CC BY
78УДК 57.085:634.73:547-314
ИЗМЕНЧИВОСТЬ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПРИЗНАКОВ У РЕГЕНЕРАНТОВ VACCINIUM CORYMBOSUM L. IN VITRO НА СРЕДАХ РАЗНОГО ГОРМОНАЛЬНОГО СОСТАВА
O.A. КУДРЯШОВА, Л. С. ЦВИРКО, A.A. ВОЛОТОВИЧ
Полесский государственный университет, г. Пинск, Республика Беларусь
Введение. Голубика высокая (Vaccinium corymbosum L.) - перспективный вид для промышленного культивирования в условиях Республики Беларусь, особенно в южной агроклиматической зоне страны [1].
Клональное микроразмножение видов рода Vaccinium L. рассматривается как один из основных промежуточных этапов современной технологии ускоренного производства качественного посадочного материала в промышленных объемах [2, 3].
Известно, что процесс клонального микроразмножения растений in vitro начинается с этапа введения растений в культуру in vitro путем изолирования и стерилизации первичного экспланта с последующим его размещением на стерильной, питательной среде для инициации побегообразования in vitro. Завершающим этапом клонального микроразмножения растений in vitro является их укоренение на специфических по фитогормональному составу питательных средах, стимулирующих формирование корней у регенерантов in vitro [3].
В настоящей статье приведены результаты и анализ изменчивости биопродукционных параметров, в том числе процент укорененных регенерантов сорта Northland голубики высокой, размножаемых in vitro на различающихся по фитогормональному составу питательных, агаризован-ных средах. Обсуждаются эффекты спектра концентраций индолилмасляной кислоты, индолилук-сусной кислоты и ее комбинации с 24-эпибрассинолидом на изменчивость количественных признаков.
Материалы и методы исследования. Исследования проводили на базе биотехнологической лаборатории НИЛ клеточных технологий в растениеводстве УО «Полесский государственный университет» в мае-июне 2011 года.
В качестве объекта исследований использовали размножаемые in vitro регенераты (экспланты) сорта Northland голубики высокой V. corymbosum L. в количестве не менее 40 регенерантов для каждого варианта опыта, в трехкратной повторности.
Регенераты получали в результате культивирования эксплантов (состоящих из трех метаме-ров) в колбах конических (объемом по 100 мл) с 25 мл стерильной агаризованной, питательной среды на S микро-, макро- солевой основе WPM [4], содержащей фитогормоны, в соответствии с приведенными ниже вариантами опыта:
1. 1,0 мг/л индолилуксусной кислоты (ИУК);
2. 0,5 мг/л ИУК;
3. 0,2 мг/л ИУК;
4. 1,0 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК);
5. 0,5 мг/л ИМК;
6. 0,2 мг/л ИМК;
7. 1,0 мг/л ИУК, совместно с 1,0 мг/л 24-эпибрассинолида (ЭБ);
8. 0,5 мг/л ИУК, совместно с 0,5 мг/л ЭБ;
9. 0,2 мг/л ИУК, совместно с 0,2 мг/л ЭБ.
Учет анализируемых признаков - высота регенерантов, длина третьего междоузлия, количество листьев, длина корней, сырой вес регенерантов, процент укорененных регенерантов (укореняе-мость) - проводили через 8 недель культивирования на стеллажах световой установки культу-рального помещения биотехнологической лаборатории при температуре +25 °С, фото периоде день/ночь - 16ч/8ч, освещенности 6000 лк, относительной влажности воздуха 70%.
Общий математический анализ данных проводили по стандартным методам вариационной статистики [5], с использованием программы статистического анализа данных STATISTICA 6.0 [6]. Двухфакторный дисперсионный анализ данных и расчет доли влияния факторов на изменчивость исследуемых признаков проводили в программе статистического анализа AB-Stat 1.0, разработанной в Институте генетики и цитологии HAH Беларуси [7].
Результаты и их обсуждение. В таблице 1 приведены результаты изменчивости анализируемых количественных признаков у регенерантов сорта Northland in vitro. Выделены значения, достоверно (при Р<0,05 и /"<0,01) превышающие наименьший показатель по каждому анализируемому признаку в ряду вариантов опыта.
Анализ высоты регенерантов указывает на то, что присутствие в составе питательной среды 24-эпибрассинолида (в комбинации с ИУК, варианты 7-9) приводит к существенному и достоверному (при /"<0,01) увеличению показателей признака в 1,2-1,7 раза, по сравнению с показателями признака на питательных средах с ИУК или ИМК. Причем высота регенерантов увеличивается прямо пропорционально повышению концентрации 24-эпибрассинолида. В то же самое время на среде с ИМК прослеживается обратно пропорциональная зависимость высоты регенерантов от концентрации фитогормона. А на среде с ИУК высота регенерантов вначале увеличивается с повышением концентрации фитогормона до 0,5 мг/л, но при дальнейшем повышении концентрации ИУК происходит уменьшение высоты регенерантов (табл. 1).
Аналогично анализируемому признаку высота растений в присутствии в составе питательной среды 24-эпибрассинолида (в комбинации с ИУК, варианты 7-9) происходит существенное, достоверное (при /"<0,01) увеличение показателей количества листьев и сырого веса регенерантов, в среднем (в зависимости от концентрации) в 1,4 (1,3-1,5) и в 1,7 (1,3-2,1) раза соответственно. При этом сохраняется закономерность прямо пропорционального увеличения значения признака с ростом концентрации ЭБ в составе питательной среды. Сохраняются те же закономерности изменчивости количества листьев и сырого веса регенерантов на средах с ИМК и ИУК в разных концентрациях (варианты 1-6). А именно на среде с ИМК прослеживается обратно пропорциональная зависимость величины признака от концентрации фитогормона. На среде с ИУК величина признака вначале увеличивается с повышением концентрации фитогормона до 0,5 мг/л, но при дальнейшем повышении концентрации ИУК происходит уменьшение величины признака (табл. 1).
В пределах варианта опыта наиболее стабильным признаком была длина третьего междоузлия у регенерантов. Анализ изменчивости данного признака на средах разного гормонального состава и с разной концентрацией фитогормонов указывает на то, что в присутствии в составе питательной среды 0,2 и 0,5 мг/л 24-эпибрассинолида (в комбинации с ИУК, варианты 8, 9) происходит существенное, достоверное (при /"<0,01) уменьшение длины третьего междоузлия у регенерантов (табл. 1). Сопоставив данные по изменчивости признаков высота растений, количество листьев и сырой вес регенерантов с данными по признаку длина третьего междоузлия, можно заключить, что побеги регенерантов, сформированных на среде с 24-эпибрассинолидом, имеют больше междоузлий. Данный эффект увеличения количества междоузлий при сокращении их длины в присутствии брассиностероидов отмечался в ранних работах по изучению их действия на биопродукционные параметры как у двудольных, так и у однодольных растений [8].
Используемые в нашем исследовании фитогормоны - ИМК и ИУК - обладают четко выраженным эффектом, проявляющимся в стимулировании формирования корней у растений, в том числе у регенерантов in vitro. В традиционных по составу питательных средах для укоренения регенерантов голубики высокой in vitro применяется 1,0 мг/ ИМК [3, 9]. Результаты наших исследований, приведенные в таблице 1, указывают на то, что для укоренения регенерантов сорта Нортланд голубики высокой целесообразнее использовать ИУК (в концентрациях 0,2 и 0,5 мг/л), либо ИМК в низких концентрациях (0,2 мг/л).
В присутствии ЭБ формирование корней у регенерантов прекращалось. Установлена также закономерность снижения частоты формирования корней у регенерантов in vitro, при повышении концентрации 24-эпибрассинолида в составе среды. Так, наиболее высокий показатель укореняе-мости регенерантов в присутствии ЭБ зафиксирован в варианте 9, при концентрации ЭБ 0,2 мг/л, в сочетании с 0,2 мг/л ИУК (табл. 1).
Исключительно короткими корнями обладали регенераты на питательных средах с ЭБ (табл. 1). Причем прослеживается тенденция к удлинению корней с уменьшением концентрации ЭБ в составе питательной среды. Наиболее длинные корни формировались у регенерантов на средах с ИУК и ИМК в концентрациях 0,5 и 1,0 мг/л (варианты 1, 2, 4, 5).
В таблице 2 приведены результаты дисперсионного анализа. Установлено, что фактор «фитогормоны и их комбинации» оказывает высоко достоверное (при /"<0,01) влияние на изменчивость всех анализируемых признаков. При этом доля влияния фактора на изменчивость длины корней, сырого веса и укореняемости регенерантов достигает значений 69,6-75,6% соответственно.
Таблица 1 - Изменчивость количественных признаков у регенерантов сорта Northland голубики высокой in vitro
Фитогормон (в том числе комбинации) Концентрация, мг/л BP, см ДлЗМ, см КЛ, шт. ДК, см СВР, г УКР, %
ИУК 1,0 2,44±0,25 0,43±0,05* 5,69±0,08 1,07±0,12** 0,015±0,001 43±3**
0,5 3,14±0,18* 0,44±0,01 * * 7,49±0,17** 1,07±0,16** 0,019±0,001 50±7**
0,2 2,78±0,25 0,38±0,02 7,33±0,55** 0,67±0,08** 0,018±0,001 45±3**
ИМК 1,0 2,25±0,08 0,43±0,03* 6,23±0,26 1,10±0,17** 0,016±0,001 39±5**
0,5 2,43±0,04 0,44±0,01 * * 5,93±0,34 1,11±0,09** 0,017±0,001 32±2**
0,2 3,14±0,36* 0,43±0,03* 7,68±0,18** 0,45±0,02* 0,019±0,001 60±3 * *
ЭБ+ИУК 1,0 3,88±0,28** 0,43±0,01 * 7,98±0,52** о,ю±о,оз 0,032±0,003** 3±1
0,5 3,43±0,17** 0,32±0,03 7,52±0,11** 0,11±0,01 0,028±0,001 * * 12±1
0,2 3,35±0,19** 0,32±0,02 7,34±0,59** 0,13±0,01 0,024±0,001 * * 17±1*
НСР0,05 (по факторам) 0,41 0,05 0,62 0,17 0,003 6
HCPo.oi (по факторам) 0,56 0,07 0,85 0,23 0,004 8
НСР0,05 (частные средние) 0,70 0,08 1,07 0,29 0,005 11
HCPq oi (частные средние) 0,97 0,11 1,47 0,40 0,007 15
Примечание - Данные представлены как среднее арифметическое ± стандартная ошибка средней; * - значимо при ¡'<0.05: ** - значимо при ¡'<0.01: BP - высота растений; ДлЗМ - длина третьего междоузлия: КЛ - количество листьев; ДК - длина корней; СВР - сырой вес регенерантов; УКР - укореняемость регенерантов in vitro; то же для таблицы 2
Таблица 2 - Двухфакторный дисперсионный анализ изменчивости количественных признаков у регенерантов сорта Northland голубики высокой in vitro
ИВ ф BP ДлЗМ КЛ ДК СВР УКР
СК ДВ,% СК дв,% СК дв,% СК дв,% СК дв,% СК ДВ,%
Общее 26 0,374 - 0,004 - 0,919 - 0,212 - 0,000 - 360,648 -
Фактор А 2 2,273** 46,7 0,015** 29,9 2,476** 20,7 1,918** 69,6 0,001** 72,0 3544,676** 75,6
Фактор В 2 0,126 2,6 0,007 14,2 1,512* 12,6 0,354** 12,8 0,000 0,2 357,176** 7,6
АхВ 4 0,571* 23,5 0,004 17,4 2,205** 36,9 0,116* 8,4 0,001* 14,3 230,787** 9,8
Повторности 2 0,005 0,1 0,001 2,0 0,508 4,3 0,027 1,0 0,000 0,3 21,065 0,5
Случайные отклонения 16 0,165 27,1 0,002 36,5 0,380 25,5 0,028 8,2 0,000 13,2 37,992 6,5
Примечание - Прочерк «-» означает отсутствие данных; ИВ - источник варьирования; СК - средний квадрат; ДВ - доля влияния фактора; фактор А -фитогормоны и их комбинации (ИУК, ИМК, ЭБ+ИУК); фактор В - концентрации фитогормонов (0,2; 0,5; 1,0 мг/л питательной среды на основе \¥РМ)
Концентрация фитогормона, как фактор, оказывала достоверное (при Р<0,05 и /"<0,01) влияние на изменчивость длины корней, количества листьев у регенерантов, а также на изменчивость уко-реняемости регенерантов in vitro (табл. 2).
Комбинация двух исследуемых факторов оказывала достоверное (чаще, при /'<0.05) влияние на изменчивость всех анализируемых признаков, за исключением длины третьего междоузлия у регенерантов (табл. 2).
Выводы. Установлено, что присутствие в составе питательной среды 24-эпибрассинолида (в комбинации с ИУК) приводит к существенному и достоверному (при /"<0,01) увеличению показателей высоты регенерантов в 1,2-1,7 раза, количества листьев - в 1,3-1,5 раза, сырого веса регенерантов - в 1,3-2,1 раза. При этом величина признака находится в прямо пропорциональной зависимости от концентрации 24-эпибрассинолида. Установлено, что в присутствии 24-эпибрассинолида наблюдается увеличение количества междоузлий, но уменьшается их длина.
На питательных средах с ИМК наблюдается обратно пропорциональная зависимость показателей высоты регенерантов, количества листьев и сырого веса регенерантов от концентрации фитогормона.
На питательных средах с ИУК, при повышении концентрации фитогормона до 0,5 мг/л, показатели всех исследуемых признаков увеличиваются, при дальнейшем повышении концентрации ИУК до 1,0 мг/л - уменьшаются.
Наиболее высокие показатели укореняемости регенерантов сорта Northland голубики высокой in vitro получены на питательных средах с 0,2 мг/л ИМК (60%); 0,5 мг/л ИУК (50%) и 0,2 мг/л ИУК (45%).
Установлено, что в присутствии 24-эпибрассинолида формирование корней у регенерантов прекращается. При этом наблюдалась закономерность снижения частоты формирования корней у регенерантов in vitro при повышении концентрации 24-эпибрассинолида в составе питательной среды.
Наиболее длинные корни формировались у регенерантов на питательных средах с ИУК, либо ИМК в концентрациях 0,5 и 1,0 мг/л.
Установлено, что различающиеся по фитогормональному составу питательные среды оказывают высоко достоверное (при /"<0,01) влияние на изменчивость всех анализируемых признаков. Комбинация двух исследуемых факторов - фитогормон и его концентрация - оказывала достоверное (чаще, при /'<0.05) влияние на изменчивость всех анализируемых признаков, за исключением длины третьего междоузлия у регенерантов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Рупасова, Ж.А. Голубика высокорослая: оценка адаптационного потенциала при интродукции в условиях Беларуси / Ж.А. Рупасова. - Минск : Белорус, наука, 2007. - 442 с.
2. Волотович, A.A. Результаты деятельности НИЛ клеточных технологий в растениеводстве УО "Полесский государственный университет" как модель развития прикладной биотехнологии на базе ВУЗа : материалы V Мсждунар. науч.-практ. конф. «Устойчивое развитие экономики: состояние, проблемы, перспективы», Пинск, 28-29 апреля 2011 г. / A.A. Волотович . - Пинск, 2011. - Ч. I. - С. 286 - 288.
3. Сидорович, Е.А. Клональное микроразмножение новых плодово-ягодных растений / Е.А. Сидорович, E.H. Кутас. - Минск, 1996. - 246 с.
4. Trigiano, R.N. Plant tissue culture concepts and laboratory exercises / R.N. Trigiano, D.J. Gray. - US/MA, CRC Press LLC., 1999-2000. - 454 p.
5. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов. - М.: Агропромиздат, 1985. - 350 с.
6. Боровиков, В.П. STATISTICA : искусство анализа данных на компьютере / В.П. Боровиков. - Спб : Питер, 2001.-688 с.
7. Аношенко, Б.Ю. Программы анализа и оптимизации селекционного процесса растений / Б.Ю. Ано-шенко // Генетика. - М.: Наука, 1994. - Т.30. - Приложение. - С. 8-9.
8. Khripach, V.A. Brassinosteroids. A new class of plant hormones / V.A. Khripach, V.N. Zhabinskii, A.E. Groot. - San Diego: Academic Press, 1999. - 450 p.
9. Решетников, В.H. Некоторые аспекты микроклонального размножения голубики высокой и брусники обыкновенной / В.Н. Решетников [и др.] // Плодоводство. - 2007. - Т. 19. - С. 209 - 216.
VARIABILITY OF QUANTITATIVE TRAITS AT REGENERANTS OF VACCINIUM CORYMBOSUM L. IN VITRO ON MEDIUM DIFFERENT BY HORMONAL STRUCTURE
O.A. KUDRYASHOVA, L.S. TSVIRKO, A.A. VOLOTOVICH
Summary
There are presented the results of the comparative analysis of variability of six bio-production parameters in vitro at Northland high-bush blueberry régénérants on nutritious medium differing under the maintenance of phytohormones - IAA, IBA, and also 24-epibrassinolide - in concentration of 0.2; 0.5 or 1.0 mg per liter. It is established that the presence of 24-epibrassinolide (combined with IAA) leads to essential increase of height in 1.2-1.7 times, quantities of leaves - in 1.3-1.5 times, weight - in 1,3-2,1 times. Thus the sign size is in directly proportional dependence on concentration of 24-epibrassinolide. It is established that at presence of 24-epibrassinolide formation of roots stops. The highest indicators of rooting percent in vitro are received on nutrient mediums, contained IBA in concentration of 0.2 mg per liter, as well as IAA in concentrations of 0.5 or 0.2 mg per liter. At concentration increase of 24-epibrassinolide the frequency of in vitro root formation decreases. Results of the two-factorial dispersive analysis of phytohormones effects on variability of investigated quantitative traits at régénérants in vitro are discussed.
© Кудряшова O.A., Цвирко JI.C., Волотович A.A.
Поступила e редакцию 11 октября 2011г.
