CC BY
43
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК: 617-089.843:615.32
Код специальности ВАК: 14.02.02
Дата поступления 22.03.2018
ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM В ТРАВМАТОЛОГИИ И ОРТОПЕДИИ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ КОНТАМИНАЦИИ И БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЯ НА ПОВЕРХНОСТИ ИМПЛАНТАТОВ С СИНТЕТИЧЕСКИМ БИОАКТИВНЫМ КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНЫМ МИНЕРАЛЬНЫМ ПОКРЫТИЕМ
А.А. Марков1, Т.Х. Тимохина1, Н.Б. Перунова2, Я.И. Паромова1,
1ФГБОУ ВО «Тюменский государственный медицинский университет», 2Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, г. Оренбург
Марков Александр Анатольевич - e-mail: alexdoktor@inbox.ru
Введение. В настоящее время, с учетом всех достижений асептики и антисептики, развитие гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде остается достаточно значимым и по данным отечественных и зарубежных литературных источников достигает 37,8% от всех оперативных вмешательств. Целью исследования было изучение возможности применения экзометаболитов Bifidobacterium bifidum для предотвращения первичной контаминации и биопленкообразования на поверхности имплантатов с синтетическим биоактивным кальций-фосфатным минеральным покрытием при травматолого-ортопедической патологии. Материал и методы. В качестве продуцентов экзометаболитов пробиотиков был использован сертифицированный препарат «Бифидобактерин». Для получения супернатанта с высокой антимикробной активностью, в состав которого входят эк-зометаболиты B. bifidum, применяли хронобиологический подход. Результаты и их обсуждение. Исследование показало, что при определении антибактериальной активности экзометаболитов B. bifidum в отношении антибиотикорезистентных госпитальных изолятов S. aureus 889 (MRSA) и P. aeruginosa 9672 отмечено отсутствие роста бактерий. Выводы. Доказана высокая антибактериальная активность экзометаболитов B. bifidum в отношении антибиотикорезистентных музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus, P. aeruginosa в экспериментах in vitro.
Ключевые слова: экзометаболиты, травматология и ортопедия, имплантаты, синтетическое биоактивное кальций-фосфатное минеральное покрытие, биопленкообразование.
Introduction. At present, taking into account all the achievements of aseptic and antiseptic, the development of purulent-septic complications in the postoperative volume up to 37,8% of all surgical interventions. The aim of the study was to study the possibilities of using Bifidobacterium bifidum exometabolites to prevent primary contamination and biofilm formation on the surface of implants with a synthetic bioactive calcium-phosphate mineral coating in traumatologic-orthopedic pathology. Material and methods. As a producer of exometabolites of probiotics, a certified Bifidobacterin drug was used. To obtain a supernatant with high antimicrobial activity, which includes B. bifidum exometabolites, a chronobiological approach was used. Results and discussion. The study showed that in determining the antibacterial activity of B. bifidum exometabolites against antibiotic-resistant hospital isolates of S. aureus 889 (MRSA) and P. aeruginosa 9672 copper, the absence of bacterial growth. Conclusions. The demonstrated high antibacterial activity of B. bifidum exometabolites against antibiotic-resistant museum strains and hospital isolates of S. aureus, P. aeruginosa in vitro experiments.
Key words: ekzometabolita, traumatology and orthopedics, implants, synthetic bioactive calcium -
a phosphatic mineral covering, biofilm formation.
Введение
В настоящее время, с учетом всех достижений асептики и антисептики, развитие гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде остается достаточно значимым и по данным отечественных и зарубежных литературных источников достигает 37,8% от всех оперативных вмешательств [1, 2].
Сложность проведения антибактериальной терапии усугубляется формированием биопленок на поверхности установленных эндопротезов и имплантатов, что в свою очередь приводит к хронизации инфекционного процесса в травматолого-ортопедической, хирургической и стоматологической практике. Доказано, что в составе биопленок бактерии усиливают свою патогенность, приобретая способность защищаться от стрессовых воздействий, проявляют значительно более высокую устойчивость к антибиотикам и другим лекарственным препаратам [3-5].
Учитывая стадийность развития биопленки, важно предотвратить первичную контаминацию имплантируемых материалов микроорганизмами.
В условиях современного мира, в котором все чаще встречается резистентность бактерий ко многим антибиотикам, а в определенных случаях и полиантибиотикорези-стентность, изучение антимикробных свойств метаболитов и бактериальных клеток пробиотиков (в частности бифи-до- и лактобактерий) приобретает все более важное значение [6].
Поиск новых препаратов, биологически безопасных для организма человека, обладающих по возможности высокими антимикробными свойствами, перспективно рассматривать с позиции ассоциативного симбиоза - многокомпонентной интегративной системы: макропартнер, нормо-биота, транзиторные микроорганизмы. Научные исследования показали, что экзометаболиты пробиотических
бактерий человека оказывают широкое влияние на физиологические процессы: нормализуют электролитный обмен и окислительное фосфорилирование, обладают высокой противовоспалительной активностью (препятствуют образованию медиаторов воспаления), антимикробным действием, предупреждают гипоксию тканей, микроциркуля-торные нарушения за счет содержания в них органических жирных кислот, молочной кислоты, микробного лизоцима, перекиси водорода, бактериоцинов, различных ферментов и витаминов, способствуют восстановлению нарушенных иммунологических реакций [7-10].
Е.И. Молоховой и Ю.В. Сорокиной в 2011 году установлено, что ультрафильтрат культуральной жидкости Lactobacillus plantarum 8P-A3 форте обладал активным противовоспалительным свойством за счет входящих в его состав протеолитических ферментов: химотрипсиногена и рибонуклеазы, являющихся также биологическими антисептиками. Культуральная жидкость исследованного штамма также отличалась высокой иммунологической активностью и повышала чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к гентамицину и ампициллину [11].
Антимикробная активность экзометаболитов (надосадоч-ной жидкости) бифидо- и лактобактерий была доказана в работах И.Ю. Чичерина с соавт. (2013) и Т.Х. Тимохиной с соавт. (2016) [12, 13].
Таким образом, анализ результатов научных исследований по этой теме является основанием для дальнейшего изучения экзометаболитов пробиотических микроорганизмов, а с учетом доказанной высокой антимикробной активности дает возможность их использования для предотвращения первичной контаминации титановых имплантатов с пористым покрытием микроорганизмами в периопераци-онном периоде.
Цель исследования: изучить возможность применения экзометаболитов Bifidobacterium bifidum для предотвращения первичной контаминации и биопленкообразования на поверхности имплантатов с синтетическим биоактивным кальций-фосфатным минеральным покрытием при травматолого-ортопедической патологии.
Задачи:
1. Определить антибактериальную активность экзометаболитов B. Bifidum в отношении антибиотикорезистентных госпитальных изолятов, выделенных у пациентов с пери-протезной инфекцией, остеомиелитом трубчатых костей и позвоночника в эксперименте in vitro.
2. Исследовать формирование биопленки на синтетическом биоактивном кальций-фосфатном минеральном покрытии (СБКФМП) титановых имплантатов под влиянием экзометаболитов Bifidobacterium bifidum.
Материал и методы
В качестве продуцентов экзометаболитов пробиотиков был использован сертифицированный препарат «Бифидо-бактерин». Для получения супернатанта с высокой антимикробной активностью, в состав которого входят экзометабо-литы B. bifidum, применяли хронобиологический подход.
При исследовании пролиферативной и антимикробной активности в эксперименте in vitro использовали двухсуточные экзометаболиты B. bifidum, музейные тест-штаммы: Staphylococcus aureus 25923 АТСС, Pseudomonas aeruginosa 27853 АТСС, и антибиотикорезистентные госпитальные изо-
ляты: S. aureus 889 (MRSA), P. aeruginosa 9672, выделенные у пациентов с перипротезной инфекцией, остеомиелитом трубчатых костей и позвоночника. Выделение и идентификацию возбудителей проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культураль-ных, биохимических свойств в соответствии с приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». Определение чувствительности госпитальных изолятов к антибиотикам после забора от пациентов проводили сотрудники бактериологической лаборатории ГБУЗ ТО ОКБ № 2 г. Тюмени.
Эксперимент in vitro по изучению бактерицидного влияния полученных экзометаболитов B. Bifidum проводили методом десятикратных разведений тест-штаммов (с 1,5х107 до 1,5х102 КОЕ/мл), через 24 часа экспозиции из каждого разведения делали высев по 0,1 мл на чашку Петри с желточно-солевым агаром (ЖСА), через сутки подсчитывали количество выросших колоний. Пролиферативную активность различных разведений тест-штаммов бактерий определяли при посеве на желточно-солевом агаре, результаты оценивали через 24 часа. Сплошной рост посевов из всех разведений (с 1,5х107 до 1,5х102 КОЕ/мл) является подтверждением высокой пролиферативной активности.
Изготовление титановых имплантатов осуществлялось на ФГУП «Опытный завод РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова».
Подготовка имплантатов для экспериментов проведена путем нанесения СБКФМК (патент РФ на изобретение «Синтетический биоактивный кальций-фосфатный минеральный комплекс» № 2593346 от 24.07.2015, авторы: Марков А.А., Соколюк А.А.) на титановые имплантаты в виде пористого покрытия электрохимическим методом по авторской методике (патент РФ на изобретение «Способ нанесения синтетического биоактивного кальций-фосфатного минерального комплекса на имплантаты медицинского назначения» № 2606366 от 10.01.2017, авторы: Марков А.А., Соколюк А.А.) в лаборатории ЗАО «СПИНОКС», г. Тюмень [14, 15].
Титановые имплантаты с СБКФМП, изготовленные для эксперимента in vitro, были проанализированы методом электронной микроскопии и спектрального микроанализа в лаборатории ИКЗ ТюмНЦСО РАН (г. Тюмень). В результате было определено, что СБКФМП, нанесенное на титановые имплантаты, имеет макро-, микро- и ультрамикроэлемент-ный состав и структуру поверхности, максимально приближенные к костной ткани.
Для изучения формирования биопленки на поверхности титановых имплантатов был использован метод G. OToole (2000), модифицированный в авторском исполнении [16]. В исследовании использовали музейные тест-штаммы: S. aureus 25923 АТСС, P. aeruginosa 27853 АТСС, и антибиотикорезистентные госпитальные изоляты: S. aureus 889 (MRSA), P.aeruginosa 9672, выделенные у пациентов с перипротезной инфекцией, остеомиелитом трубчатых костей и позвоночника. Забор биологического материала и подготовку госпитальных изолятов проводили сотрудники бактериологической лаборатории ГБУЗ ТО ОКБ № 2 г. Тюмени.
Исходная концентрация тест-штаммов соответствовала 0,5 MF, рабочая концентрация составляла 1,5х103 КОЕ/мл.
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Результаты и их обсуждение
При определении антибактериальной активности экзоме-таболитов B. bifidum в отношении антибиотикорезистент-ных госпитальных изолятов S. aureus 889 (MRSA) и P. aeruginosa 9672 отмечено отсутствие роста бактерий.
При изучении антибактериальной активности экзомета-болитов B. bifidum в отношении S. aureus 25923 АТСС было отмечено отсутствие роста в концентрациях микроорганизмов от 1,5х107 до 1,5х102 КОЕ/мл; в отношении P. aeruginosa 27853 АТСС - отсутствие роста в концентрациях от 1,5х106 до 1,5х102 КОЕ/мл, а в концентрации 1,5х107 КОЕ/мл регистрировался рост единичных колоний.
Доказано высокое бактерицидное воздействие экзометабо-литов в отношении музейных тест-штаммов и антибиотикоре-зистентных госпитальных изолятов: S. aureus, P. aeruginosa.
Биопленкообразующая активность тест-штаммов микроорганизмов на титановых имплантатах оценивалась по оптической плотности (D).
Сравнительный анализ полученных результатов по изучению биопленкообразования через 24 часа эксперимента показал значительную разницу оптической плотности при использовании комбинации экзометаболитов B. bifidum с СБКФМП на титановых имплантатах (опыт) в сравнении с использованием титановых имплантатов с СБКФМП без экзометаболитов B. bifidum (контроль). Максимальное сдер-
живание биопленкообразования (50%) выявлено у музейного тест-штамма P. aeruginosa (рис. 1).
Оценивая результаты эксперимента через 96 часов, выявлено, что значения оптической плотности у музейного и госпитального тест-штаммов P. aeruginosa, как в опыте, так и в контроле, увеличились и достоверных различий не наблюдалось (p>0,05). Максимальное сдерживание биопленкообразования (46,6%) выявлено при сравнении результатов у госпитального тест-штамма S. aureus (рис. 2).
Таким образом, экспериментально было доказано влияние экзометаболитов B. bifidum на формирование биопленки как госпитальными изолятами, так и музейными тест-штаммами микроорганизмов. Экзометаболиты стабильно сдерживали формирование биопленки S. aureus через 24 и 96 часа экспозиции (p<0,05). В то же время сдерживающая активность экзометаболитов у музейного и госпитального тест-штаммов P. aeruginosa проявлялась через 24 часа, а через 96 часов достоверных отличий выявлено не было (p>0,05).
Учитывая выше выявленные свойства экзометаболитов B. bifidum, представляется возможность их применения для предотвращения первичной контаминации и биопленкообразования на поверхности имплантатов с синтетическим биоактивным кальций-фосфатным минеральным покрытием при травматолого-ортопедической патологии.
Выводы
Доказана высокая антибактериальная активность экзометаболитов B. bifidum в отношении антибиотикорезистент-ных музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus, P. aeruginosa в экспериментах in vitro.
Выявлено сдерживающее влияние экзометаболитов
B. bifidum на формирование биопленки музейными штаммами и госпитальными изолятами S. aureus, P. aeruginosa на поверхности синтетического биоактивного кальций-фосфатного минерального покрытия на титановых имплан-татах и позволяет рассматривать их применение при травматолого-ортопедической патологии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лещишин Я.М. Инфекции области хирургического вмешательства (ИОХВ) в экстренном хирургическом стационаре: распространенность и структура. Многопрофильная больница: проблемы и решения // Мат-лы XV юбилейной всероссийской науч.-практ. конф. Ленинск-Кузнецкий. 2011. С. 167-169.
Leshchishin Ya.M. Infektsii oblasti khirurgicheskogo vmeshatel'stva (IOKhV) v ekstrennom khirurgicheskom statsionare: rasprostranennost' i struktura. Mnogoprofil'naya bol'nitsa: problemy i resheniya // Mat-ly XV yubileynoy vserossiyskoy nauch.-prakt. konf. Leninsk-Kuznetskiy. 2011. S.167-169.
2. Малков И.С., Шакиров М.И., Пизамутдинов Е.З. и др. Интраоперационная профилактика раневых гнойно-воспалительных осложнений. Казанский медицинский журнал. 2006. № 2. С. 108-110.
Malkov I.S., Shakirov M.I., Pizamutdinov E.Z. i dr. Intraoperatsionnaya profilaktika ranevykh gnoyno-vospalitel'nykh oslozhneniy. Kazanskiy meditsinskiy zhurnal. 2006. № 2. S. 108-110.
3. Божкова С.А. Тихилов Р.М., Разоренов В.Л. и др. Микробиологические аспекты антибактериальной терапии парапротезной инфекции, вызванной грамположительными возбудителями. Инфекции в хирургии. 2011. № 9 (3).
C. 31-36.
Bozhkova S.A. Tikhilov R.M., Razorenov V.L. i dr. Mikrobiologicheskie aspekty antibakterial'noy terapii paraproteznoy infektsii, vyzvannoy grampolozhitel'nymi vozbuditelyami. Infektsii v khirurgii. 2011. № 9 (3). S. 31-36.
4. Павлов В.В., Садовой М.А., Прохоренко В.М. Современные аспекты диагностики и хирургического лечения пациентов с перипротезной инфекцией тазобедренного сустава. Травматология и ортопедия России. 2015. № 1. С. 116-123.
Pavlov V.V., Sadovoy M.A., Prokhorenko V.M. Sovremennye aspekty diagnostiki i khirurgicheskogo lecheniya patsientov s periproteznoy infektsiey tazobedrennogo sustava. Travmatologiya i ortopediya Rossii. 2015. № 1. S. 116-123.
S. au reus iD aureus (M) P. aeruginosa (П P- aeruginosa (M)
РИС. 1.
Результаты формирования биопленки тест-штаммами на титановых имплантатах с синтетическим биоактивным кальций-фосфатным минеральным покрытием в комбинации с экзометаболитами B. bifidum через 24 часа.
1,80
S.aureuïin S.aureus(M) P. aeruginosa [Г| R aeruginosa [Ml
РИС. 2.
Результаты формирования биопленки тест-штаммами на титановых имплантатах с синтетическим биоактивным кальций-фосфатным минеральным покрытием в комбинации с экзометаболитами B. bifidum через 96 часов.
