S-23 Vp-1Bc
R-4 Vp-1Bc S-24 Vp-1Bc
R-5 Vp-1Ba S-25 Vp-1Ba
R-6 Vp-1Ba S-26 Vp-1Ba
R-7 Vp-1Ba S-27 Vp-1Ba
R-8 Vp-1Bc S-28 Vp-1Ba
R-9 Vp-1Ba S-29 Vp-1Ba
R-10 Vp-1Bc S-30 Vp-1Ba
R-11 Г S-31 Vp-1Ba
R-12 Vp-1Ba S-32 Vp-1Ba
R-13 Vp-1Ba S-33 Vp-1Ba
R-14 Г S-34 Vp-1Ba
R-15 Vp-1Bc S-35 Vp-1Ba
R-16 Vp-1Ba S-36 Vp-1Ba
R-17 Vp-1Bc S-37 Vp-1Ba
R-18 Vp-1Bc S-38 Vp-1Ba
R-19 Vp-1Ba
R-20 Г
П р и м е ч а н и е: * Г — гетерозиготы по гену Vp1B3.
нием. При этом доминантный аллель «маскировал» эффект рецессивного аллеля, гомозиготы по которому могли выщепитьс в более поздних поколе-ни х. В группе Б-линий исходные неустойчивые растени оказались преимущественно гомозиготами Vp-1B=/ Vp-1B=, что и могло стать причиной однородности п того поколени . Это согласуетс с ранее опубликованными материалами по генетическому анализу устойчивости к прорастанию зерна на корню в данной комбинации [1].
В то же время закономерности проя вления гена Vp-1 в геноме пшеницы нельз напр мую примен ть к экспрессии данного гена в геноме тритикале. Ген Vp-1, я вляя сь одним из основных регул торов поздних этапов развития зародыша, у тритикале экс-прессируетс нар ду с экспрессией множества генов генома ржи, в т.ч.
Электрофореграмма ПЦР-продуктов Vp-1-гена у анализируемых растений
и ортолога Vp-1, предположительно локализованного в длинном плече хромосомы 3И. Однако полученные нами на тритикале данные в целом свидетельствуют, что аллели гена Vp-1 имеют сходное проя вление как у пшеницы, так и у тритикале.
Заключение
Исследование полиморфизма по гену Viviparous-1 двух серий (13) сестрин-
ских линий ровой тритикале показало, что линии — потомки неустойчивых форм — в основном несут аллель Vp-1Ba (83,3%). Среди линий — потомков устойчивых растений — 35% характеризуются наличием аллеля Vp-lBc, 45% — наличием аллеля Vp-1Ba, 25% являлись гетерозиготами. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования БТБ-маркера Vp-1B в селекции на устойчивость к прорастанию на корню у тритикале.
Библиографический список
1. Данилкин Н.М., Соловьёв А.А. Устойчивость к прррорастанию на корню линий и гибридов яровой тритикале // Известия ТСХА, 2008. Вып. 1. С. 81-85.
2. Bernatzky R., Tanksley S.D. Toward a saturated linkage map in tomato based on isozyme and random cDNA sequences. Genetics, 1986, 112: 887-898.
3. Groos C., Gay G., Perretant M.R., Gervais L., Bernald M., Dedryver F., Char-met G. Study of the relationship between pre-harvest sprouting and grain color by quantitative trait loci analysis in a white 4 red grain bread-wheat cross. Theor. Appl. Genet, 2002. 104: 39-47.
4. Korzun V., Malyshev S., Voylokov A.V., Borner A. A genetic map of rye (Secale cereale L.) combining RFLP, isozyme, protein, microsatellite and gene loci. Theoret. Appl. Genet, 2001. 102: 709-717.
5. Kuwal P.L., Singh R., Balyan H.S., Gupta P.K. Genetic basis of pre-harvest sprouting tolerance using single-locus and two-locus QTL analyses in bread wheat. Functional and Integrative Genomics, 2004. 4: 94-101.
6. McCarty D.R., Carson C.B., Stinard P.S., Robertson D.S. Molecular analysis of viviparous-1: An abscisic acid-insensitive mutant of maize. Plant Cell., 1989. 1(5): 523-532.
7. McKibbin R.S., Wilkinson M.D., Bailey P.C., Flintham J.E., Andrew L.M., Laz-zeri P.A., Gale M.D., Lenton J.R., Holdsworth M.J. Transcripts of Vp-1 homeolo-gues are misspliced in modern wheat and ancestral species. PNAS, 2002. 99. 15: 10203-10208.
8. Mori M., Uchino N., Chono M., Kato K., Miura H. Mapping QTLs for grain dormancy on wheat chromosome 3A and the group 4 chromosomes, and their combined effect. Theoret. Appl. Genet, 2005. 110: 1315-1323.
9. Mos M., Wyjtowicz T. The effect of seed sprouting damage on field emergence and yield of spring triticale. J. Cent. Eur. Agric, 2004. 5. 4: 251-258.
10. Nakamura S., Toyama T. Isolation of a Vp1 homologue from wheat and analysis of its expression in embryos of dormant and non-dormant cultivars. J. Exp. Botany, 2001. 52. 357: 875-876.
11. Osa M., Kato K., Mori M., Shindo C., Torada A., Miura H. Mapping QTLs for seed dormancy and the Vp1 homologue on chromosome 3A in wheat. Theoret. Appl. Genet, 2003. 106: 1491-1496.
12. Rybka K. An approach to identification of rye chromosomes affecting the preharvest sprouting in triticale. J. Appl. Genet, 2003. 44. 4: 491-496.
13. Xia L.Q., Yang Y. , Ma Y.Z., Chen X.M., He Z.H., Wilkinson M., Jones H.D., Shewry P.R. What Can Viviparous-1 Gene Tell Us About Wheat Pre-Harvest Sprouting? 11th International Symposium on Pre-harvest Sprouting in Cereals, 2007.
14. Xiao-bo R., Xiu-jin L., Deng-cai L., Jia-li W.,You-liang Z. Mapping QTLs for pre-harvest sprouting tolerance on chromosome 2D in a synthetic hexaploid wheat X common wheat cross. J. Appl. Genet, 2008. 49, 4: 333-341.
15. Yang Y., Ma Y.Z., Xu Z.S., Chen X.M., He Z.H., Yu Z., Wilkinson M., Jones H.D., Shewry P.R., Xia L.Q. Isolation and characterization of Viviparous-1 genes in wheat cultivars with distinct ABA sensitivity and pre-harvest sprouting tolerance. J. Exp. Bot., 2007. 58. 11: 2863-2871.
Рецензент — к. б. н. Г.И. Карлов
SUMMARY
Results of Viviparous-1 gene allele condition analysis of two series of spring triticale sister lines, obtained by selecting both stable and unstable plants is F3, are provided in the article. It has been discovered that in lines — progeny of unstable forms — most plants — 83/3% have Vp-1Ba allele. Among lines — progeny of stable plants 35% lines are characterized by Vp-1Bc allele presence, 45% — Vp-1Ba allele presence, 25% are heterozygotes according to this gene, which is probably due to dominant resistance nature and selection in F3 along with homozygotes of heterozygotes in accordance with this gene. The results obtained are evidence of STS-marker Vp-1B likely use in selection of resistance to on root germination in triticale.
Key words: triticale, germination on root, substitutions of chromosomes, STS-marker, selection with molecular markers (MAS) use.
Майер Николай Константинович — асп. кафедры генетики РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. 976-08-94. Эл. почта: n.k.maier@gmail.com
Дивашук Михаил Георгиевич — к. б. н., РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. 977-70-01.
Крупин Павел Юрьевич — асп. центра молекуля рной биотехнологии РГАУ -МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. 977-70-01.
Соловьев Александр Александрович — д. б. н., РГАУ - МСХА имени К.А. Ти-мир зева. Тел. 976-08-94.
