CC BY
47
Turczaninowia 18 (4): 41-48 (2015) DOI: 10.14258/turczaninowia.18.4.5 http://turczaninowia.asu.ru
I ISSN 1560-7259 (print edition)
TURCZANINOWIA
I ISSN 1560-7267 (online edition)
УДК 581.143.6+582.998
Сомаклональная изменчивость девясила британского -Inula britannica L. в культуре in vitro
Somaclonal variation of Elecampane, Inula britannica L. in culture in vitro
М. В. Скапцов, Д. Л. Белкин, С. В. Смирнов, М. Г. Куцев M. V. Skaptsov, D. L. Belkin, S. V. Smimov, M. G. Kutsev
Алтайский государственный университет, пр-т Ленина, 61, Барнаул, 656049, Россия. E-mail: [email protected] Altai State University, Lenina str., 61, Barnaul, 656049, Russia
Ключевые слова: каллус, ПЦР, проточная цитометрия, содержание ДНК, размер генома. Key words: callus, PCR, flow cytometry, DNA content, genome size.
Аннотация. Было изучено влияние сомаклональ-ной изменчивости в каллусной культуре и регене-рантах девясила - Inula britannica L. Культивирование каллусов осуществляли на питательной среде в присутствии ауксинов и цитокининов на протяжении 12 месяцев, после чего стимулировали органогенез. Полиморфизм регенерантов и каллусов исследовали при помощи фрагментного анализа с применением RAF-маркеров. Степень геномных изменений исследовали с помощью проточной цитометрии. Анализ процентного соотношения полиморфных локусов показал увеличение генетического разнообразия на стадии каллуса, тогда как на стадии регенерации подобный полиморфизм восстанавливался до прежнего уровня. Изменения в размере генома регенерантов не наблюдались на первых месяцах культивирования, тогда как в некоторых случаях вариации генома реге-нерантов после 12 месяцев культивирования каллуса достигали 26 %. Более того, регенеранты со сроком субкультивации 12 месяцев формировали явные мутации в генеративных органах растений.
Summary. The effect of somaclonal variation in callus culture and regenerants of elecampane - Inula britannica L. was studied. Calluses were cultured in medium in the presence of auxin and cytokinin for 12 months followed by stimulation of organogenesis. Polymorphism of calluses and regenerants were examined by fragment analysis using RAF-markers. Degree of genomic changes in callus cell cultures was assessed by flow cytometry. Analysis of the percentage of polymorphic loci demonstrated increasing genetic diversity on stages of callus cultures, whereas the induced polymorphism was restored to the
original level at the regeneration phase. Changes in the size of regenerant's genome were not readily identified in the first month of culturing, whereas in some samples the variations in genome of regenerants after 12 months callus culturing reached 26 %. Moreover, 12 month sub-cultured regenerants formed mutations in the generative organs of plants.
Культура клеток и тканей растений in vitro уже многие десятки лет используется для микроразмножения, сохранения биоразнообразия, исследования изменений генома изолированных клеток и экспрессии трансгенов. Тотипотентность соматических клеток растений позволяет направлять их дедифференцировку и под воздействием регуляторов роста вызывать регенерацию. Возможность получения тысяч особей растений из кусочка ткани является привлекательной для сохранения редких, исчезающих и хозяйственно-ценных видов растений. Но открытие явления сомаклональной изменчивости ставит под сомнение основную идею сохранения растений in vitro - сохранение генетического разнообразия исходного вида (Larkin et al., 1981).
Генетические процессы в культуре in vitro зачастую не подчиняются какой-либо закономерности, а происходят случайно. Выделяют три основных метода сохранения растений в культуре in vitro: микроразмножение, соматический эмбриогенез и суспензионная культура
Поступило в редакцию 24.08.2015 Submitted 24.08.2015
Принято к публикации 17.11.2015 Accepted 17.11.2015
протопластов. Микроразмножение, основанное на прямой регенерации, - наиболее распространенный метод для сохранения медицинских или редких и эндемичных видов растений (Dang et al., 2011; Sarasan, 2006; Sivanesan et al., 2012). Данная техника позволяет получать из одного растения-донора тысячи регенерантов. В связи с коротким периодом времени пребывания органов растений на питательной среде с регуляторами роста снижается риск влияния ауксинов на генетический материал растений. Культура протопластов основана на выращивании в жидкой питательной среде изолированных растительных клеток в присутствии регуляторов роста и ингибиторов образования клеточной стенки. Отдельные клеточные линии могут быть заморожены в жидком азоте, что в будущем позволяет провести регенерацию, по пути, соматического эмбриогенеза. Соматический эмбриогенез - более длительный процесс, связанный с формированием развитого растительного зародыша из группы клеток. Обычно данный процесс связан с каллусогенезом. Дедифференцировка клеток вызывается изменением соотношения регуляторов роста в сторону ауксинов. Многие авторы отмечают значительные генетические изменения в каллусной культуре, особенно при длительной пролиферации клеток (Ghorbanpoura, Khadivi-Khub, 2015; Mgbeze, Iserhienrhien, 2014; Muth-usamy, Jayabalan, 2014). Данная культура, как и культура протопластов, наиболее подвержена сомаклональной изменчивости. В большинстве случаев изменения в генотипе не затрагивают работу генов гомеобокса или генов, отвечающих за формирование фенотипа растения, что связано с высоким присутствием аллелей данных генов. Так как больше половины генома представлено мобильными генетическими элементами, вариации проявляются только в размере генома (Kumar, Bennetzen, 1999). Но с повышением генетической неоднородности клеток появляется вероятность формирования новых признаков, особенно при длительном культивировании клеток в каллусной культуре. Сохраняя сомаклональные варианты, можно получить новые морфологические формы растений, изменения в генеративных функциях, и выделить новые сельскохозяйственные признаки (Biswas et al., 2009; Li et al., 2010; Sun et al., 2013). Для исследования полиморфизмов клеточных линий каллусных культур в основном используют метод RAPD-анализа (Ehsanpour et al, 2007). Получаемые данные являются довольно досто-
верными, но без учета геномных и хромосомных изменений сложно представить полную картину произошедших мутаций. Кроме того, зачастую проводят анализ только каллусных культур без учета данных полиморфизма регенерантов. Целью наших исследований является анализ геномных изменений в культуре клеток и тканей Inula britannica L. (девясила британского). Основными задачами является индукция и поддержание каллусной культуры на протяжении 12 месяцев с формированием нескольких групп сомаклонов на разных стадиях пролиферации каллуса, с последующим кариологическим, цитогенетиче-ским и молекулярно-генетическим анализом.
Материалы и методы
Культивирование in vitro изолированных тканей и органов растений мы осуществляли согласно общепринятым рекомендациям с вариациями (Butenko, 1999). На различных этапах экспериментальной работы использовали минеральную основу питательных сред по прописи Мурасиге -Скуга (MS) c добавлением 30 г/л сахарозы, 100 мг/л мезоинозитола, 3 г/л фитогеля (Murashige, Skoog, 1962). Поверхностную стерилизацию листьев проводили в течение 15 мин. в 0,5 % растворе гипохлорита натрия. В качестве исходного материала для индукции каллусогенеза была использована область по периферии центральной жилки листа I. britannica с одного экземпляра, которую делили на фрагменты и помещали на питательные среды. Для индукции и поддержания каллусогенеза экспланты культивировали на твердой питательной среде MS с добавлением бензиладенина-6 (БА) и а-нафтилуксусной кислоты (НУК) в концентрациях 1 мг/л и 2 мг/л, соответственно (Skaptsov, Kutsev, 2013). Каллус-ные ткани отделяли от первоначального эксплан-та и субкультивировали в климатической камере с фотопериодом день (8 ч) : ночь (16 ч) и температурой 23 °С. После 3 месяцев культивирования часть каллусных тканей переносили на среды MS без регуляторов роста и субкультивировали до образования побегов. Формирование побегов наблюдали через 3 месяца после субкультивирования. Полученные побеги срезали и переносили на питательную среду '/г MS, содержащую 0,25 мг/л НУК и 1 мкМ 24-эпибрассинолида с целью индукции ризогенеза и акклиматизации. Сформировавшиеся растения переносили в пес-чано-торфяную смесь и доращивали до стадии цветения в тепличных условиях. Те же этапы со-
Turczaninowia 18 (4): 41-48 (2015)
43
вершали с каллусными тканями девяти месяцев культивирования.
Для дальнейших исследований формировали четыре номинальные популяции с выборкой по 15 образцов в каждой (табл.).
Меристематические клетки для исследования хромосомного состава были получены из кончиков корней регенерантов девясила. Корни помещали в воду с температурой таяния льда и инкубировали 24 часа в темноте. Предфиксационную обработку проводили в 0,05 % растворе колхицина при температуре 25 °C в течение 3 часов, затем фиксировали в фиксаторе (уксусном алкоголе). Фиксированные образцы инкубировали в 45 % уксусной кислоте при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем образцы нагревали в 2 % ацетоорсеине и окрашивали 30 мин. при комнатной температуре. Для получения монослоя клеток проводили раздавливание наиболее интенсивно окрашенных участков материала в 45 % уксусной кислоте под покровным стеклом. Полученные препараты исследовали методом прямой световой микроскопии (Tanaka, 1959).
Относительное содержание ДНК определяли при помощи метода проточной цитометрии с окраской изолированных ядер иодидом про-пидия. Для этого молодые листья регенерантов девясила измельчали при помощи лезвия в 500 мкл охлажденного буфера Otto I с модификациями (0,1 M лимонной кислоты, 0,5 % Triton) и инкубировали 10 мин. при комнатной температуре (Otto, 1990). Образцы фильтровали через нейлоновую мембрану с размером пор 50 мкм и смешивали с раствором для окрашивания, состоящим из 1 мл Tris-MgCl2 буфера (0,4 M Tris-основание, 4 mM MgCl^Kp) c PI (50 цг/мл), РНазы (50 цг/мл) и ß-меркаптоэтанола (1 цл/мл) (Dolezel et al., 1998; Pfosser et al., 1995). Для ин-
терпретации данных использовали пики с не менее чем 1000 детектируемых частиц.
В качестве внешнего стандарта использовали изолированные ядра Pisum sativum L. сорта Адагумский с известным содержанием ДНК 2C = 8,0 пг (Skaptsov et al., 2014). Данные флюоресценции изолированных ядер детектировали при помощи проточного цитометра Partee CyFlow PA (Partee, GmbH) с лазерным источником излучения с длиной волны 532 нм. Сигналы записывались в логарифмическом представлении данных флюоресцении (логарифмическая шкала). Для трансформации данных из логарифмического в линейное представление использовали формулу 1 (Marie, Brown, 1993). Содержание ДНК рассчитывали согласно формуле 2. Полученные результаты обрабатывали при помощи ПО Statistiea 8.0 (StatSoft Ine.) и штатного ПО проточного цито-метра CyView (Partee, GmbH).
Формула 1. f = 10X/64, где f - индекс (разница между средними значениями пика образца и стандарта в линейной шкале); Х - разница между средними значениями пиков (каналов) стандарта и образца в логарифмической шкале; 64 - частное между количеством каналов шкалы прибора на количество декад на полной логарифмической шкале (256/4 для Partee CyFlow PA).
Формула 2. 2С = f*M, где f - см. формулу 1; M - среднее значение пика образца.
В качестве основы молекулярно-генетическо-го анализа использовали фрагментный анализ ДНК RAF (Randomly Amplified DNA Fingerprints) (Waldron et al., 2002). ДНК изолировали, используя СТАБ-метод (Doyle J. J., Doyle J. L., 1987). Для работы использовали олигонуклеотиды серии RAF, а именно K-02b 5'-GTCTCCGCAG-3'.
Процентное содержание полиморфных локусов и раз Таблица
Популяция %P I Т, сут. мин. 2С, пг макс. 2С, пг
Гор1 75,00 % 0,398 - 1,95 2,15
Гор2 85,94 % 0,421 180 1,83 2,25
Гор3 78,13 % 0,340 180 1,99 2,11
Гор4 75,00 % 0,295 360 1,53 1,92
Среднее 78,52 % - - - -
SE 2,58 % - - - -
Примечание: Рор1 - растения-доноры эксплантов, выращенные из семян; Рор2 - изолированные каллусные ткани, прошедших субкультивацию отдельно друг от друга в течение 6 месяцев; Рор3 - регенераты после 6 месяцев культивирования каллуса; Рор4 - регенеранты после 12 месяцев культивирования каллуса; I - индекс Шеннона; SE - стандартная ошибка; Т - время субкультивирования каллуса до индукции органогенеза.
Для ПЦР использовали 25 мкл реакционной смеси, содержащую 5 нг ДНК, 2,5 мкл 10x ПЦР буфера, 25 мМ MgCl2, 1 мкл 5mM смеси dNTPs, 1 мкл каждого 10мМ праймера и 1 ед. Taq-полимеразы. ПЦР проводили, используя RAF протокол: 94,0 °С - 5 мин. [94,0 °С - 30 сек., 57,0 °С - 1 мин., 56,0 °С - 1 мин., 55,0 °С - 1 мин., 54,0 °С - 1 мин., 53,0 °С - 1 мин.]х35, 72,0 °С - 10 мин., 4,0 °С в конце процесса. Фрагменты ДНК разделяли с помощью техник микрофлюидного электрофореза на автоматической электрофоретической станции Experion (Bio-Rad, USA) с использованием набора Experion DNA 1K Analysis Kit (BioRad, USA). При анализе были сформированы матрицы на основе присутствия (1) или отсутствия (0) фрагментов равной длины (Kutsev, 2009; Kut-sev et al., 2013). Для дальнейшего анализа было
использовано 64 фрагмента для каждого из 60 образцов. Далее набор данных был использован для расчета молекулярной дисперсии (АМОУА), полиморфизма популяций, индекса Шэннона и генетических дистанций Нея (с использованием программного обеспечения GeneALEx 6.5 1978; Реака11, Smouse, 2012).
Результаты и обсуждение
Активную пролиферацию каллусных клеток наблюдали через две недели после переноса экс-плантов на питательные среды. 100 % эксплантов формировали каллусные ткани. После отделения каллусных клеток от первоначального экспланта формировались твердые зеленые каллусы, которые мы культивировали в течение 12 месяцев.
Рис. 1. Этапы культивирования I. britannica in vitro и доращивание условиях закрытого грунта: а - органогенез из каллусных тканей; б - мультипликация побегов; в - отделение единичных побегов и ризогенез; г - мутант-ная форма - ускоренное развитие генеративной части растения; д - фенотип I. britannica в норме; е - мутант-ная форма корзинки; ж - форма корзинки в норме.
Тигсттпом^а 18 (4): 41-48 (2015)
45
После субкультивирования каллусных тканей трех и девяти месяцев культивирования на безгормональных питательных средах мы в течение трех месяцев наблюдали индукцию органогенеза и мультипликацию побегов (рис. 1а, б). После мультипликации на среде для ризогенеза отдельные побеги образовывали корни (рис. 1в). Морфология ювенильных растений, выращенных из семян (Рор1), не отличалась от регенерантов, полученных как после шести месяцев культивирования каллуса (Рор3), так и после двенадцати (Рор4). Формирование генеративных побегов наблюдали в течение 6 месяцев выращивания в условиях закрытого грунта. Отличий в формировании генеративных органов регенерантов Рор3 от Рор1 не наблюдалось, тогда как у представителей Рор4 в 12 случаях из 15 наблюдали схожие мутации в морфологии генеративных побегов и цветков. В случае с представителями Рор1 в норме формировался генеративный побег
длиной до 40-45 см (рис. 1д). Форма корзинки соответствовала дикой форме I. ЬпШптса (рис. 1ж). У представителей Рор4 длина генеративного побега не достигала 10-15 см, также у них наблюдалось ускоренное цветение. Часто корзинки формировались без развития цветоноса (рис. 1г). В большинстве случаев у мутантных форм Рор4 отмечались недоразвитые трубчатые и язычковые цветки, листочки обертки корзинки в 1,5-2 раза были длиннее нормы (рис. 1е).
В результате цитологического исследования установлено, что количество хромосом I. ЬпШп-теа в норме равно 2п = 16 (рис. 2а). В результате цитофлюориметрического исследования относительное содержание ДНК I. ЬпШптса в норме составило 2С = 2,09 пг (рис. 2б). Размер геномных изменений особей, регенерировавших из каллусов после 6 месяцев культивирования, являлся незначительным и варьировал в пределах ± 6-7 % (2С = 1,95 пг) (рис. 2в). В некоторых
Рис. 2. Кариологические и цитогенетические исследования регенерантов I. Ьп(апп1еа: а - хромосомный состав I. ЬгНаппгеа; б - гистограмма относительного содержания ДНК I. Ьп(апп1еа в норме, 2С = 2,09 пг; в - гистограмма относительного содержания ДНК регенерантов I. ЬгНаппгеа из популяции Рор3, 2С = 1,95 пг; г - гистограмма относительного содержания ДНК регенерантов I. Ьп(апп1еа из популяции Рор4, 2С = 1,53 пг.
случаях наблюдалось значительное уменьшение относительного содержания ДНК в Рор4 - до 26 % (рис. 2г). Полученные данные, связанные с незначительным уменьшением размера генома, можно объяснить крупными делециями; более крупные мутации в геноме, связанные со снижением содержания ДНК до 1,56 пг, скорее всего, связаны с хромосомными мутациями.
После проведения электрофоретического разделения было получено 64 фрагмента для каждого образца. Анализ выборки методом генетических дистанций Нея и расчета полиморфизма популяций (с помощью индекса Шеннона) по всем 64 генетическим признакам показал, что длительное культивирование клеток на питательных средах в присутствии ауксинов и ци-токининов вызывает увеличение полиморфизма сомаклонов. Удаление регуляторов роста из состава питательной среды с преобладанием ци-токининов и гиббереллинов вызывает снижение полиморфизма популяций. При этом после регенерации растения и переноса его на питательные среды без гормонов наблюдается полное восстановление полиморфизма популяций (табл.). Другая ситуация наблюдается с генетическими дистанциями между данными группами. Генетические дистанции Нея между популяциями Рор1-Рор4 увеличиваются прямо пропорционально длительности культивирования и максимальны между популяциями Рор1 и Рор4, что наглядно демонстрирует UPGMA-анализ матрицы генетических дистанций Нея (рис. 3). Эти данные свидетельствуют о возникновении значительной генетической неоднородности между растением-донором, каллусами и регенерантами. Индекс видового разнообразия (индекс Шеннона) косвенно подтверждает эти данные и достигает
Unweight pair-group average 1-Pearson г
Popí Pop2
РорЗ
Pop4
0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 Linkage distance
Рис. 3. Статистическая обработка данных фрагмента* генетических дистанций Нея.
максимальных значений у представителей Рор2. AMOVA-анализ для четырех номинальных популяций показал, что 85 % вариаций были внутри популяций, когда 15 % были связаны с вариациями между популяциями (P < 0,001). Среднее попарное значение PhiPT (аналог FST - показатель генетической дифференциации) составило 0,148, что может означать относительно высокий уровень генетической дифференциации. Максимальное значение PhiPT наблюдалось между популяциями Рор1 и Рор4 (0,236), минимальное -между Рор1 и РорЗ (0,075).
Ранее методы фрагментного анализа, такие как RAF, DAF, ISSR и прочие, находили свое применение в основном для определения генетических дистанций природных популяций. В биотехнологии растений данные методы активно применяются для исследования влияния со-маклональной изменчивости в культуре in vitro. В некоторых работах анализируются процессы генетических изменений лишь в каллусной культуре. Авторы замечают значительные изменения в геноме в процессе пролиферации каллуса, но не учитывают полиморфизм растений-доноров и регенерантов (Encheva et al., 2003; Ghorbanpoura, Khadivi-Khub, 2015). В нашем случае после одного года пролиферации каллуса на питательной среде с ауксинами полиморфизм восстанавливается на уровне, близком к первоначальному. В нашей работе мы использовали RAF-анализ для оценки генетических различий искусственно созданных (номинальных) популяций in vitro. Культура in vitro позволяет в течение короткого времени проследить активность мутационных процессов на уровне генома и генотипа. До 90 % мутаций, происходящих в процессе длительного культивирования, оказываются леталь-
Pairwise Population Matrix of Nei Genetic Distance
Popí Рор2 РорЗ Рор4
0,000 Popí
0,105 0,000 Рор2
0,107 0,058 0,000 РорЗ
0,118 0,085 0,095 0,000 Рор4
анализа. Дендрограмма UPGMA на основе матрицы
Turczaninowia 18 (4): 41-48 (2015)
47
ными. Несмотря на тот факт, что внутри таких искусственных популяций растут генетические различия, полиморфизм генов в каллусах увеличивается, но не зависит от длительности культивирования. AMOVA косвенно подтверждает полученные данные. Примечательно, что при анализе молекулярных вариаций минимальный показатель генетической дифференциации PhiPT мы наблюдали между популяциями Рор1 и Рор3, тогда как генетическая гетерогенность между популяциями Рор1 (растение-донор) и Рор2 (каллус) была несколько выше (0,086). Значения полиморфизма, индекса Шеннона и значения генетической дифференциации PhiPT позволяют утверждать, что уже на стадии пролиферации каллуса наблюдается значительное увеличение генетической гетерогенности. Несмотря на восстановление полиморфизма в популяции регенерантов Рор4, матрица генетических дистанций Нея показывает различие в генетических дистанциях между популяциями. Обработка данных матрицы в UPGMA тесте с построением UPGMA-дендрограммы разбивает популяции на 3 основных кластера, причем максимальная генетическая дистанция наблюдается между популяциями Рор1 и Рор4, что подтверждается значением генетической дифференциации PhiPT.
Сомаклональная изменчивость - важный генетический фактор культур клеток и тканей растений in vitro. Данное явление проявляется практически при любом типе культивирования, особенно при длительной пролиферации каллуса. Детекция сомаклональной изменчивости важна в работах, связанных с сохранением биоразноо-
бразия в культуре in vitro, микроразмножением, культивированием растительных тканей медицинских растений, селекцией и прочими задачами. В результате исследований культур клеток и тканей I. britannica in vitro методами проточной цитометрии и фрагментного анализа выявлено, что на ранних стадиях (6 месяцев) изменения в размере генома достоверно не фиксируются, тогда как RAF-анализ показал генетическую неоднородность популяции регенерантов и увеличение генетической дистанции между регенеран-тами и растением-донором эксплантов. На более поздних стадиях (12 месяцев) сомаклональная изменчивость фиксируется методом проточной цитометрии как значительная редукция генома, и проявляется фенотипически. Таким образом, для отслеживания явления сомаклональной изменчивости необходимо использовать комплексные подходы, включающие молекулярно-гене-тические методы, хромосомный анализ, а также проточную цитометрию растений. Использование этих методов в комплексе позволит анализировать как изменения кариотипа, генотипа, так и цитотипа культивируемых растений.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке РФФИ, проект № 14-04-31156. Работы, связанные с культивированием in vitro растительного материала, выполнялись при поддержке Минобрнау-ки РФ в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности ФГБОУ ВПО «АлтГУ», код проекта: 316.
ЛИТЕРАТУРА
Biswas M. K., Dutt M., Roy U. K., Islam R., Hossain M. Development and evaluation of in vitro somaclonal variation in strawberry for improved horticultural traits // Sci Hortic-Amsterdam, 2009. - Vol. 122. - P. 409-416. DOI: 10.1016/j.scienta.2009.06.002.
Butenko R. G. Higher plant cell biology in vitro and biotechnology based on them: a tutorial. - Moskow: FBK-Press, 1999. - 160 p. [In Russian]. (Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: учеб. пособие. - М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.).
Dang J. C., Kumaria S., Kumar S., Tandon P. Micropropagation of Ilex khasiana, a critically endangered and endemic holly of Northeast India // AoB Plants, 2011. - Vol. 2011. - plr012. DOI: 10.1093/aobpla/plr012.
Dolezel J., Greilhuber J., Lucretti S., Meister A., LysakM. A., Nardi L., Obermayer R. Plant genome size estimation by flow cytometry: inter-laboratory comparison // Ann. Bot., 1998. - Vol. 82. - P. 17-26.
Doyle J. J., Doyle J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull., 1987. - Vol. 19. - P. 11-15.
Ehsanpour A.A., Madani S., Hoseini M.B. Detection of somaclonal variation in potato callus induced by UV-C radiation using RAPD-PCR // Plant Physiol., 2007. - Vol. 33. - P. 3-11.
Encheva J., Tsvetkova F., Ivanov P. A. comparison between somaclonal variation and induced mutagenesis in tissue culture of sunflower line Z-8-A (Helianthus annuus L.) // Helia, 2003. - Vol. 26. - P. 91-98.
Ghorbanpoura M., Khadivi-Khub A. Somaclonal variation in callus samples of Plantago major using inter-simple sequence repeat marker // Caryologia, 2015. - Vol. 68. - No. 1. - P. 19-24. DOI: 10.1080/00087114.2014.998128.
Kumar A., Bennetzen J. L. Plant retrotransposons // Annu Rev Genet, 1999. - Vol. 33. - P. 479-532.
Kutsev M. G. Fragmentnyy analiz DNK rasteniy: RAPD, DAF, ISSR. - Barnaul: Artika, 2009. - 163 p. [In Russian]. (Куцев М.Г. Фрагментный анализ ДНК растений: RAPD, DAF, ISSR. - Барнаул: Артика, 2009. - 163 с.).
Kutsev M. G., Skaptsov M. V., Kholodkova М. А., Ivanova M. S., Smirnov S. V., Sinitsyna T. A., Friesen N. V. Using randomly amplified DNA fingerprinting (RAF) for genotyping common and durum wheats varieties (Triticum durum and T. aestivum) // Turczaninowia, 2013. - Vol. 16, No. 3. - P. 157-159 [In Russian]. (Куцев М. Г., Скапцов М. В., Холодкова М. А., Иванова М. С., Смирнов С. В., Синицына Т. А., Фризен Н. В. Использование RAF-анализа для генотипирования сортов мягкой и твердой пшениц // Turczaninowia, 2013. - Т. 16, № 3. - С. 157-159). DOI: http:/dx.doi.org/10.14258/turczaninowia.16.3.21.
Larkin P., Scowcroft W. Somaclonal variation a novel source of variability from cell cultures for plant improvement // Theor. Appl. Genet., 1981. - Vol. 60. - P. 197-214.
Li R., Bruneau A. H., Qu R. Tissue culture-induced morphological somaclonal variation in St. Augustinegrass [Stenotaphrum secundatum (Walt.) Kuntze] // Plant Breeding, 2010. - Vol. 129. - P. 96-99. D0I:10.1111/j.1439-0523.2009.01647.x.
Marie D., Brown S. C. A cytometric exercise in plant DNA histograms, with 2C values for 70 species // Biol. Cell, 1993. - Vol. 78. - P. 41-51.
Mgbeze G. C., Iserhienrhien A. Somaclonal variation associated with oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) clonal propagation: A review // Afr. J. Biotechnol., 2014. - Vol. 13, No. 9. - P. 989-997. DOI: 10.5897/AJBX12.011.
Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Plant. Physiol., 1962. - Vol. 15, No. 13. - P. 473-497.
Muthusamy A., Jayabalan N. Radiation and chemical mutagen induced somaclonal variations through in vitro organogenesis of cotton (Gossypium hirsutum L.) // Int. J. Radiat. Biol., 2014. - Vol. 90, No. 12. - P. 1229-1239. DOI: 10.3109/09553002.2014.923589.
Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics, 1978. - Vol. 89. - P. 583-590.
Otto F. DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA // Method Cell, 1990. -Vol. 33. - P. 105-110.
Peakall R., Smouse P. E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research an update // Bioinformatics, 2012. - Vol. 28. - P. 2537-2539. DOI: 10.1093/bioinformatics/bts460.
Pfosser M., Amon A., Lelley T., Heberle-Bors E. Evaluation of sensitivity of flow cytometry in detecting aneu-ploidy in wheat using disomic and ditelosomic wheat-rye addition lines // Cytometry, 1995. - Vol. 21, No. 4. - P. 387-393. DOI: 10.1002/cyto.990210412.
Sarasan V., Cripps R., Ramsay M., Atherton C., McMichen M., Prendergast G., Rowntree J. K. Conservation in vitro of threatened plants—progress in the past decade // In Vitro Cell Dev-Pl, 2006. - Vol. 42, No. 3. - P. 206-214. DOI: 10.1079/IVP2006769.
Sivanesan I., Lim Y. M., Jeong B. R. Micropropagation and greenhouse cultivation of Scrophularia takesimensis Nakai, a rare endemic medicinal plant // Pak. J. Bot., 2012. - Vol. 44, No. 5. - P. 1657-1662.
Skaptsov M. V., Kutsev M. G. Effect of 24-epibrassinolide on duration of sorrel (Rumex acetosa L.) cultivation in vitro // TSU J. Biol., 2013. - Vol. 22, No. 2. - P. 52-56 [In Russian]. (СкапцовМ. В., Куцев М. Г. Влияние 24-эпи-брассинолида на продолжительность культивирования щавеля (Rumex acetosa L.) in vitro // Вестник Томского гос. ун-та. Биология, 2013. - Т. 22, № 2. - С. 52-56).
Skaptsov M. V., Smirnov S. V., Kutsev M. G. Nuclear DNA content in some plant kinds used as an external standard in flow cytometry // Turczaninowia, 2014. - Vol. 17, No. 3. - P. 72-78 [In Russian]. (СкапцовМ. В., Смирнов С. В., Куцев М. Г. Содержание ядерной ДНК в некоторых сортах растений, используемых в качестве внешних стандартов в проточной цитометрии // Turczaninowia, 2014. - Т. 17, № 3. - С. 72-78). DOI: 10.14258/turcza-ninowia.17.3.8.
Sun S., Zhong J., Li S., Wang X. Tissue culture-induced somaclonal variation of decreased pollen viability in to-renia (Toreniafournieri Lind.) // Botanical Studies, 2013. - Vol. 54, No. 36. - P. 1-7. DOI:10.1186/1999-3110-54-36.
Tanaka R. On the speciation of karyotype in diploid and tetraploid species of Chrysanthemum boreale (2n = 18) // Journal of Science of Hiroshima University Series B, Division 2, 1959. - Vol. 9. - P. 1-16.
Waldron J., Peace C. P., Searle I. R., Furtado A., Wade N., Findlay I., Gaham M. W, Carroll B. J. Randomly Amplified DNA Fingerprinting: a culmination of DNA marker technologies based on arbitrarily-primed PCR amplification // J. Biomed. Biotechnol., 2002. - Vol. 3. - P. 141-150. DOI: 10.1155/S1110724302206026.
