CC BY
28
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА
Том 151, кн. 4
Естественные науки
2009
УДК 579.23+579.22+579.083.13+575.224.4
ВКЛАД ИНФЕКЦИИ HELICOBACTER PYLORI В ОСТАНОВКУ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА ЭУКАРИОТ
М.О. Аникеенок, О.Н. Ильинская Аннотация
Важная роль инфекции Helicobacter pylori в развитии рака желудка уже не вызывает сомнения, в связи с чем становится все более необходимым изучение влияния этой бактерии на изменение таких важнейших процессов, как репарация, апоптоз и регуляция клеточного цикла в клетке, атакованной патогеном. В настоящей работе проведен анализ активации субстратов АТМ-киназы Chk2 и p53 в эукариотических клетках после инфицирования H. pylori P12. Показана активация белка Chk2 киназой, отличной от АТМ, при инфицировании клеток HeLa и AGS; в то же время активация белка р53, субстрата Chk2, не была обнаружена.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, ATM/ATR - сигнальный каскад, фосфори-лирование, киназа.
Введение
В последние годы была выявлена исключительно важная этиологическая роль Helicobacter pylori в заболевании раком желудка. Инфицируя желудок, эта специфическая бактерия во многих случаях постепенно вызывает формирование начальных предопухолевых изменений слизистой оболочки желудка (метаплазии тонкокишечного типа) [1-6] и резко повышает риск заболевания раком желудка.
Инфекция H. pylori вызывает в качестве ответной реакции организма миграцию полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов из стромы в просвет желудка, что приводит к их тесному контакту с эпителиальными клетками. Их гибель («внеплановый фагоцитоз») сопровождается «оксидативным взрывом» - освобождением и образованием целого спектра свободнорадикальных генотоксиче-ских и канцерогенных соединений [7, 8], к числу которых относятся супероксидный анион (О- ), окись азота (NO), гидроксильные радикалы, пероксинитрит, ионы нитрозония и нитрит - предшественник канцерогенных N-нитрозосоеди-нений.
Таким образом, клетка, атакованная патогеном, подвергается многофакторному воздействию, которое в большинстве случаев исследуется на материале из биоптатов пациентов. Однако влияет ли хеликобактерная инфекция на такие молекулярные процессы, как рекомбинация, репарация, регуляция клеточного цикла в клетке хозяина, неизвестно.
Регуляция клеточного цикла - это сложный многокомпонентный процесс. Одним из путей, который приводит к временной остановке клеточного цикла,
является ATM/ATR - сигнальный каскад. При повреждении ДНК активируются ключевые киназы ATM и ATR, которые фосфорилируют свои субстраты Chkl, Chk2, p53, MDM, NBS1, останавливая клеточный цикл на разных фазах [9-11].
Одним из хорошо изученных компонентов этого каскада является эффек-торная киназа Chk2, которая фосфорилируется с помощью АТМ и останавливает клеточный цикл на уровне Gl, S и, возможно, G2 фаз. В этом процессе участвует белок р53, который является субстратом Chk2, но может фосфорили-роваться разными путями: напрямую АТМ-киназой или активированной р-Chk2 киназой [9]. Фосфорилированная форма р-53 функционирует как транскрипционный фактор для белка р21, который, в свою очередь, ингибирует распад комплекса CDK2-cyclin E, что приводит к «аресту» G1-фазы [10]. Помимо регуляции клеточного цикла Chk2, вероятно, принимает участие и в активации гомологичной рекомбинации при репарации двунитевых разрывов ДНК путем фос-форилирования ключевого белка этого процесса BRCA1 [12].
Исследования in vitro позволяют оценить только влияние бактерии на изменение важнейших внутриклеточных процессов: репарации, апоптоза, регуляции клеточного цикла, за исключением других факторов, участвующих в полноценном иммунном ответе целого макроорганизма на патоген.
Таким образом, целью нашего исследования является анализ активации субстратов АТМ-киназы Chk2 и p53 в эукариотических клетках после инфицирования H. pylori Р12.
1. Материалы и методы
Культуры клеток. В работе были использованы две стабильные линии опухолевых клеток человека: HeLa (карцинома эндометрия) и AGS (ATCC CRL 1739 аденокарцинома желудка) (коллекция Института Макса Планка, г. Берлин, Германия). Клетки культивировали в 6-луночных плашках со средой RPMI 1640 (Invitrogen, Германия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biochrom, Германия), в атмосфере 5% CO2 при 37 °С. За 18 ч до инфицирования среду отбирали и добавляли новую, не содержащую сыворотку.
Штаммы. Клетки инфицировали штаммом H. pyori P12 cag+, vac+, выделенным из биоптата пациента с язвой двенадцатиперстной кишки [13]. Бактерии выращивали при 37 °С на L-агаре, содержащим ванкомицин (10 мкг/мл), в анаэробных условиях в атмосфере смеси газов Campynogen 5% О2, 10% CO2 и 85% N2 (Oxoid, Германия). Перед инфицированием бактерии инкубировали 18 ч в жидкой питательной среде BHI, содержащей антибиотики ванкомицин (10 мкг/мл), триметоприм (1.25 мкг/мл) и нистатин (1 мкг/мл). Бактерии ресус-пендировали в PBS (Invitrogen) и добавили к клеткам HeLa и AGS с различной концентрацией.
АТМ-киназу активировали доксорубицином (1 мкМ, 4 ч) в среде RPMI [14] и гидроксимочевиной (2 млМ, 2 ч) [15]. Для ингибирования АТМ-киназы использовали ATM/ATR-ингибитор (Calbiochem), обрабатывая клетки HeLa (2.5 мкг/мл) и AGS (0.7 мкг/мл) за 18 ч до инфицирования [16].
Электрофорез. Для приготовления клеточных лизатов клетки лизировали в буфере, содержащим (%): додецилсульфат натрия (SDS)-3, ß-меркаптоэтанол-3, глицерин-20, бромфеноловый синий 0.05% и 5 мМ дитиотриэтол. Лизаты нагре-
вали до 95 °С на водяной бане в течение 20 мин, центрифугировали 1 мин при 12 000 об/мин. Белки разделяли в 10% ПААГ в модификации Лаемли [17]. Для определения молекулярной массы белков использовали маркер (New England Biolabs). Электроперенос белков на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану (Poly Screen NEF 1002) проводили в камере для полусухого переноса (Biometra) с использованием буфера, содержащего 20% метанола, 0.02% SDS, 25 мМ Трис-HCl и 192 мМ глицина.
Иммуноблотинг. Мембрану с иммобилизованными белками инкубировали в буфере TBS-T (140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 25 мМ Трис-HCl, 1% Tween20), содержащем 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 1 ч, а затем c первичными антителами, разведенными в TBS-T, содержащем 3% БСА, в течение 1 ч. Мембраны отмывали 45 мин в растворе TBS-T и инкубировали с вторичными антителами, разведенными в TBS-T, содержащем 3% БСА, после чего отмывали тем же способом. Применяли вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Выявление пероксидазной активности проводили методом усиленной хемилюминесценции Western light Kit, используя фильмы Hyperfilm ECL (Amersham Bioscience). Для определения количества нанесенного белка проводили повторный иммуноблотинг с антителами против ß-актина. Перед этим мембраны отмывали от предыдущих антител инкубированием в течении 15 мин при 50 °С в буфере, содержащем 31.25 мл 1 M Tris-HCl, 4 мл ß-меркаптоэтанола, 50 мл 20% SDS, 500 мл H2O.
Антитела. В работе использовали кроличьи поликлоальные антитела против белков Phospho-(Ser/Thr) ATM/ATR Substrate Antibody, p-Chk-2, p-p53 (Cell Signaling Technology), ß-актин (Sigma), также вторичные антитела HRP a-mouse и HRP a-rabbit (Amersham).
2. Результаты и обсуждение
Клеточным ответом на повреждение геномного материала является запуск определенных сигнальных путей, ведущих как к репарационным процессам, так и к остановке клеточного цикла поврежденных клеток. Одним из таких каскадов является ATM/ATR-путь, инициация которого происходит в результате двунитевых разрывов ДНК [10, 11]. В этом пути нас интересовала активация ключевой киназы Chk2 и белка р53 в клетках, инфицированных H. pylori.
Прежде всего мы показали, что при инфицировании штаммом H. pylori Р12 в клетках AGS и HeLa происходит активация ряда субстратов АТМ, которые скорее всего являются компонентами ATM/ATR-зависимого пути (рис. 1).
Для этого мы использовали антитело против широкого спектра фосфори-лированных субстратов АТМ, узнающее их по известному мотиву S*/T*Q [18]. Наибольшая степень фосфорилирования наблюдалась для разных субстратов в разное время. Интересно, что белок с примерной молекулярной массой 62 кДа, предположительно Chk2, был максимально активирован после шестичасового инфицирования, но не после обработки известным индуктором АТМ - гидро-ксимочевиной. В то же время белок с молекулярной массой 56 кДа, возможно Chk1, обладал более высоким уровнем фосфорилирования после 90 мин инфицирования, сравнимым с уровнем после обработки ГМ. Необходимо также отметить, что мы наблюдали небольшое количество данного белка в фосфорилиро-
кДа 83
62 — 48 —
к 1 2 3 4 ГМ
Рис. 1. Содержание фосфорилированных субстратов АТМ в клетках AGS после инфицирования H. pylori P12 в концентрации 100 бактерий на клетку. Дорожки: к - клетки без обработки бактериями; ГМ - клетки, обработанные гидроксимочевиной; 1-4 -клетки через 30 мин, 90 мин, 3 ч и 6 ч инфицирования соответственно
а)
p-Chk2
к 1 2 3 3* д к 1 2 3 3* д
Рис. 2. Содержание фосфорилированной формы Chk 2 в клетках AGS (а) и HeLa (б) после инфицирования H. pylori Р12 в концентрации 100 бактерий на клетку. Дорожки: к - клетки без обработки бактериями; д - обработка доксорубицином (1мкМ); * - обработка ATM/ATR ингибитором; 1-3 - клетки через 30 мин, 90 мин, 3 ч и 6 ч инфицирования соответственно
ванной форме и в интактных клетках, однако его количество заметно увеличилось после инфицирования.
Для подтверждения наших предположений об активации конкретных белков мы провели иммуноблотинг с антителами против p-Chk2 и p-p53.
Было обнаружено фосфорилирование белка Chk2 сразу после 90 мин инфицирования клеток AGS (рис. 2, а), которое увеличивалось после 3 и 6 ч инфекции.
Для доказательства активации Chk2 именно АТМ-киназой дополнительно клетки обработали ингибитором АТМ в варианте с шестичасовой инфекцией. Однако ингибирование фосфорилирования не произошло, более того, появилась новая полоса в непосредственной близости от маркера с молекулярной массой 62 кДа, что свидетельствует об участии другой киназы в активации Chk2, помимо АТМ. При этом обработка доксорубицином, классическим активатором АТМ [20], приводила к высокому уровню фосфорилирования Chk2. Таким образом, активация Chk2, субстрата АТМ, осуществляется иной кина-зой, отличной от АТМ и ATR.
Аналогичная динамика активации происходила и в клетках HeLa (рис. 2, б) в тех же условиях.
а)
6)
p-Chk2
ß
1
2
1
2
к
к
к
к
Рис. 3. Содержание фосфорилированной формы Chk 2 в клетках AGS (а) и HeLa (б) после инфицирования H. pylori Р12 в концентрации 100 бактерий на клетку. Дорожки: к - клетки без обработки бактериями; 1-2 - клетки через 6 и 24 ч инфицирования соответственно
p-p53
ß-актин
к 1 2 3 3* д
Рис. 4. Содержание фосфорилированной формы р53 в клетках HeLa после инфицирования H. pylori Р12 в концентрации 100 бактерий на клетку. Дорожки: к - клетки без обработки бактериями; д - обработка доксорубицином (1мкМ); * - обработка ATM/ATR ингибитором; 1-3 - клетки через 30 мин, 90 мин, 3 ч и 6 ч инфицирования соответственно
H. pylori P12
Апоптоз
G2
G1
Рекомбинационная репарация ДНК
Рис. 5. Роль Chk2 киназы, активируемой инфекцией H. pylori, в остановке клеточного цикла. ^ - активация ; -j - блокирование; * - фосфорилированная форма; 1 - неизвестная киназа, фосфорилирующая Chk2; 2 - Chk2 не фосфорилирует р53 при инфицировании H. pylori
При длительном инфицировании обеих клеточных линий наблюдается активация Chk2 и после 24 ч в клетках AGS (рис. 3, а).
При этом в контроле (инкубирование 24 ч в среде RPMI без эмбриональной телячьей сыворотки) также наблюдалось фосфорилирование Chk2 по сравне-
нию с контрольными клетками шестичасовой культуры. Мы связываем появление активированной формы данной киназы в контрольном варианте с отсутствием ростовых факторов и питательных веществ, содержащихся в эмбриональной телячьей сыворотки, что приводит к остановке клеточного цикла, в котором непосредственно принимает участие p-Chk2, у большей части клеток. Та же картина наблюдалась и в клетках HeLa (рис. 3, б).
Проверка активации р53, как одного из субстратов АТМ-киназы, показала, что H. pylori не вызывает изменение в уровне фосфорилирования р53 (рис. 4).
Полученные нами данные существенно расширяют представление об инициирующем влиянии инфекции H. pylori на сигнальные пути клеток эукариот. Нами впервые установлена активация хеликобактером киназы Chk2, ключевого регулятора клеточного цикла эукариот, но одновременно показано, что активация белка р53 вышеуказанной киназой не происходит (рис. 5).
Summary
M.O. Anikeenok, O.N. Ilinskaya. Contribution of Helicobacter pylori Infection to Eukaryotic Cell-Cycle Arrest.
Helicobacter pylori infection plays an important role in the development of gastric adenocarcinoma in humans. Therefore, it is necessary to investigate reparation, apoptosis and cell-cycle regulation in the pathogen-affected cells. The article regards the activation of ATM-kinase substrates Chk2 and p53 in eukaryotic cells after infection with H. pylori P12. It is stated that infection leads to phosphorylation of Chk2 by the kinase, different from ATM in HeLa and AGS cells. At the same time, activation of p53, one of the substrates of Chk2, is not detected.
Key words: Helicobacter pylori, ATM/ATR - signaling pathway, phosphorylation, kinase.
Литература
1. Correa P. Human gastric carcinogenesis: a multistep and multifactorial process // Cancer Res. - 1992. -V. 52, No 24. - P. 6735-6740.
2. Crespi M, Citarda F. Helicobacter pylori and gastric cancer: an overrated risk? // Scand. J. Gastroenterol. -1996. -V. 31, No 11. - P. 1041-1046.
3. Hill M.J. Screening for colon cancer // Europ. J. Cancer Prev. - 1994. - V. 3, No 6. -P. 455-456.
4. IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans // Schistosomes, Liver Flukesand Helicobacter pylori. - Lyon, France, 1994. -V. 61. - P. 177240.
5. Koster E.D., Buset M., Fernandes E., Deltenre M. The diagnosis of Helicobacter pylori in gastric preneoplastic and neoplastic lesions // Europ. J. Cancer Prev. - 1994. - V. 3, No 2. - P. 61-64.
6. Reed P.I. Helicobacter pylori and gastric cancer // Europ. J. Cancer Prev. - 1996. - V. 5, No 2. - P. 49-55.
7. Correa P. The gastric microenvironment determines Helicobacter pylori colonization // Am. J. Surg. Pathol. - 1995. - V. 90, No 9. - P. 1379-1381.
8. MannickE.E., Bravo L.E., Zarama G., Reaple J.L., ZhangX.-J., Ruiz B., Fontham E.T.H., Mera R., Miller M.J.S., Correa P. Inducible nitric oxide synthase, nitrotyrosine, and
apoptosis in Helicobacter pylori gastritis: effect of antibiotics and antioxidants // Cancer Res. - 1996. - V. 56, No 14. - P. 3238-3243.
9. Kastan M.B., Lib D.S. The many substrates and functions of ATM // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2000. - V. 1, No 3. - P. 179-186.
10. Elledge S.J. Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis // Science. - 1996. -V. 274, No 5293. - P. 1664-1672.
11. Shiloh Y. ATM and related protein kinases: safeguarding genome integrity // Nat. Rev. Cancer. - 2000. - V. 3, No 3. - P. 155-168.
12. Cortez D., Wang Y., Qin J., Elledge S.J. Requirement of ATM-dependent phosphorylation of brca1 in the DNA damage response to double-strand breaks // Science. - 1996. -V. 286, No 5442. - P. 1162-1166.
13. Schmitt W., Haas R. Genetic analysis of the Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin: structural similarities with the IgA protease type of exported protein // Mol. Microbiol. -1994. - V. 12, No 2. - P. 307-319.
14. Kurz E. U, Douglas P., Miller L. Doxorubicin activates ATM-dependent phosphorylation of multiple downstream targets in part through the generation of reactive oxygen species // J. Biol. Chem. - 2004. - V. 279, No 51. - P. 53272-53281.
15. Stiff T., Walker S., Cerosaletti K., Goodarzi A., Petermann E., Concannon P., DriscollM., Jeggo P. ATR-dependent phosphorylation and activation of ATM in response to UV treatment or replication fork stalling // The EMBO Journal. - 2006. - V. 25, No 24. -P. 5775-5782.
16. Won J., Kim M, Kim N, Ahn J.H., Lee W.G., Kim S.S., Chang K.Y., Yi Y.W., Kim Т.К. Small molecule-based reversible reprogramming of cellular lifespan // Nat. Chem. Biol. -2006. - V. 2, No 7. - P. 369-374.
17. Laemmli K. U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.
18. Kim S.T., Lim D.S., Canman C.E., Kastan M.B. Substrate specificities and identification of putative substrates of ATM kinase family members // J. Biol. Chem. - 1999. - V. 274, No 53. - P.37538-37543.
Поступила в редакцию 29.01.09
Аникеенок Марина Олеговна - аспирант кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
E-mail: [email protected]
Ильинская Ольга Николаевна - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии Казанского государственного университета. E-mail: [email protected]
