CC BY
30
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 5
Молекулярная генетика, молекулярное маркирование, ДНК-технологии
УДК 633.111.1:581.142:631.52:577.21:57.08
О ВОЗМОЖНОМ ПРИМЕНЕНИИ ГЕНОВ-ГОМОЛОГОВ Vp-1 ( Viviparous-1) ПЫРЕЯ В УЛУЧШЕНИИ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ*
М.Г. ДИВАШУК1, П.Ю. КРУПИН1, И.А. ФЕСЕНКО1, В.И. БЕЛОВ2, О.В. РАЗУМОВА1, А.А. КОРОТАЕВА1, Г.И. КАРЛОВ1
Разработан молекулярный CAPS-маркер, который позволяет идентифицировать ген Vivpa-rous-1 пырея. Выявлен образец пшенично-пырейного гибрида № 209, несущий ген Viviparous-1 от пырея. Показано, что этот образец обладает большей устойчивостью к прорастанию на корню, чем остальные изученные образцы пшенично-пырейных гибридов. Выделенный образец может служить донором гена Viviparous-1 пырея для его интрогрессии в геном мягкой пшеницы с помощью предложенного молекулярного маркера.
Ключевые слова: Viviparous-1, CAPS маркер, устойчивость к прорастанию на корню, Thinopyrum intermedium, ППГ, MAS-селекция.
Keywords: Viviparous-1, CAPS, preharvest sprouting, Thinopyrum intermedium, wheat-wheat-grass hybrids, MAS-breeding.
Во многих странах, в том числе в России, предуборочное прорастание зерна представляет собой серьезную проблему и в настоящее время служит причиной ограничения роста производства пшеницы. В результате прорастания зерна на корню значительно ухудшается качество продукции и, как следствие, экономическая эффективность возделывания (1). Прорастание происходит вследствие нарушения периода покоя у незрелых семян, что приводит к активации физиологических процессов и началу роста зародыша. Период покоя зависит от комплекса факторов: баланса абс-цизовой и гибберелловой кислот, активности а-амилазы, наличия водорастворимых ингибиторов прорастания в колосовых чешуях и семенной оболочке, архитектоники колоса (2-4). Эволюционно период покоя у диких видов возник как механизм избегания неблагоприятных факторов и внутривидовой конкуренции. Отбор культурных растений велся на дружное и быстрое прорастание семян, что привело к повышению их чувствительности к факторам, провоцирующим нарушение периода покоя (5).
Важный этап в исследованиях феномена прорастания семени (и его частного случая — предуборочного прорастания) у злаков связан с клонированием генов Viviparous-1. Было показано, что ген Viviparous-1 (Vp-1) относится к регуляторам позднего эмбриогенеза у злаков (6) и выполняет две функции: первая — обеспечение созревания зародыша, вторая — регуляция перехода семени в состояние покоя и репрессия прорастания. Анализ и клонирование Vp-1 генов показали, что у злаковых культур они кодируют факторы транскрипции, которые характеризуются высоким уровнем экспрессии в развивающихся зародышах семян (6-8). Все клонированные орто-логи Vp-1 содержат функциональные домены B1, B2 и B3, которые связываются с ДНК в области целевых промоторов и активируют экспрессию соответствующих генов (5-11). Анализ структуры и экспрессии трех гомеоло-гичных генов Vp-1 мягкой пшеницы выявил, что каждый из них потенциально может кодировать полноразмерный белок. Однако некорректный
* Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по образованию в рамках ФЦП «Научные и научно педагогические кадры инновационной России», государственный контракт П598 «Конструирование ДНК-библиотеки генов гомологов гена Vp-1 (viviparous) злаковых культур и ее характеристика». Работа была выполнена с использованием оборудования ЦКП «ВНИИСБ»
сплайсинг проматричной РНК приводит к аберрантным продуктам трансляции. При этом у линий мягкой пшеницы с инсерцией размером 193 п.н. и делецией размером 83 п.н. в области указанного гена наблюдается более высокий уровень экспрессии продукта Vp-1, образующегося при корректном сплайсинге, что, вероятно, и обусловливает устойчивость таких форм к прорастанию на корню (12). Неправильный сплайсинг был также обнаружен в большинстве транскриптов Viviparous-1 у диплоидных и тетраплоид-ных предков мягкой пшеницы, и это позволяет предполагать, что современная пшеница унаследовала его структуру от предковых форм (12).
Встраивание генно-инженерной конструкции, содержащей ген Vp-1 из Avena fatua L., в мягкую пшеницу привело к повышению устойчивости к прорастанию на корню (12). Следовательно, одним из способов повышения устойчивости к прорастанию на корню может быть внедрение в геном мягкой пшеницы генов Vp-1 из различных видов злаковых культур при межвидовой и отдаленной гибридизации, и наиболее привлекательны в этой связи различные виды пырея.
Эффективным приемом передачи наследственного материала от пырея к мягкой пшенице служит использование октаплоидных промежуточных пшенично-пырейных гибридов (ППГ) в качестве «селекционного мостика». Хромосомный состав таких межвидовых гибридов представлен 38-42 хромосомами пшеницы и 14-18 хромосомами пырея среднего (13). Разнообразие хозяйственно ценных признаков и цитогенетические исследования октаплоидных гибридов указывают на наличие разных комбинаций хромосом пырея в таких формах и, следовательно, различных генов Vp-1 пырейного происхождения (14).
Целью нашей работы было выявление линий октаплоидных промежуточных пшенично-пырейных гибридов, несущих гены-ортологи Viviparous-1 пырейного происхождения, и оценка таких линий на устойчивость к прорастанию на корню.
Методика. Объектом исследования были пшенично-пырейные гибриды №№ 1779, 1514, 209, 70с, 1744, 80, 186, 5787, 1867, 4044, 1375 и 1754 (2n = 42Пш + 14Пр, где Пш и ПР — хромосомы соответственно пшеницы и пырея), созданные в Отделе отдаленной гибридизации Государственного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН в результате межвидовой ступенчатой гибридизации между пыреем средним и различными сортами пшеницы с последующим отбором. Семена пырея среднего сорта Ростовский 31 (к-33706; 2n = 42, SSJJJsJs) любезно предоставлены Отделом кормовых культур Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова, г. Санкт-Петербург).
ДНК выделяли по методу R. Bernatzky и S.D. Tanksley с некоторыми модификациями (15). В ПЦР использовали праймеры VP-1BB4F и VP-1BB4R (12). Условия амплификации: первоначальная денатурация при 94 °С в течение 5 мин; далее 35 циклов со следующей сменой режимов: 95 °С, 1 мин; 66 °С, 1 мин; 72 °С, 1 мин; затем конечная элонгация при 72 °С в течение 10 мин. Выравнивание сиквенсов проводили с использованием программы GenDoc. Рестрикцию эндонуклеазой Hae III осуществляли в течение 12 ч при 37 °С. Продукты ПЦР разделяли в 2 % агарозном геле с буфером ТВЕ при напряженности поля 6 В/см. В качестве маркера молекулярных масс фрагментов амплификации использовали 100 bp Ladder («Fermentas», Литва).
Показатель покоя семян для каждого образца определяли вычислением взвешенного индекса прорастания вымолоченных зерен в чашках Петри по M. Walker-Simmons (16) с модификацией (испытание в течение 14 сут). Для этого колосья убирали в фазу восковой спелости зерна. Вымолоченные вручную зерна укладывали в чашки Петри (d = 10 см) бо-
роздкой вниз на два слоя фильтровальной бумаги, смоченной 10 мл дистиллированной воды, и проращивали при нерегулируемой температуре (2226 °С). Взвешенный индекс прорастания (ИП) рассчитывали по формуле:
(14 х n, +13 х n2 +... + 1х n14) ИП = --1-2-
D х N
где n\, П2, ... П14 — число вновь проросших зерен за 1-е, 2-е и последующие сутки; N — общее число зерен; D — общее число суток испытания; 14, 13, ..., 1 — поправочный коэффициент.
Результаты. Ранее мы провели прямое секвенирование интрон-экзонного участка генов-ортологов гена Viviparous-1 у дикорастущих сородичей мягкой пшеницы (17). На основе сравнения сиквенсов и с использованием разработанных праймеров Vp1BB4 (17) был создан молекулярный CAPS-маркер (cleaved amplified polymorphic sequences), с помощью которого можно различить гены Viviparous-1 от пырея и от пшеницы. Анализ единичных нук-леотидных различий позволил подобрать рестриктазу Hae III, используя которую удается выявить гены Vp-1 пырейного и пшеничного происхождения. В случае гена Viviparous-1 пырейного происхождения после амплификации и рестрикции Hae III должны образовываться фрагменты длиной 539 и 349 п.н., что подтвердилось для образца ДНК пырея среднего Thinopyrum intermedium. При этом варианты гена Viviparous-1 пшеницы могут давать фрагменты, размер которых зависит от его аллельного состояния, но отличается от размера пырейных. Кроме того, необходимо учитывать возможную амплификацию и рестрикцию фрагментов генов-ортологов с субгенома А и субгенома D мягкой пшеницы. В случае субгенома D предсказать результат рестрикции невозможно ввиду отсутствия нуклеотидных последовательностей указанного гена-ортолога в базах данных NCBI (The National Center for Biotechnology Information, США).
Поэтому созданный маркер в первую очередь был протестирован на разных сортах пшеницы и образцах пырея среднего (Th. intermedium) (рис. 1). Полученные данные совпали с теоретически ожидаемыми результатами рестрикции. Следует также отметить, что в случае пшеницы после гель-электрофореза наблюдались дополнительные фрагменты, что, вероятно, обусловлено амплификацией с гомеологичных генов, находящихся в субгеномах A и D мягкой пшеницы, и последующей рестрикцией. Однако ни один из них не имел длину, характерную для пырейных фрагментов (539 и 349 п.н.). Таким образом, нами разработан эффективный молекулярный CAPS-маркер, который позволяет идентифицировать наличие гена Viviparous-1 пырея среднего, в том числе в геномном окружении мягкой пшеницы.
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов рестрикции Hae III после амплификации с праймерами VP-1BB4: 1, 3 — соответственно сорта мягкой пшеницы Нота и Кума; 2 — пырей средний Thinopyrum intermedium, стрелкой обозначен маркерный бэнд для гена Viviparous-1 (Vp-1) пырейного происхождения; М — маркер молекулярных масс 100 bp Ladder, сверху вниз соответственно 700, 600, 500, 400 п.н.
При использовании разработанного молекулярного CAPS-маркера для идентификации гена Viviparous-1 пырейного происхождения в геномах ППГ оказалось, что из 12 протестированных форм только одна форма (№ 209) содержит ген Viviparous-1 пырея (рис. 2). По аллелям гена Vp-1 пшеницы формы ППГ различались между собой (см. рис. 2).
Пороги устойчивости к прорастанию у пшеницы определяются следующими показателями: ИП < 20 — устойчивые, 20 < ИП < 50 — относи-
тельно устойчивые, ИП > 50 — неустойчивые образцы (18). Результаты оценки возможной связи гена Viviparous-1 пырея с устойчивостью к прора-
Рис. 2. Электрофоре-грамма продуктов рестрикции Hae III после амплификации образцов ДНК 12 линий пшенично-пырей-ных гибридов (№№ 1779, 1514, 209, 70с, 1744, 80, 186, 5787, 1867, 4044, 1375 и 1754) с праймерами VP-1BB4: M — маркер молекулярных масс 100 bp Ladder,
сверху вниз соответственно 700, 600, 500, 400 п.н. Стрелкой отмечен бэнд, специфичный для гена Viviparous-1 (Vp-1) пырейного происхождения.
станию на корню у 12 образцов ППГ показали, что образец ППГ № 209, несущий ген Viviparous-1 пырейного происхождения, устойчивее всех исследованных нами форм пшенично-пырейных гибридов (ИП у образцов №№ 1779, 186, 1514, 5787, 209, 1867, 70с, 4044, 1744, 1375, 80 и 1754 соответственно 76, 68, 84, 75, 40, 73, 57, 85, 65, 63, 59 и 52 %). При этом только он принадлежит к относительно устойчивым, а все остальные формы ППГ — к группе неустойчивых.
Основываясь на полученных данных, можно предположить, что ген Viviparous-1 пырейного происхождения, который находится в геноме образца № 209, способствует повышению устойчивости к прорастанию на корню. Очевидно, что для подтверждения этой гипотезы и особенно для оценки возможности практического применения этого подхода в улучшении сортов пшеницы, необходимо перенести указанный ген непосредственно в геном пшеницы. Мы полагаем, что использование разработанного нами молекулярного CAPS-маркера делает реальной перспективу направленной интрогрессии гена Viviparous-1 пырейного происхождения в геном мягкой пшеницы методами маркер-опосредованной (MAS) селекции.
Итак, нами разработан молекулярный CAPS-маркер, который позволяет идентифицировать ген Viviparous-1 пырейного происхождения в присутствии генов Viviparous-1 пшеницы. Выявлен образец пшенично-пы-рейного гибрида (№ 209), который несет ген Viviparous-1 от пырея. Продемонстрировано, что указанный образец обладает большей устойчивостью к прорастанию на корню, чем остальные изученные пшенично-пырей-ные гибриды. Он может служить донором для интрогрессии гена Viviparous-1 пырея в геном мягкой пшеницы с помощью разработанного нами молекулярного маркера.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. К р у п н о в В.А., С и б и к е е в С.Н., К р у п н о в а О.В. Генетический контроль покоя и устойчивости к предуборочному прорастанию семян у пшеницы. С.-х. биол., 2010, 3: 3-16.
2. D e r e r a N.F., B h a t t G.M. Germination inhibition of the bracts in relation to prehar-vest sprouting tolerance in wheat. Cereal Res. Commun., 1980, 8: 199-201.
3. P a t e r s o n A.H., S o r r e l l s M.E., O b e n d o r f R.L. Methods of evaluation for pre-harvest sprouting resistance in wheat breeding programs. Can. J. Plant Sci., 1989, 69: 681-689.
4. G a t f o r d K.T., E a s t w o o d R.F., H a l l o r a n G.M. Germination inhibitors in bracts surrounding the grain of Triticum tauschii. Fucnt. Plant Biol., 2002, 29: 881-890.
5. F i n k e l s t e i n R.R., G a m p a l a S.S., R o c k C.D. Abscisic acid signaling in seeds and seedlings. Plant Cell, 2002, 14: 15-45.
6. C a o J., D u a n X., M c E l r o y D., W u R. Regeneration of herbicide resistant trans-
genic rice plants following microprojectile- mediated transformation of suspension culture cells. Plant Cell Rep., 1992, 11: 586-591.
7. S h e n Q., G o m e z - C a d e n a s A., Z h a n g P., W a l k e r - S i m m o n s M.K., S h e e n J., H o T.H. Dissection of abscisic acid signal transduction pathways in barley aleu-rone layers. Plant Mol. Biol., 2001, 47: 437-448.
8. U t s u g i S., M a e k a w a M., N o d a K. An efficient transient gene expression system using aleurones of diploid wheat seeds. Plant Biotechnol., 2006, 23: 413-417.
9. J a c o b s e n J.V., C l o s e T.J. Control of transient expression of chimaeric genes by gib-berellic acid and abscisic acid in protoplasts prepared from mature barley aleurone layers. Plant Mol. Biol., 1991, 16: 713-724.
10. K u s h i r o T., O k a m o t o M., N a k a b a y a s h i K., Y a m a g i s h i K., K i t am u r a S., A s a m i T., H i r a i N., K o s h i b a T., K a m i y a Y., N a m b a r a E. The Arabidopsis cytochrome P450 CYP707A encodes ABA 8'-hydroxylases: key enzymes in catabo-lism. EMBO J., 2004, 23: 1647-1656.
11. N a k a m u r a S., T o y a m a T. Isolation of a VP1 homologue from wheat and analysis of its expression in embryos of dormant and non-dormant cultivars. J. Exp. Bot., 2001, 52: 875-876.
12. Y a n g Y., Z h a o X.L., X i a L.Q., C h e n X.M., X i a X.C., Y u Z., H e Z.H., R o d e r M. Development and validation of a Viviparous-1 STS marker for pre-harvest sprouting tolerance in Chinese wheats. Theor. Appl. Genet., 2007, 115: 971-980.
13. F e d a k G., H a n F. Characterization of derivatives from wheat- Thinopyrum wide crosses. Cytogenet. Genome Res., 2005, 109: 360-367.
14. К р у п и н П.Ю., Д и в а ш у к М.Г., Б е л о в В.И., Г л у х о в а Л.И., А л е к с а н-д р о в О.С., К а р л о в Г.И. Сравнительная молекулярно-цитогенетическая характеристика промежуточных пшенично-пырейных гибридов. Генетика, 2011, 47(4): 492-498.
15. B e r n a t z k y R., T a n k s l e y S.D. Toward a saturated linkage map in tomato based on isozyme and random cDNA sequences. Genetics, 1986, 112: 887-898.
16. W a l k e r - S i m m o n s M. Enhancement of ABA responsiveness in wheat embryos by high temperature. Plant Cell Environ., 1988, 11: 769-775.
17. Д и в а ш у к М.Г., К р у п и н П.Ю., Ф е с е н к о И.А., К а р л о в Г.И. Клонирование и анализ интрон-экзонного участка генов-ортологов гена Viviparous некоторых видов диких сородичей пшеницы. Изв. Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2010, 2: 76-81.
18. C h e n g C h a n g, H a i - P i n g Z h a n g, Q i u - X i a Z h a o, J i - M i n g F e n g, H o n g - Q i S i, J i e L u, C h u a n - X i M a. Rich allelic variations of Viviparous-1A and their associations with seed dormancy/pre-harvest sprouting of common wheat. Euphytica, 2011, 179(2): 343-353.
1ФГОУ ВПО Российский государственный Поступила в редакцию
аграрный университет—МСХА им. К.А. Тимирязева, 8 июня 2011 года
127550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, e-mail: divashuk@gmail.com;
2Отдел отдаленной гибридизации Государственного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН,
143591 Московская область, Снегири-1
ABOUT POSSIBLE USE OF Agropyron Vp-1 (Viviparous-1) GENSHOMOLOG FOR IMPROVEMENT OF SOFT WHEAT
M.G. Divashuk1, P.Yu. Krupin1, IA Fesenko1, V.I. Belov2, O.V. Razumova1, AA Korotaeva1, G.I. Karlov1
S u m m a r y
The molecular CAPS-marker was developed which permits to identify the Viviparous-1 gen of Agropyron. The variant of wheat-agropyron hybrid № 209 was revealed, which contain the Viviparous-1 gen from Agropyron. It was shown, that this variant has higher resistance to root sprouting, than other studied variants of wheat-agropyron hybrids. The isolated variant may be used as donor of Viviparous-1 gene of Agropyron for its introgression to soft wheat genome thought suggested molecular marker.
Новые книги
С п и р и н А.С. Молекулярная биология: рибосомы и биосинтез белка. Изд-во «Academia», 2011, 496 с.
Учебник охватывает часть общего курса молекулярной биологии, посвященную структурным и функциональным аспектам биосинтеза белков, которую автор читает на биологическом факультете МГУ им. М.В. Ло-
моносова. Объем включенного в учебник материала соответствует уровню требований кандидатского минимума по специальности «Молекулярная биология». В книге отражены современные тенденции и знания в данной области науки, приведен достаточно полный список литературы по охватываемым проблемам. Книга не имеет аналогов в современной мировой литературе.
