CC BY
143
УДК 616.94-022.7
ВЛИЯНИЕ АДРЕНАЛИНА IN VITRO НА ПАТОГЕННОСТЬ ГОСПИТАЛЬНЫХ СТАФИЛОКОККОВ
В. В. Леонов*, кандидат технических наук, Л. В. Леонова,
Т. Н. Соколова, кандидат биологических наук, Л. Н. Деревянко, кандидат медицинских наук
БУ ВО ХМАО-Югры «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия», 628011, Россия, ХМАО-Югра, г. Ханты-Мансийск, ул. Мира, д. 40
РЕЗЮМЕ Изучено влияние адреналина in vitro на патогенность госпитальных и негоспитальных вариантов стафилококков. Выявлено, что добавление адреналина к культуре S. aureus вызывает увеличение плотности популяции и способствует увеличению адгезивной активности и экспрессии гемолизинов. Эффекты адреналина на госпитальные изоляты S. aureus выражены сильнее, чем на негоспитальные варианты.
Ключевые слова: S. aureus, эпинефрин, адреналин, адгезия, удельная скорость роста, гемолитическая активность.
* Ответственный за переписку (corresponding author): leonovvadim@yandex.ru.
Несмотря на активное изучение свойств госпитальных штаммов микроорганизмов, проблема их формирования и персистирования остается актуальной. Основной средой обитания и эволюции госпитальных штаммов является организм больного человека, и, по данным современных исследований [11], микроорганизмы приспособились использовать вещества, обусловливающие и/или опосредующие защиту организма от патогена, как ростовые факторы. Особый интерес в этом отношении представляют биогенные амины. Они могут влиять на взаимодействие макро- и микроорганизма в ходе развития инфекционного стресса.
Действительно, А. В. Олескин и соавт. показали, что добавление серотонина и дофамина к куль-туральной среде Escherichia coli и Rhodospirillum rubrum стимулирует их пролиферативную активность [1]. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии эти же авторы обнаружили серотонин в биомассе бактерий Bacillus subtilis и Staphylococcus aureus, норадреналин у B. subtilis, B. cereus, Proteus vulgaris и Serratia marcescens, грибка Penicillum chrysogenum [2]. М. Lyte et al.
впервые показали, что нейроэндокринные гормоны стресса (катехоламины) играют важную роль в регуляции бактериальной вирулентности грамо-трицательных патогенов [9, 11].
В связи с изложенным выше можно предполагать возможность участия катехоламинов в регуляции патогенности грамположительных бактерий, поэтому целью настоящего исследования явилось выяснение in vitro влияния эпинефрина (адреналина) на факторы патогенности госпитальных и негоспитальных штаммов Staphylococcus aureus.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использованы два эталонных штамма АТСС 25923 и 209Р, три негоспитальных (4844, 352, 372) и пять госпитальных (2888, 2891, 4954, 391, 334) изолятов S. aureus, выделенные из разных биотопов больных ожогового центра ОКБ № 1 г. Тюмень и инфекционного отделения ОКБ г. Ханты-Мансийска. Все изоляты предварительно были идентифицированы общепринятыми методиками по совокупности морфологических,
V. V. Leonov, L. V. Leonova, T. N. Sokolova, L. N. Derevynko
THE PATHOGENICITY OF HOSPITAL STAPHYLOCOCCI: THE IMPACT OF ADRENALINE IN VITRO
ABSTRACT The impact of adrenaline in vitro on the pathogenicity of hospital and extra-hospital staphylococci was studied. It was revealed that the addition of adrenaline into S. aureus culture resulted in the population density increase and was conducive to the increase of adhesive activity and hemolysine expression. The effects of adrenaline on the hospital isolates of S. aureus were more pronounced in comparison with extra-hospital variants.
Key words: S. aureus, epinephrine, adrenaline, adhesion, specific growth rate, hemolytic activity.
тинкториальных и биохимических признаков. Вид микроорганизма был определен с помощью коммерческой тест-системы «Staphytest» (Lachema, Чехия). Штамм считали госпитальным на основании резистентности к пяти и более антибиотикам [5].
Бактерии выращивали в LB-среде (триптон -10,0 г/л, дрожжевой экстракт - 5,0 г/л, NaCl -5,0 г/л, pH 7,0). Адреналин солянокислый («Sigma», Германия) добавляли в питательную среду из более концентрированного стерильного раствора до конечной концентрации 6,8 нмоль, что соответствует его нормальной физиологической концентрации в организме человека.
В контроль вносили солянокислый раствор, не содержащий адреналин. Рост микроорганизмов оценивали турбидиметрически (X = 540 нм). Для количественной оценки стимулирующего эффекта адреналина рассчитывали удельные скорости роста (|j, ч-1) микроорганизмов как тангенс угла наклона касательной к начальному участку кривой роста в координатах (А, t).
Количественную оценку адгезивной активности проводили по В. И. Брилису с соавт. [6] с отмытыми формалинизированными эритроцитами человека I (0) группы крови через 12 ч культивирования с добавлением и без добавления адреналина, рассчитывали средний показатель адгезии (СПА).
Гемолитическую активность определяли фотометрическим методом по лизису эритроцитов человека 0 (I) группы Rh (+) [3].
Все результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента [4].
25923 АТСС
Рис. 1. Кривые роста S. aureus ATCC 25923 (а) и 352 (б) троль)адреналина
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для проведения эксперимента in vitro мы выбрали следующие параметры, характеризующие патогенность стафилококков: адгезия к поверхности эритроцитов (фактор адгезии), гемолитическая активность (фактор агрессии) и рост/размножение (универсальное свойство всего живого).
Начальным и необходимым этапом развития инфекционного процесса является адгезия микроорганизмов - способность прикрепляться к слизистой эпителия с помощью специальных адгезинов, входящих в состав клеточной стенки грамположительных бактерий.
Изучение адгезивной активности стафилококков показало, что все исследованные штаммы имеют средние адгезивные способности (СПА 1,9-2,4). При добавлении в питательную среду адреналина у одного эталонного АТСС 25923 и пяти госпитальных штаммов S. aureus (2888, 2891, 4954, 391, 334) наблюдается сдвиг в сторону усиления адгезивных свойств (р < 0,05), а у двух штаммов (209 и 352) - снижение СПА с 2,2 до 1,9 (р < 0,05). У штаммов 372 и 4844 S. aureus добавление адреналина в питательную среду не вызывало изменений адгезивных характеристик по сравнению с контролем.
На рис. 1 приведены кривые роста эталонного АТСС 25923 и госпитального 352 штаммов S. aureus с добавлением и без добавления в питательную среду адреналина. Добавление адреналина вызывает сокращение лаг-фазы роста S. aureus. Наибольший стимулирующий эффект в отношении накопления биомассы наблюдается в первые 3 часа культивирования, а на последующих стадиях он сглаживался.
на LB-среде с добавлением (опыт) и без добавления (кон-
В целом значения | для всех исследованных штаммов изменялись от 0,27 до 1,07 ч-1 (рис. 2). Адреналин увеличивал удельную скорость роста госпитальных стафилококков в среднем в 1,5 раза. Наибольшее увеличение скорости роста (в 2,5 раза) происходило при добавлении адреналина к культуре госпитального штамма 2891. В отношении исследованных нами негоспитальных штаммов стимулирующий эффект адреналина был выражен слабее: удельная скорость роста увеличилась в среднем лишь в 1,2 раза, а изолят 372 оказался индифферентным к влиянию адреналина.
Многие исследователи считают гемолизины фактором агрессии и инвазии, имеющим важное патогенетическое значение при стафилококковых инфекциях. В связи с этим мы изучили влияние адреналина на гемолитическую активность госпитальных и негоспитальных стафилококков. Результаты показали (табл.), что все исследованные штаммы S. aureus обладают низкой гемолитической активностью (<20%).
Гемолитическая активность негоспитальных изо-лятов составляла 2,0% и заметно не изменялась при добавлении адреналина - 3,3 и 3,8% для штаммов АТСС 25923 и 4844 соответственно. Добавление адреналина к госпитальным изолятам приводило к более существенному увеличению показателя - в 1,7-2,5 раза. Наибольшее увели-
чение гемолитической активности наблюдалось у госпитального изолята 2888 - с 6,2 до 14,7%.
В результате исследования установлено, что адреналин меняет патогенность стафилококков, причем его влияние на госпитальные изоляты S. aureus выражено сильнее, чем на негоспитальные варианты.
Полученные результаты могут быть частично объяснены с помощью явления quorum sensing -«чувства кворума». Это механизм, с помощью которого патогены «определяют» плотность своей популяции. Соответственно, патогенные бактерии могут «чувствовать» необходимость экспрессии факторов патогенности при достижении определенной плотности популяции [10]. Ростостиму-лирующий эффект адреналина как в отношении госпитальных, так и негоспитальных штаммов S. aureus позволяет предполагать существование рецепторов к адреналину на поверхности бактериальной клетки. Действительно, есть доказательства существования прокариотических рецепторов для гормонов организма хозяина, например инсулина [7]. Очевидно, что госпитальные штаммы лучше приспособлены к условиям организма хозяина и поэтому сильнее стимулируются адреналином, чем негоспитальные изоляты.
Таким образом, добавление адреналина к культуре S. aureus вызывает максимальное увеличение
1,2
1,0 -
0,8 -
0,6
0,4
0,2 -
0,0 J
II
I
I
I
I
25923 209-P 4844 352 372 2888 2891 4954 334 391 ATCC
Рис. 2. Удельные скорости роста (j, ч-1) S. aureus на LB-среде с добавлением (И) и без добавления ( ) адреналина
Таблица. Гемолитическая активность Б. аureus с добавлением (опыт) и без добавления (контроль) адреналина, %
Культура Штамм
АТСС 25923 4844 2888 2891 4954
Опыт 3,3 ± 0,3 3,8 ± 0,2 14,7 ± 0,6 4,8 ± 0,2 11,5 ± 0,3
Контроль 2,0 ± 0,2 2,0 ± 0,1 6,2 ± 0,3 2,8 ± 0,2 4,6 ± 0,2
плотности популяции уже в первые 3 часа роста и может способствовать увеличению СПА и экспрессии гемолитической активности.
Следует отметить, что представленные результаты экспериментов по влиянию адреналина на патогенность стафилококков были получены в осенне-зимний период. Проведение эксперимента в день весеннего равноденствия нивелировало все эффекты адреналина, последующие попытки в весенне-летний период также были безуспешными. Аналогичный эффект сезонного влияния был выявлен при изучении влияния серотонина
на рост дрожжей Candida guilliermondii и бактерий Streptococcus faecalis [8]. Авторы объяснили этот феномен увеличением скорости роста микроорганизмов в весенне-летний период.
ВЫВОДЫ
1. Добавление адреналина к культуре S. aureus стимулирует ее пролиферативную активность и усиливает патогенность.
2. Стимулирующее влияние адреналина выражено сильнее на госпитальные штаммы S. aureus, чем на негоспитальные.
ЛИТЕРАТУРА
1. Действие серотонина (5-окситриптамина) на рост и дифференциацию микроорганизмов / А. В. Оле-скин [и др.] // Микробиология. - 1998. - Т. 67, № 3. -С. 306-311.
2. Детекция нейромедиаторных аминов у микроорганизмов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Е. А. Цавкелова [и др.] // Доклады Российской академии наук. - 2000. - Т. 372. -С. 840-842.
3. Железозависимый синтез гемолизинов Staphylococcus aureus / В. В. Леонов [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. -Т. 153, № 1. - С. 49-51.
4. Лурье, Ю. Ю. Справочник по аналитической химии / Ю. Ю. Лурье. - 4-е изд., перераб. и доп. - М. : Химия, 1971. - 456 с.
5. Меньшиков, Д. Д. Тест-методы как одно из направлений в диагностике антибиотикорезистентности микроорганизмов / Д. Д. Меньшиков, Е. Д. Меньшикова // Клиническая лабораторная диагностика. -2002. - № 6. - С. 35-37.
6. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В. И. Брилис [ и др.] // Лабораторное дело. -1986. - № 4. - С. 210-212.
7. Механизмы выживания бактерий / О. В. Бухарин [и др.]. - М. : Медицина, 2005. - 367 с.
8. Страховская, М. Г. Стимулирующее влияние серотонина на рост дрожжей Candida guilliermondii и бактерий Streptococcus faecalis / М. Г. Страховская, Э. В. Иванова, Г. Я. Фрайкин // Микробиология. -1993. - Т. 62, № 1. - С. 46-49.
9. Freestone, P. P. E. Microbial endocrinology: experimental design issues in the study of interkingdom signalling in infectious disease. Advances in Applied Microbiology / P. P. E. Freestone, M. Lyte. - 2008. -Vol. 64. - Р. 75-105.
10. Kievit, T. R. de. Bacterial quorum sensing in pathogenic relationships / T. R. de Kievit, B. H. Iglewski // Infection and Immunity. - 2000. - Vol. 68. - P. 4839-4849.
11. Lyte, M. Production of an autouinducer of growth by norepinephrine cultured Escherichia coli О157:Н7 / M. Lyte, C. D. Frank, B. T. Green // FEMS Microbiology Letters. - 1996. - Vol. 139. - P. 155-164.
