CC BY
66
УДК 541.69
Ю. В. Вахитова (д.биол.н., зав. лаб.)1, В. В. Плечев (д.м.н., проф., зав. каф.)2, В. М. Юнусов (к.мед.н., хирург) 3, Е. И. Фарафонтова (асп.)1
Влияние аллапинина на экспрессию генов ионных каналов кардиомиоцитов
1 Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, лаборатория молекулярной фармакологии и иммунологии 450054, Уфа, пр. Октября, 71; тел. (347) 235 60 88, e-mail: miph@anrb.ru 2Башкирский государственный медицинский университет, кафедра госпитальной хирургии, 450000, г. Уфа, ул. Ленина ,3; тел. (347) 2553966 3Республиканский кардиологический диспансер 450106, г.Уфа. ул. Ст. Кувыкина, 96 ; тел. 8(347)2553957, факс 8(347)2556471
Allapinine impact on gene expression of ion channels of cardiomyocytes
1 Institute of Biochemistry and Genetics of the USC of the RAS 71, Oktyabrya pr, 450054, Ufa, Russia; ph. (347) 235 60 88, e-mail: miph@anrb.ru
2 Bashkir State Medical University
3, Lenina st, Ufa, Russia; ph. (347) 2553966
3 Republican Cardiological Clinic
96, St. Kuvykina st., 450106, Ufa, Russia; ph. 8(347)2553957, fax 8(347)2556471, e-mail: rkd@ufacom.ru
Аллапинин (лаппаконитина гидробромид) — препарат для лечения нарушений ритма сердца. Аллапинин, так же , как и другие антиаритмики 1С класса, длительно блокирует «быстрые» Ыа+-каналы, находящиеся в открытом состоянии. Но некоторые особенности электрофизиологических эффектов аллапинина отличают его от применяемых в настоящее время антиаритми-ков 1С класса и определяют качественно иной, чем у этих препаратов, механизм реализации противоаритмического действия. Гены-мишени препарата идентифицировали в условиях моделирования аконитиновой аритмии у крыс. Установлено, что аллапинин вызывает изменения уровня мРНК генов, кодирующих различные типы К+-каналов (Кспаб, Ксщ1, Ксщ4, Ксщ2, Кспц4), Са2+-канала (Саспа1д), везикулярного переносчика ацетилхолина (Б1с18а3), генов, кодирующих Ыа+-канал (Бсп8а), К+-каналы (Кспе1, Ксш1), мембранных транспортеров (ЛЬр4а, Б1с6а9). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что по влиянию на экспрессию генов-мишеней ионных каналов кардиомио-цитов крыс аллапинин имеет как схожие, так и отличные свойства от основных представителей антиаритмических препаратов 1С класса.
Ключевые слова: аллапинин; антиаритмики 1С класса; гены-мишени; дитерпеновые алкалоиды; лаппаконитин; потенциал-управляемые К+, Ыа+, Са2+-ионные каналы.
Дата поступления 29.10.12
Allapinine (lappaconitine hydrobromide) — for the treatment of cardiac arrhythmias. Allapinine, like other antiarrhythmics class 1C, long blocks «fast» Na+-channels in the open state. However, some features of the electrophysiological effects of allapinine distinguish it from the currently used antiarrhythmics class 1C and determine qualitatively different from that of these drugs, the mechanisms of antiarrhythmic action. Drug target genes identified in modeling akonitine arrhythmias in rats. Found that allapinine causes changes mRNA levels of genes coding for different types of K+-channels (Kcna6, Kcnjl, Kcnj4, Kcnq2, Kcnq4), Ca2+-channel (Cacna1g), vesicular transporter of acetylcholine (Slc18a3), genes encoding the Na+-channel (Scn8a), K+-channels (Kcne1, Kcns1), membrane transporters (Atp4a, Slc6a9). Our data suggest that the effect on the expression of target genes of ion channels rat cardiomyocytes allapinine has both similar and different properties of the principal representatives of class 1C antiarrhythmic drugs.
Key words: 1C antiarrhythmics class; diterpene alkaloids; allapinine; lappaconitine; voltage-controlled K+, Na+, Ca2+ ion channels; target genes.
Растения родов Aconitum и Delphinium
(семейство Ranunculaceae) являются основны-
2
ми источниками дитерпеновых алкалоидов . К настоящему времени в мире выделено около 700 дитерпеновых алкалоидов и лишь небольшая часть из них оценена на биологическую активность. Наиболее известным представителем дитерпеновых алкалоидов является аконитин (рис. 1).
приводит к изменению интенсивности протекания ионных токов. С этой точки зрения оценка влияния исследуемого антиаритмического средства на уровень экспрессии генов ионных каналов является весьма информативной для анализа механизмов действия препарата.
Рис. 1. Структурная формула дитерпенового алкалоида аконитина
Аконитин замедляет инактивацию потенциал-зависимых Ка+-каналов мембран электровозбудимых клеток 3. Интересно, что лаппа-конитин, являясь структурным аналогом аконитина, обладает противоположным эффектом на Ка+-каналы кардиомиоцитов 4. Лекарственное средство «Аллапинин» (лаппаконитина гидробромид), (рис. 2) успешно применяется в медицине в качестве антиаритмического средства. Препарат эффективен при тахиарит-миях 1. По электрофизиологическим свойствам препарат наиболее близок к антиаритми-кам 1С подкласса по классификации Vaughan Williams 6. Им присущи блокада быстрых Na+-каналов, антагонистическое влияние на Са2+-каналы, и в последнее время, в литературе появились данные об их антагонистическом влиянии на потенциал-зависимые К+-каналы, в частности, Kv11.1 (hERG, human Ether^-go-go-Related Gene) 6. Аллапинин, как и другие антиаритмики 1С класса, длительно блокирует «быстрые» №+-каналы, находящиеся в открытом состоянии, но в то же время взаимодействие аллапинина с другими типами ионных каналов изучено недостаточно, как и не известны молекулярные мишени препарата. Это диктует необходимость углубленного изучения механизмов действия этого лекарственного средства. Уровень мРНК генов-мишеней может предопределять изменения в числе работающих ионных каналов, что, в свою очередь,
Рис. 2. Структурная формула дитерпенового алкалоида лаппаконитина
Экспериментальная часть
Эксперименты проводились в лабораторных условиях на беспородных крысах-самцах массой 200—250 г. Каждая экспериментальная группа состояла из 3 крыс. Аритмию у животных вызывали введением аконитина в дозе 50 мкг/кг в хвостовую вену (контрольная и опытная группы). Регистрировали нарушения ритма смешанного предсердно-желудочкового типа в течение 2 ч. Аллапинин вводили внутривенно профилактически за 2 мин до введения аконитина в дозе 0.3 мг/кг (ED50) (опытная группа). За критерий антиаритмического эффекта принимали отсутствие возникновения аритмии, регистрируемой на ЭКГ. Животных забивали декапитацией через 1 ч после введения аллапинина при условии сохранения синусового ритма. Для идентификации генов-мишеней использовали коммерческий набор Rat Neuroscience Ion Channels & Transporters RT2 Profiler™ PCR Array (PARN-036A2, SABioscienses, США). Для проведения реакции ОТ-ПЦР использовались набор RT2-Real Time SYBR Green / ROX PCR master mix (SABioscienses, США) в соответствии с протоколом производителя. ПЦР с детекцией продуктов реакции в режиме реального времени проводили на приборе «iCycler iQTM RealTime PCR Detection System» (BioRad, США). Нормализация результатов проводилась по 5 генам «домашнего хозяйства»: Ldha, Hprtl, Rplpl, Rpl13a, Actb. Результаты ОТ-ПЦР ана-
лизировали с помощью программного обеспечения RT2 Profiler PCR Array Data Analysis version 3.4. Для тех генов, уровень мРНК которых в опытном и контрольном варианте отличался более, чем в 2 раза, проводились реп-ликативные исследования с целью подтверждения данных, полученных с использованием набора Neuroscience Ion Channels & Transporters RT2 Profiler™ PCR Array. Количественную ОТ-ПЦР в реальном времени проводили, используя набор iQTM SYBR® Green Supermix (BioRad, США). Определение относительного уровня мРНК исследуемых генов проводили с помощью модификации С(0-ме-тода в программе REST Tool V1.9.9 (Corbertt Research, CfflA).
Обсуждение результатов
В результате сравнительной оценки экспрессии 84 генов у опытных (аконитиновая аритмия/аллапинин) и контрольных (аконитиновая аритмия/физиологический раствор) животных были установлены изменения уровня мРНК 18 генов, уровень которых отличался более чем в 2 раза. В репликативных исследованиях методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени эти изменения экспрессии генов удалось подтвердить лишь для двенадцати из них (рис. 3).
Рис. 3. Относительная экспрессия генов-мишеней аллапинина. Данные получены методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Боксы представляют межквартильный размах статистической выборки, пунктирами обозначен средний уровень мРНК соответствующих генов, границами показаны минимумы и максимумы значений.
Как следует из рисунка, на фоне акони-тиновой аритмии аллапинин вызывает увеличение уровня мРНК генов, кодирующих раз-
личные типы К+-каналов (Kcna6, Kcnjl, Kcnj4, Kcnq2, Kcnq4), Са2+ -канала (Cacnalg), везикулярного переносчика аце-тилхолина (Slc18a3). Снижение уровня мРНК отмечено для генов, кодирующих Ка+-канал (Scn8a), К+-каналы (Kcnel, Kcnsl), мембранных транспортеров (Atp4a, Slc6a9).
Действие аллапинина на фоне аконитино-вой аритмии in vivo сопровождается снижением уровня мРНК гена, кодирующего альфа субъединицу потенциал-управляемого натриевого канала 8 типа (Nav1.6, Sodium channel protein type 8 subunit alpha, ген Scn8a). Снижение уровня мРНК гена Scn8a при введении аллапинина на фоне аконитиновой аритмии, вероятно, свидетельствует о том, что антиаритмические свойства аллапинина (в частности увеличение продолжительности фазы деполяризации) реализуются посредством регуляции INa, проходящих, в том числе, и через натриевый канал Nav1.6.
Следующая группа мишеней, уровень мРНК которых регулируется аллапинином, представлена генами, кодирующими потенци-ал-управляемые калиевые каналы Kv1.6, KCNE1, Kv7.2, Kv7.4, Kv9.1. Показано, что аконитин посредством блокады выходящих калиевых токов замедляет реполяризацию, способствуя аритмогенезу. Вызванное аллапи-нином увеличение уровня мРНК генов Kcna6, Kcnq2 и Kcnq4, вероятно, свидетельствует в пользу предположения о нормализующем эффекте препарата на протекание реполяризую-щих выходящих калиевых токов IK, активированных аконитином. Ингибирование тока IK1 вызывает удлинение финальной фазы реполя-ризации, что, особенно в условиях сниженного внеклеточного уровня К+, может приводить к развитию спонтанных аритмий. Выявленное нами увеличение уровня мРНК гена Kcnj4 на фоне аконитиновой аритмии при действии ал-лапинина может свидетельствовать о влиянии препарата на ионные токи, формирующие конечную фазу потенциала действия. Можно предположить, что эффект препарата подавлять эктопическую активность миокарда может быть связан с его модифицирующим действием на ионные токи IK1, протекающие через калиевый канал Kir2.3.
Ген Cacnalg кодирует а-субъединицу потенциал-управляемого кальциевого канала Т-типа Cav3.1. Инактивация Cacnalg в модельных условиях существенно замедляет сердечный ритм, удлиняет время восстановления в синусно-предсердном узле и угнетает пейсме-керную активность клеток синусно-предсерд-
ного узла. Не исключено, что формирование положительного хронотропного эффекта алла-пинина может быть обусловлено его влиянием на Са2+-каналы Т-типа. Обнаруженное нами увеличение уровня мРНК гена Cacnalg свидетельствует в пользу этого предположения.
Аллапинин также оказывает влияние на экспрессию генов, кодирующих переносчики нейромедиаторов — ацетилхолина (VAChT, Vesicular acetylcholine transporter, ген Slc18a3) и глицина (GlyT-1, Sodium- and chloride-dependent glycine transporter 1, ген Slc6a9). Значительное увеличение уровня мРНК гена, кодирующего везикулярный переносчик ацетилхолина, при действии аллапини-на может отражать усиление накопления медиатора как за счет активации его синтеза, так и за счет ингибирования обратного захвата. Не исключено, что в антиаритмический эффект аллапинина при наджелудочковых формах нарушения ритма сердца вносит вклад и ацетил-холинергический компонент.
Таким образом, в ходе экспериментального исследования удалось выявить, что аллапи-нин по характеру влияния на быстрые Na+-ra-налы (возможно посредством влияния на экспрессию их генов) схож с антиаритмическими препаратами 1С класса, но в отношении воз-
действия на другие ионные каналы он несколько отличается от них. В соответствии с полученными результатами, можно предположить способность аллапинина оказывать активирующее влияние на ионные К+-, Са2+-каналы и процессы продукции ацетилхолина. По-видимому, выявленные эффекты могут являться факторами, обуславливающим безопасность применения этого препарата у больных с органическим поражением миокарда, что требует дополнительных электрофизиологических исследований.
Литература
1. Соколов С. Ф. // Вестник аритмологии.-2011.- №64.- С.60.
2. Benn M. N., Jacyno J. M. // Alkaloids: Chemical and Biological Perspectives / Ed. Pelletier S. W.; New York: Wiley, 1983.- V.1.-P.153.
3. Catterall W. A. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.1980.- V.20.- P.15.
4. Heubach J. F., Schde A. // Planta Med.-1998.- V.64(1).- P.22.
5. Paul A. A., Witchel H. J., Hancox J. C. // Br. J. Pharmacol.- 2002.- V.136(5).- P.717.
6. Vaughan Williams E. M. // J. Clin. Pharmacol.- 1984.- V.24(4).- P.129.
