CC BY
96
УДК 581.143.6
М.В. Скапцов, М.Г. Куцев
Южно-Сибирский ботанический сад Алтайского государственного университета (г. Барнаул)
влияние 24-эпибрассинолида на продолжительность КУЛЬТИВИРОВАНИя ЩАВЕЛя (Rumex acetosa L.) in vitro
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (проект № 14.В37.21.0110).
Изучено влияние 24-эпибрассинолида на повышение устойчивости регенеран-тов щавеля кислого (Rumex acetosa L.) в периоды доращивания и акклиматизации с последующим переносом в тепличные условия. Исследована возможность продолжительного культивирования без смены питательной среды (Мурасиге - Ску-га), а также выживаемостьрегенерантов в период акклиматизации. Установлено оптимальное соотношение регуляторов роста для каллусогенеза, геммагенеза и ризогенеза. Для доращивания использовали питательную среду A MS с внесением 24-эпибрассинолида в концентрациях 0,1; 0,5; 1 мг/л. Установлено, что 24-эпи-брассинолид в концентрации 0,5 мг/л увеличивает продолжительность культивирования регенерантов без смены питательной среды в 2 раза, по сравнению с контролем. Для акклиматизации регенеранты пересаживали в песчано-торфяную смесь (1:1) с поливом раствором 24-эпибрассинолида в концентрации 0,5 мг/л. Выявлено снижение гибели регенерантов в 2 раза, по сравнению с контролем.
Ключевые слова: эксплант; каллус; микроклональное размножение; акклиматизация; 24-эпибрассинолид; щавель (Rumex acetosa L.).
Введение
В связи с развитием биотехнологии растений стало возможным производить большое количество безвирусных культур растений, как декоративных, так и сельскохозяйственных. Конечной стадией биотехнологического процесса является доращивание регенерантов растений на твердой питательной среде, затем в грунте или на жидких средах в гидропонной установке. При этом возможны значительные потери регенерантов при перенесении в грунт, особенно при производстве в больших масштабах. В зависимости от используемых составов для доращивания, а также видов растений гибель регенерантов составляет от 10 до 80% [1—3]. Снижение влияния данного явления способно увеличить эффективность биотехнологического процесса.
Возможным способом снижения данного явления является внесение в питательные среды и обработка регенерантов регуляторами роста, особенно фитостероидами (брассинолидами). Отмечено положительное действие
фитостероидов на общий гормональный фон растений, устойчивость к засолению, засухе и некоторым другим неблагоприятным условиям [4-9].
Предполагается, что внесение 24-эпибрассинолида в питательные среды и грунт при акклиматизации позволит снизить процент гибели регенеран-тов, особенно при конечных стадиях доращивания и первых стадиях переноса в грунт, тем самым позволяя укрепить корневую, листостебельную и другие системы организма регенеранта.
Материалы и методики исследования
Культивирование in vitro изолированных тканей и органов растений осуществляли согласно общепринятым рекомендациям с вариациями [10]. На различных этапах экспериментальной работы использовали минеральную основу питательных сред по прописи Мурасиге - Скуга (MS) с добавлением 30 г/л сахарозы, 100 мг/л мезоинозитола (SigmaAldrich, GmbH), 3 г/л фи-тагеля (SigmaAldrich, GmbH) [11]. Поверхностную стерилизацию листьев проводили в течение 15 мин в 0,5%-ном растворе гипохлорита натрия [12]. В качестве исходного материала для индукции каллусогенеза была использована область по периферии центральной жилки листа Rumex acetosa L., которую делили на фрагменты и помещали на питательные среды.
Для индукции и поддержания каллусогенеза экспланты культивировали на твердой питательной среде MS с добавлением ауксинов и цитокининов в различных концентрациях и сочетаниях: бензиладенин-6 (БА) (SigmaAldrich, GmbH), a-нафтилуксусная кислота (НУК) (SigmaAldrich, GmbH), дихлор-феноксиуксусная кислота (2,4-Д) (SigmaAldrich, GmbH), 4-амино-3,5,6-трихлорпиколиновая кислота (АТХП) (SigmaAldrich, GmbH). Каллусогенез индуцировали при различных сочетаниях регуляторов роста, в условиях за-темненности, при температуре 25°С. Субкультивирование осуществляли через 14 сут до появления белого плотного каллуса. После этого каллусы пассировали на те же питательные среды и переносили в климатическую камеру КС-200 (ОАО «Смоленское СКТБ СПУ», Россия) с фотопериодом день (8 ч) : ночь (1б ч) и температурой 23°С и культивировали до появления побегов.
Полученные побеги срезали и переносили на питательную среду V MS, содержащую 0,25 мг/л НУК с целью индукции ризогенеза. После достижения достаточного уровня развития корневой системы регенеранты пассировали на питательную среду % MS для доращивания, содержащую 0 (контроль); 0,1; 0,5; 1 мг/л 24-эпибрассинолида. Регенеранты культивировали в климатической камере без смены питательной среды в течение 1-4 мес. Параллельно проводили эксперимент по внесению 24-эпибрассинолида в питательные среды на конечных стадиях доращивания. После доращивания регенеранты пересаживали в грунт (песок:торф - 1:1) и переносили в тепличные условия. Полив производили раствором 24-эпибрассинолида в концентрации 0 (контроль); 0,1; 0,5; 1 мг/л в течение недели.
Данные о выживаемости регенерантов, полученные в ходе экспериментов, обрабатывали с помощью программы StatSoft STATISTIKA .6.0.
Результаты исследования и обсуждение
Значительное влияние на длительное поддержание активно пролиферирующей культуры in vitro оказывает оптимальное соотношение регуляторов роста. Как показали результаты наших исследований, темпы роста каллусов R. acetosa L. значительно выше при концентрациях 1 мг/л БА и 2 мг/л НУК. После переноса в условия фотопериода в течение 2-4 недель наблюдалось побегообразование. После переноса на питательную среду V MS, содержащую 0,25 мг/л НУК, наблюдался ризогенез. Доращивание проводили при тех же условиях на питательной среде % MS без гормонов (рис. 1, А—Г).
Рис. 1. Микроклональное размножение R. acetosa L. in vitro: А - каллусогенез;
Б - геммагенез; В - ризогенез и доращивание; Г - акклиматизация;
Д - доращивание в течение 1,5 мес. без смены питательной среды; Е - доращивание в течение 3 мес. без смены питательной среды в присутствии 24-эпибрассинолида
При внесении 24-эпибрассинолида в питательную среду на стадии доращивания наблюдалось увеличение возможного срока культивирования в 2 раза без смены питательной среды, тогда как культивирование контрольных экземпляров без внесения 24-эпибрассинолида невозможно более 1-1,5 мес. вследствие гибели последних (рис. 1, Д, Е).
Внесение 24-эпибрассинолида на конечных стадиях доращивания, а также полив регенерантов на стадии акклиматизации раствором 24-эпибрас-синолида позволяли снизить процентное соотношение погибших регене-рантов. В результате переноса в условия окружающей среды наблюдалось снижение процента гибели регенерантов в два раза (таблица).
Влияние 24-эпибрассинолида на эффективность акклиматизации регенерантов R. acetosa L.
Концентрация 24-эпибрассинолида, мг/л Среднее значение гибели регенерантов и относительная ошибка среднего значения, % Коэффициент вариации, %
0,0 19,9 ± 0,67 0,10
0,1 16,9 ± 0,69 0,13
0,5 10,1 ± 0,35 0,10
1,0 11,4 ± 0,62 0,16
Заключение
Внесение в питательные среды 24-эпибрассинолида при микроклональ-ном размножении R. acetosa L. способствовало снижению гибели эксплантов и увеличению сроков культивирования регенерантов без смены питательной среды. При доращивании у регенерантов, выращиваемых без 24-эпибрас-синолида, на начальных стадиях наблюдалось более активное развитие листостебельной части, тогда как различий в развитии корневой системы не наблюдалось. Предполагается, что повышение устойчивости на начальных стадиях акклиматизации связано со снижением темпов развития «зеленой» части и перехода от резких ростовых процессов к усилению общего развития.
Литература
1. Bhatt I.D., Dhar U. Factors controlling micropropagation of Myrica esculenta Buch. Ham.
ex D. Don: a high value wild edible of Kumaun Himalaya // African Journal of Biotechnology. 2004. Vol. 3, № 10. Р. 534-540.
2. Nas M.N. Improved rooting and acclimatization of micropropagated hazelnut shoots // Hort-
Science. 2004. Vol. 39, № 7. P. 1688-1690.
3. Gutierrez I.E.M., Nepomuceno C.F., Ledo C.A.S., Santana J.R.F. Micropropagation and ac-
climatization of Bauhinia cheilantha (an important medicinal plant) // African Journal of Biotechnology. 2011. Vol. 10, № 8. Р. 1353-1358.
4. Budiarto K. Micro propagation of several potted Anthurium accessions using spathe explants
// Jurnal Natur Indonesia. 2008. Vol. 11, № 1. P. 59-63.
5. Mariani T.S., Fitriani A., Teixeira da Silva J.A. et al. Micropropagation of Aglaonema using
axillary shoot explants // International Journal of Basic & Applied Sciences IJBAS-IJENS. 2011. Vol. 11, № 01. Р. 46-53.
6. Khan S., Naseeb S. and Ali K. Callus induction, plant regeneration and acclimatization of
African violet (Saintpaulia ionantha) using leaves as explants // Pakistan Journal of Botany. 2007. Vol. 39, № 4. Р. 1263-1268.
7. Qayyum B., Shahbazl M. and Akram N.A. Interactive effect of foliar application of 24-epi-
brassinolideand root zone salinity on morpho-physiological attributes of wheat (Triticum aestivum L.) // International Journal of Agricultural and Biological Engineering. 2007. Vol. 9, № 4. Р. 584-589.
8. Houimli S.I.M., Denden M., Hadj S.B. Induction of salt tolerance in pepper (Capsicum an-
nuum) by 24-epibrassinolide // EurAsian Journal of BioSciences. 2008. Vol. 2. P. 83-90.
9. Ефимова М.В., Мануйлова А.В., Малофий М.К. и др. Влияние брассиностероидов на
формирование защитных реакций проростков рапса в условиях засоления // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2013. Т. 21, № 1. С. 118-128.
10. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе : учеб. пособие. М. : ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.
11. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Plant Physiology. 1962. Vol. 15, № 13. Р. 473-497.
12. Stewart C.N.J. Plant biotechnology and genetics : Principles, techniques and applications. New Jersey : John Wiley & Sons, 2008. 352 p.
Поступила в редакцию 07.04.2013 г. Tomsk State University Journal of Biology. 2013. № 2 (22). P 52-56
Mikhail V. Skaptsov, Maxim G. Kutsev
South-Siberian Botanical Garden of Altai State University, Barnaul, Russia
EFFECT OF 24-F.PIBRASSINOLIDF. ON DURATION OF SORREL (Rumex acetosa L.) CULTIVATION in vitro
In this study there was used 24-epibrassinolide - plant steroid hormone, responsible for the physiological response of plants to various environmental stresses. The effect of 24-epibrassinolide on the improvement of the sustainability of regenerates during completion of growing and acclimatization and then its transfer to greenhouse conditions were studied. We investigated the possibility of a prolonged cultivation without changing the medium, as well as the survival of regenerates during acclimatization. For research, sorrel (Rumex acetosa L.) was introduced into the culture in vitro by using the MS medium, with the addition of 30 g/l of sucrose, 100 mg/l of mesoinozitol and 3 g/l of phytagel. We used standard methods of cultivation with modifications. Benzyladenine-6 and a-naphthaleneacetic acids were used as growth regulators. The optimum ratio of growth regulators for callus formation, gemmagenesis and rhizogenesis was found. Culture medium % MS was used for completion of growing with the addition of 24-epibrassinolide at concentrations of 0.1, 0.5, and 1 mg/l. It was found that the 24-epibrassinolide at 0.5 mg/L increased the duration of regenerates ’ cultivation, without changing the culture medium, 2 times, as compared to control. Regenerates cultivated without adding 24-epibrassinolide in solid % MS medium died after 1-1.5 months of cultivation. For acclimatization, regenerates were transferred into sand and peat mixture (1:1) in greenhouse conditions with watering by 24-epibrassinolide solution in concentration of 0.5 mg/l. Watering was applied during a week. The cases of death of regenerates decreased 2 times as compared to control. It was found that it was possible to extend the period of cultivation, and reduce the degree of death of regenerates almost two-fold, provided 24-epibrassinolide was introduced in culture media, starting from the stage of regeneration, rooting and acclimatization at a concentration of 0.5 mg/l. The specimens grown with the addition of 24-epibrassinolide are characterized by lower level of development of the leafy part. Characteristically, this phenomenon is often observed at plant species in a stress situation. Root system reduction was not recorded. This phenomenon is supposed to be one of the reasons why the death of regenerates decreased in the period of acclimatization.
Key words: explant; calli; microclonal propagation; acclimatization;
24-epibrassinolide; sorrel (Rumex acetosa L.).
Received April 7, 2013
