CC BY
54
РАДИОБИОЛОГИЯ И РАДИАЦИОННАЯ МЕДИЦИНА
Г. А. Тряпицына, Н. И. Духовная, С, П. Белоногова, Е. А. Пряхин
ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
РАДИОЧАСТОТНОГО ДИАПАЗОНА ы
НА СОСТОЯНИЕ КРОВЕТВОРНОЙ СИСТЕМЫ У МЫШЕИ
В эксперименте на мышах линии СВА и белых беспородных мышах было проведено изучение реакции кроветворной системы мышей на воздействие электромагнитного излучения радиочастотного диапазона (ЭМИ РЧ).
В настоящее время развитие радиотехники и информационных технологий привело к существенному электромагнитному загрязнению окружающей среды, однако биологические эффекты такого рода воздействий недостаточно ясны. При воздействии различных типов стрессоров одной из самых чувствительных систем является кроветворная система [1; 2].
Целью данного исследования являлось изучение реакции кроветворной системы мышей на воздействие электромагнитного излучения радиочастотного диапазона (ЭМИ РЧ).
Материалы и методы. В исследовании в качестве биологического объекта использовали мышей линии СВА и белых беспородных мышей в возрасте 3 месяцев.
Животных облучали импульсным потоком электромагнитной энергии, моделирующего излучение вЭМ-формата без голосовой модуляции, с несущей частотой 925 МГц, частотной модуляцией 217 Гц и плотностью потока мощностью 1,2 мВт/см2; у-облучение животных проводили на установке ИГУР-1 с мощностью дозы 0,7 Гр/мин. Животных подвергали воздействию ЭМИ РЧ по 10 мин в течение трех дней. Животных контрольных групп подвергали ложному облучению.
При оценке состояния популяции КОЕс методом экзотеста через сутки после последней экспозиции у доноров-мышей СВА выделяли бедренную кость, определяли количество ядросодержащих клеток (ЯСК) в костном мозге и готовили взвесь клеток, которую внутривенно вводили облученным в дозе 6 Гр реципиентам в количестве 105 ядерных клеток в 0,5 мл физиологического раствора [3]. Учет экзоколоний в селезенке производили на 9-е сутки после трансплантации.
Из второй бедренной кости готовили мазок клеток костного мозга, который фиксировали в метаноле 3-5 мин и окрашивали смесью азур-эозина. В препарате анализировали 2000—2500 эритроцитов: подсчитывали количество полихроматофидъных эритроцитов (ПХЭ) и нормальных хроматофильных эритроцитов (ЫХЭ). Затем вычисляли коэффициент отношения ПХЭ/НХЭ.
Исследования с использованием метода эндотеста были выполнены на белых беспородных мышах, которых через 5 часов после последней экспозиции ЭМИ РЧ облучали в дозе 6 Гр. Количество эндоколоний учитывали на 9-е сутки после у-облучения [3].
Достоверность полученных результатов оценивали с использованием ^критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Результаты исследования показали, что в контрольной грутше мышей СВА («ложное облучение») количество ЯСК в костном мозге составило
> ± 1,9 млн/бедро (табл. 1). Воздействие на мышей ЭМИ РЧ в течение трех суток по 10'
мин привело к достоверному увеличению численности ЯСК в костном мозге в 1,6 раза по отношению к контролю.
88 ■
в норме значения коэффициента отношения ПХЭ/НХЭ в костном мозге (показатель, характеризующий процессы созревания клеток в костном мозге) у мышей близки к I. в вашем эксперименте у контрольных животных этот показатель составил 1,3010,05* (табл. 1). При воздействии ЭМИ РЧ выявлено достоверное увеличение доли ПХЭ в костном мозге у мышей СВА и, соответственно, достоверное увеличение коэффициента ПХЭ/ НХЭ в 1,4 раза по отношению к значению показателя в группе ложного облучения.
Таблица 1
Количество ядросодержащих клеток в костном мозге у мышей СВА
и соотношение эритроцитов различной степени зрелости при воздействии ЭМИ РЧ
Экспериментальные группы, п —10 Кол-во ЯСК в костном мозге, млн/бедро Коэффициент отношения ПХЭ/НХЭ
Контроль 20,7 ±1,9 1,30 ±0,05
ЭМИРЧ *32,7 ±2,7 * 1,81 ±0,11
* Достоверные отличия по сравнению с группой контроля, р < 0,05.
При оценке состояния пула стволовых клеток в костном мозге у мышей СВА методом экзотеста в контрольной группе относительное количество КОЕс составляло 5,5 ±
0,6 на ДО5 кариоцитов костного мозга, а абсолютное количество —1148 ± 161 на бедро (табл. 2). Воздействие ЭМИ РЧ на животных не приводило к достоверным изменениям этих показателей.
Таблица 2
Количество КОЕс (экзотест) в костном мозге у мышей СВА
при воздействии ЭМИ РЧ________________________________
Экспериментальные группы, п = 5 Реципиенты, п = 15
Масса селезенки, мг Кол-во КОЕс на 10= ЯСК в костном мозге Абсолютное кол-во КОЕс/бедро
Контроль 30,5 ±1,3 5,5 ± 0,6 1148 161
ЭМИРЧ 32,6 ±0,9 5,1 ± 0,5 1678 ±217
* Достоверные отличия по сравнению с группой контроля, р < 0,05.
Исследования с использованием метода эндотеста, выполненные на белых беспородных мышах» позволили выявить существенное снижение количества эндоколоний в селезенке при воздействии на животных ЭМИ РЧ. Среднее значение подателя в группе у-облученного контроля составило 6,9 ± 1,7, а в группе ЭМИ РЧ 2, - , (та л. ). При этом количество ЛСК в костном мозге (показатель, отражающий состояние процессов репопуляции в костном мозге) на 9-е сутки после острого Умения В дозе 6 Гр в экспериментальной группе не отличалось от показателя в группе у- у
контроля.
Таблица 3
Количество ядросодержащих: клеток в к°стн°м мозгеи КОЕ^нд )
у белых беспородных мышей при воздействии ------------
Контроль, 6 Гб
ЩГрч __________________| ___________
КОЕс, выявляемые с помощью экзотеста и эндотеста, представляют собой различные функциональные группы стволовых Кроветворных клеток [3]. Принято считать, что КОЕс, выявляемые с помощью экзотеста, относят к покоящимся стволовым кроветворным клеткам (на стадии Gp), тогда как КОЕс, выявляемые с помощью эндотеста, являются функционально активными плюрипотентными предшественниками, находящимися на других стадиях клеточного цикла. Таким образом, отличия в реакции стволовых кроветворных клеток, выявляемые методами экзотеста и эндотеста, могут объясняться или отличиями в чувствительности к исследуемым электромагнитным воздействиям различных функциональных групп стволовых клеток, или функциональными изменениями в группе стволовых кроветворных клеток, выявляемыми методом эндотеста (например, ускорение клеточного цикла или повышение доли этих клеток, вовлеченных в дифференцировку).
В результате исследования сделаны выводы о том, что воздействие ЭМИ РЧ с несущей частотой 925 МГц, частотной модуляцией 217 Гц и мощностью потока 1,2 мВт/см2 по 10 мин в течение трех суток приводит к увеличению количества ЯСК в костном мозге мышей, оказывает влияние на процесс созревания эритроцитов в костном мозге, увеличивая количество незрелых форм. Воздействие ЭМИ РЧ в исследуемом режиме не приводит к достоверному изменению количества КОЕс в костном мозге, выявляемых методом экзотеста, но способствует достоверному снижению количества КОЕс, регистрируемых методом эндотеста.
Список литературы
1. Bond, V. P. Mammalian radiation lethality. A disturbance in cellular kinetic / V. P. Bond, Т. M. Fliedner, J. O. Archambeau. N. Y,: Academic Press, 1965.246 p.
2. Van Den Heuvel, R. Haemopoietic cell proliferation in murine bone marrow cells exposed to extreme low frequency (ELF) electromagnetic fields / R. Van Den Heuvel [et al.] //Toxicol in Vitro. 2001. V. 15 (4-5). P. 351-355.
3. Переверзев, А. К. Кроветворные колониеобразующие клетки и физические стресс-факторы/ А, К. Переверзев. Л.: Наука, 1986. 172 с.
О. С. Козионова, О. Г. Площанская, А. В. Аклеев, Ю. Е, Ду&роеа
ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МИНИСАТЕЛЛИТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА КАК МАРКЕРА НЕБЛАГОПРИЯТНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ГЕНОМ
Изучена скорость мутирования по восьми минисателлитным ДНК локусам (В6.7, СЕВ1, СЕВ15, СЕВ25, СЕВЗб, М81, М831 и М832) в половых клетках облученных родительских пар, проживавших в прибрежных селах реки Течи, и контроль-ной группы, необлученных семей. Соотношение полов среди потомков, возраст родителей на момент рождения ребенка, их профессиональная принадлежность и частота курильщиков в сравниваемых группах семей значимо не различались.
В настоящее время важной задачей радиационной генетики является поиск новых экспериментальных подходов к мониторингу радиационно-индуцированных мутаций в человеческой популяции. Одним из подходов к решению данного вопроса может быть исследование мутаций в минисателлитных локусах человека.
90
Минисателлитными повторами называют тандемно повторяющиеся последовательности ДНК с длиной минимальной повторяющейся единицы в 6-100 пн, которая имеет общий размер до 20 ООО пн [5; 6; 10; 12]. Минисателлиты могут быть мономорфными и полиморфными. У последних число повторов в последовательности варьирует между индивидами. В некоторых минисателлитных яокусах человека исследования показали уровень спонтанных мутаций, колеблющийся в пределах 0,5-13 % на гамету [6]. Полиморфные минисателлиты известны также как VNTR (variable number of tandem repeats) — повторы, они являются первыми высокополиморфными маркерами., описанными при генетическом анализе человеческих нарушений [16].
В ранее проведенных исследованиях, посвященных оценке влияния ионизирующих излучений на частоту минисателлитных мутаций, были получены противоречивые результаты. Наряду с работами, показавшими достоверное увеличение частоты миниса-теллитных мутаций в половых клетках облученных людей [9; 11], существуют такие исследования, в которых увеличения частоты мутаций обнаружено не было [13].
Материалы и методы
Характеристика исследованных групп
Данная работа проводилась с целью выявления влияния хронического радиационного воздействия на частоту мутаций в восьми минисателлитных локусах: В6.7, СЕВ1, СЕВ15, СЕВ25, СЕВ 36, MSI, MS31 и MS32.
Исследование проводилось с использованием образцов крови людей, проживавших на территориях, пострадавших в результате деятельности ПО «Маяк». В качестве основной группы выступали семьи, в которых один или оба родителя подвергались хроническому радиационному воздействию вследствие проживания на реке Тече. В качестве группы сравнения выступали семьи, проживающие на незагрязненных территориях тех же административных районов, что и семьи основной группы.
Основная группа была представлена 174 семейными ячейками 92 семьями, в которых было 174 потомка. Контрольная группа состояла из 99 семейных ячеек 49 семей, которые включали 99 потомков. Группы были сопоставимы по национальному составу, возрасту на момент рождения детей, социально-экономическим факторам: образованию, профессиональной занятости, курению и употреблению алкоголя, а также по фактору наличия профессиональных вредностей. u
Для каждого потомка, взятого в исследование, сотрудниками биофизическои лаборатории ФГУН УНПЦ РМ были подсчитаны гонадные дозы родителей на момент зачатия, мощность дозы облучения на момент зачатия, дозы внутриутробного и гостнатального облучения на красный костный мозг и мягкие ткани. Средняя гонадная доза отца составила 69,б±9,0 мГр, средняя доза матери — 71,5±7,6 мГр.
Большинство пренатально облученных потомков подучили на мягкие ткани и р -ный костный мозг дозу менее 1 мГр, и лишь 18 человек — пренатальную дозу °л Только 6 человек получили постнатальную дозу на мягкие Доза на красный костный мозг для большинства постнатальн У составила 1-10 мГр. -
Выделение ДНК и генотипирование образцов ___
, В работе использовался метод выявления мутаций в
Такие мутации приводят к изменению анастроф р ную1е0тидов произош-
С помощью 1-kb маркера можно рассчитать, на скол Р У Ло Уменьшение или увеличение длины аллеля. 91
Выделение ДНК осуществлялось из образцов периферической крови людей по стандартному фенол-хлоро формному методу (модификация Ю. Дуброва) [2,3,4]. Выделенную ДНК растворяли в воде и в последующем хранили при -20 °С.
Электрофорез проводили на 40-сантиметровом 0,8 %-и агарозном геле в течение 36 часов. После электрофореза ДНК переносили на нитроцеллюлозный фильтр и гибриди-зовали с 32Р-мечеными зондами.
Каждый родитель на дорожке электрофоретического геля был представлен двумя аллелями, потомок наследует по одному аллелю от каждого из родителей. О появлении мутации говорили в том случае, если полоса потомка на авторадиограмме находилась иштта или ниже соответствующей родительской полосы.
Результаты
Было обнаружено, что частота мутаций у отцов основной группы значимо выше, чем в группе сравнения. В группе матерей различий между основной группой и группой сравнения не обнаружено, Можно предположить, что в мужских половых клетках мутации возникают чаще, чем в женских. Поскольку не было обнаружено увеличения частоты мутаций в материнских половых клетках, дальнейший их анализ не проводился.
Таблица 1
Количество мутаций и частота мутирования минисателлитных локусов отцовских и материнских половых клеток
Сравниваемые признаки Группа отцов Группа матерей
основная контрольная основная контрольная
Локусы 861 1064 1001 885
Мутации 42 31 6 10
Частота мутаций 0,049* 0,029 0,006 0,011
* р<0,05.
В нашем исследовании показано достоверное увеличение частоты мутирования двух минисателлитных локусов: В6.7 и СЕВ1 (р<0,05). В предыдущих исследованиях [8-10] показана высокая частота мутирования локуса СЕВ1, но для локуса В6.7 достоверного увеличения уровня мутирования обнаружено не было.
Дозовые зависимости В нашем исследовании использовались оценки гонадной дозы отца на момент зачатия ребенка, дозы внутриутробного и постнатального облучения потомка.
Было обнаружено, что не существует статистически значимой зависимости между частотой мутаций и суммарной гонадной дозой облучения отца (рис. 1)
Частота
0,16 0,14
0,12
0,10 0,08
0,06----------
0,04 ■
0,02 — 0
Контроль До 10 '' Ю,0~300,0 ’ >100 0 Гонадная доза облучения, мГр
Рис. 1. Частота мутаций е минисателлитных локусах мужских половых клеток
в дозовьа подгруппах гонадной дозы отца
Внутриутробное облучение могло оказать влияние на результаты исследования, если бы Происходило на начальных этапах эмбрионального развития, когда изменение генотала даже одной клетки способно вызвать изменение генотипа всего формирующегося организма или части его клеток, приводя к мозаицизму. Однако в нашем исследовании не было обнаружено зависимости между частотой возникновения мутаций в мужских подовых клетках и дозами внутриутробного облучения на мягкие ткани и красный костный мозг.
Доза постнатального облучения не могла играть роли в возникновении мутаций, поскольку к этому времени стволовые клетки крови уже были сформированы. В данном случае облучение могло вызвать появление мутации в ограниченном количестве клеток крови, которое не смогло бы оказать влияние на результаты исследования в связи с разрешающей способностью метода.
На рис. 2 показана зависимость частоты минисателлитных мутаций от мощности дозы облучения в год зачатия ребенка. Было показано, что имеется тенденция к повышению частоты мутаций при возрастании мощности дозы, хотя и-тест Манна-Уитни не выявил значимых различий между контролем и основной группой.
Частота
0Д0
0,18
0,16 0,14 0,12 ОД 0 0,08 0,06 0,04 0,02 о
Мощность дозы облучения, мГр/год
Контроль * До 1 1,0-10,0 >10,0
Рис, 2. Частота мутаций в минисателлитных локусах мужских половых клеток в различных дозовых подгруппах мощности дозы облучения отцовских гонад
в год зачатия ребенка
Анализ влияния нерадиационных факторов на частоту мутаций в минисателлитных локусах Известно, что на частоту мутаций могут влиять не только внешние воздействия, но и внутренние факторы. По научным данным, возраст имеет существенное значение для частоты возникновения мутаций. Но в нашем исследовании частота мутаций, возникших в отцовских аллелях, не зависела от возраста отцов на момент зачатия потомков.
Поскольку мутации в минисателлитных локусах не являются специфическими маркерами радиационного облучения и частота этих мутаций может изменяться при любом воздействии на организм, то имело смысл определение частоты минисателлитных мута Ций в зависимости от факторов курения и употребления алкоголя. ^
В проведенном исследовании нами не было обнаружено значимимеется ния на частоту возникновения мутаций в минисателлитных лову а . ^ ^ бшю
тенденция к увеличению частоты мутаций у интенсивно куряш• * воз_
обнаружено статистически значимого влияния употреблен накновения мутаций в минисателлитных локусах человека.
Таким образом, обнаружено увеличение в 1,7 раза частоты мутаций в минисател-литных локусах ДНК мужских половых клеток у облученных лиц по сравнению с контрольной Группой. Не было обнаружено дозовой зависимости частоты мутаций, а также зависимости между частотой мутаций и мощностью дозы облучения.
Не обнаружено влияния факторов нерадиационной природы — возраста отца на момент зачатия ребенка, курения и употребления алкоголя — на частоту возникновения мутаций в минисателлитных локусах ДНК половых клеток человека.
Список литературы
1. Геномика—медицине / под ред. В. И. Иванова, Л. Л. Киселева. М.: Академкнига, 2005.392 с.
2. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. М.: Мир, 1984.421 с.
3. Alien, N. D. Mammalian development: a practical approach / N. D. Alien [et al.]. Oxford : ERL Press, 1987.392 р.
4. Bell, G. I. The highly polymorphic region near the human gene is composed of simple tandemly repeating sequences / G. I. Bell, М. I Serby, W. J. Rutter // Nature. 1982. V. 295. P. 31-35.
5. Bois, P. R. J. Hypermutable minisatellites, a human affair? / R R J. Bois // Genomics. 2003. V. 81 P. 349-355.
6. Bois, P. Minisatellite instability and germline mutation / P. Bois, A. J. Jeffreys 11 Cellular and Molecular Life Sciences. 1999. V. 55, P. 1636-1648.
7. Buard, J. Influences of array size and homogeneity on minisatellite mutation [et al.] / J. Buard // EMBO J. 1998. V. 17. P. 3495-3502.
8. Dubrova, Y. E. Germline mutation induction at mouse and human tandem repeat DNA loci / Y, E. Dubrova // Mutation Research. 2004. V. 544, P. 433-439..
9. Dubrova, Y. E. Long-term genetic effects of radiation exposure / Y, E. Dubrova // Mutation Research. 2004. V. 544. P. 433-439.
10. Dubrova, Y. E. Human minisatellite mutation rate after the Chernobyl accident / Y. E. Dubrova [et al.] // Nature. 1996. V. 380. P. 683-686.
11. Jeffreys, A. J, Minisatellite repeat coding as a digital approach to DNA typing
I A. J. Jeffreys [et al.] //Nature. 1991. V. 354. P. 204-209.
12. Jeffreys, A. J. Complex gene conversion events in germline mutation at human
minisatellites / A. J. Jeffreys [et al.] // Nat. Genet. 1994. V. 6. P. 136-145,
13. Kodaira, M. Lack of effects of atomic-bomb radiation on genetic instability of tandem-repetitive elements in human germ-cells / M. Kodaira [et al] // Am. J. Hum. Genet 1995 V. 57. P. 1275-1283.
14. May, C. A. Minisatellite mutation frequency in human sperm following radiotherapy / C. A. May [et al] // Mutation Research. 2000. V. 453. P. 67-75.
15. May, C. A. Mutation rate heterogeneity and the generation of allele diversity at the human minisatellite MS205 (D16S309) / C. A. May, A. J. Jeffreys, J. A. L. Armour // Hum. Mol Genet. 1996. V. 5. P. 1823-1833.
l6' Ь ^enome~wide Prediction of human VNTRs / K, Naslund [et al.] // Ge-
nomics. 2005. V. 85. P. 24-35.
АДАПТАЦИОННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ЛИЦ, ПОДВЕРГШИХСЯ ХРОНИЧЕСКОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ
При использовании нейтрального варианта метода ДНК-комет оценивалась эффективность репарации ДНК и регуляции апоптоза в лимфоцитах периферической крови у людей, подвергшихся хроническому облучению, а также способность лимфоцитов этих людей формировать адаптивный ответ. В группе облученных по сравнению с контролем отмечена тенденция к снижению уровней всех параметров комет и частоты апоптоза. Как в контроле, так и в опыте не было отмечено достоверных изменений степени фрагментации ДНК в пробах до облучения клеток в дозе 1 Гр, непосредственно после облучения и два часа спустя. Однако в обеих грушах наблюдались отдельные случаи достоверного адаптивного ответа или повышения радиочувствительности в вышеуказанные моменты времени после облучения. Высказано предположение, что в каждом отдельном случае активность защитных систем репарации и регуляции апоптоза различна и зависит от тех или иных индивидуальных особенностей обследованного человека.
В результате загрязнения реки Течи радиоактивными отходами ПО «Маяк» около 30 ООО человек, проживавших в прибрежных селах в 1950-1960 гг., подверглись хроническому радиационному воздействию [1; 2]. Многолетние медицинские и эпидемиологические исследования позволили выявить у этих людей ряд отдаленных последствий облучения, выражающихся в изменении различных гематологических параметров, а также в изменении частоты опухолеобразования [1; 2]. Эти данные особенно актуальны в связи с возросшим в настоящее время интересом к так называемым эффектам малых доз и последствиям хронического низкоинтенсивного воздействия радиации. Открытие таких Эффектов малых доз (ЭМД), как адаптивный ответ (АО) и повышение радиочувствительности (ПЧ) после облучения в малых дозах, эффект свидетеля и нестабильность генома, привели к возникновению новых взглядов на формирование отдаленных эффектов малых доз радиации. Предполагается, что наряду с непосредственным повреждением ДНК в результате воздействия излучения на клетку важную роль в реализации последствий облучения и формирований отдаленных эффектов играет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидантной защиты, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза [3-5]. ™
Одной из важнейших таких систем, участвующих в формировании АО и других о>мд шляется система репарации, и в первую очередь механизмы репарации двунитевых разрывов (ДР) ДНК. Согласно одной из гипотез, именно инициация репарации ДР является ключевым событием в формировании АО [б]. Другая гипотеза решающую Р^ь в формировании АО отводит селективной гибели наиболее радиочувствительных клеток по
механизму апоптоза [7]. ттщ- «петки
Как апоптоз, так и репарация непосредственно опвн с; поврещш 4X0 позволяет использовать для их оценки метод ДНК-ком [ , ]. вания
основании степени фрагментации ДНК оценивалась зффектин! ^ пешфешческ0й кро-
««низмов репарации ДНК и регуляции «ям» опособ^1гЬ лимфоцитов
и У людей, подвергшихся хроническому облучению,
ЭТИх людей формировать АО. 95
Материалы и методика. В ходе эксперимента была обследована группа из 21 человека. Из них 11 составили группу лиц, подвергшихся хроническому облучению, 10 — группу сравнения.
Первая группа была представлена людьми, проживающими в окрестностях реки Течи и имеющими реконструированную дозу облучения красного костного мозга (КЕМ). В состав группы сравнения входили лица, проживающие на близлежащих территориях, не подвергшихся радиоактивному загрязнению и имеющие сходные социальные и медицинские условия с первой группой. Обе группы сопоставимы по национальному составу (преобладало тюркское население) и среднему возрасту (66,4 года—группа облученных и 68,2 года — контрольная группа). Группа облученных состояла из 9 женщин и 2 мужчин, контрольная группа — из 10 женщин. Средняя доза облучения на красный костный мозг для группы облученных людей составляла 1,07 ± 0,22 Гр, при этом минимальная доза— 0,08 Гр, а максимальная — 2,26 Гр.
Используя нейтральный вариант метода ДНК-комет (Comet assay) или гель-электрофореза единичных клеток [8; 9], оценивали степень фрагментации ДНК, а следовательно, и количество двунитевых разрывов ДНК, в лимфоцитах крови.
Критериями оценки состояния ДНК в клетке являлись длина хвоста кометы, доля мигрировавшей ДНК и интегральный показатель — момент хвоста. Анализировалась также частота апоптоза; апоптотическими считались кометы, доля мигрировавшей ДНК в которых превышала 40 %.
Оценивали фоновые уровни данных показателей, уровни в активированных ФГА лимфоцитах непосредственно после облучения клеток in vitro в дозе 1Гр у-излучения (Csl37; мощность дозы — 0,71 Гр/мин), а также спустя 2 и 24 ч после него. В те же интервалы времени анализировали пробы, предварительно, за 4 ч до воздействия дозы в 1 Гр, облученные в дозе 0,05 Гр. Оценивались и исходные уровни фрагментации на первые и вторые сутки инкубации лимфоцитов, а также непосредственно после облучения в дозе
0,05 Гр и спустя 2,4 и 24 ч. Статистическая обработка материала осуществлялась с использованием программы Statistica 6.0, а также пакета статистического анализа MS Excel. Сопоставление средних величин оцениваемых параметров комет производилось по критерию Уилкоксона-Манна. *
Достоверность различий между величинами какого-либо из параметров комет или частотами апоптоза в различные сроки после облучения в дозе 1 Гр в пробах, предварительно облучённых в дозе 0,05 Гр, и пробах, не подвергавшихся такому облучению, служила критерием наличия у человека адаптивного ответа или повышения радиочувствительности. Сопоставление групп по количеству случаев тех или иных типов адаптивных реакций осуществлялось с использованием критерия Пирсона (Хи-квадрат).
Результаты и обсуждение. Было выявлено, что фоновые величины таких параметров, как длина и момент хвоста ДНК-комет, в группе облученных достоверно ниже, чем в контрольной группе. Это хорошо согласуется с достоверно более низкими фоновыми значениями апоптоза у облученных.
Средние значения длины хвоста и момента хвоста спустя 2 ч после облучения в дозе 1 Гр в группе облученных также достоверно ниже аналогичных показателей в контроле. Однако достоверных отличий по частоте апоптоза в тот же период после воздействия дозы 1 Гр не выявлено.
— ' ---Р-1--—^ ^ ХЛ 1А V*
сутки инкубации ни по одному из показателей достоверных отличий между опытом й контролем обнаружено не было.
96
в Группе лиц, подвергшихся Хроническому облучению, уровни показателей непосредственно после облучения лимфоцитов в дозе 1 Гр и через 2 ч после ее воздействия не отличались друг от друга, а также от исходного уровня в первые сутки инкубации клеток. Однако эти уровни достоверно ниже тех, что наблюдаются через 24 ч после облучения в дозе 1 Гр. Кроме того, исходные уровни мигрировавшей ДНК, величины момента хвоста, частота апоптоза, а также уровни этих показателей, наблюдаемые спустя 2 ч после воздействия, 1 Гр у-излучения были достоверно ниже исходных на вторые сутки инкубации. Частота апоптоза на вторые сутки инкубации также была достоверно выше уровня, наблюдавшегося непосредственно после облучения в дозе 1 Гр. При этом ни для одного из показателей в исходной пробе на вторые сутки не было выявлено достоверных отличий от уровня через 24 ч после облучения в дозе 1 Гр. По всей видимости, в случае с лимфоцитами, взятыми из периферической крови людей, подвергшихся хроническому облучению, основное влияние на величины оцениваемых показателей комет на вторые сутки инкубации лимфоцитов независимо от наличия или отсутствия за 24 ч до этого острого облучения в дозе 1 Гр оказывают сами условия инкубации.
Подобное влияние инкубации на оцениваемые показатели для клеток, взятых у лиц контрольной группы, имеет менее выраженный характер. Как и в группе облученных лиц, уровни в первые сутки, а также непосредственно после облучения в дозе 1 Гр и спустя 2 ч после этого не имели достоверных отличий, однако в контроле не наблюдалось отличий между показателями в данных пробах и исходными уровнями на вторые сутки инкубации. Такие отличия имели место лишь при сопоставлении с величинами, наблюдавшимися через 24 ч после облучения в дозе 1 Гр, где все показатели оказались значимо выше, нежели в упомянутых пробах. При этом уровни через сутки после облучения клеток не отличались достоверно от уровней на вторые сутки инкубации.
Оценка параметров комет и частоты апоптоза для клеток, подвергшихся облучению в дозе 0,05 Гр, выявила достоверно более низкие величины длины и момента хвоста по сравнению с контролем непосредственно после облучения, а спустя два часа после воздействия дозы 0,05 Гр достоверно более низкие по сравнению с контролем величины отмечались для всех оцениваемых показателей.
Отличия от контроля наблюдались и после 4 ч инкубации лимфоцитов облученных в дозе 0,05 Гр, и после их повторного облучения в дозе 1 Гр, а также спустя 2 ч после воздействия повторной дозы. Во всех трех случаях у лимфоцитов людей, подвергшихся хроническому облучению, отмечались достоверно меньшие величины длины хвоста комет, а непосредственно после облучения отмечались также достоверно меныний процент мигрировавшей ДНК и более низкая частота апоптоза, нежели в контроле,
в группе лиц, подвергшихся хроническому облучению, было отмечено, что для клеток, предварительно облученных в дозе 0,05 Гр, уровни всех оцениваемых показателей через 24 Ч после облучения в дозе 1 Гр достоверно выше уровней через 4 ч после Облучения в дозе 0,05 Гр, а также уровней непосредственно и через 2 ч после воздействия облучения в дозе 1 Гр. Аналогичная картина наблюдалась и в контрольной группе.
Более высокие уровни по всем показателям по сравнению с ^овнями ч^ез ^ облучения в дозе 0 05 Гр. а также непосредственно после воздействия уч д
.1 ^ отмечались и чер^24 ч после облучения в дозе 0,05 Гр.
№Гр °блУ'аяшя в дозе 1 Гр- **
в контроле, так и в опыте показатели комет всех инкубированных лимфоцитов независимо от наличия или отсутствия дополнительного острого облучения с высокой степенью достоверности отличались от фоновых уровней.
Сравнение средних величин оцениваемых показателей в разные сроки после облучения в дозе 1 Гр в Пробах, подвергавшихся предварительному облучению в дозе 0,05 Гр и не подвергавшихся такому воздействию, не выявило достоверных отличий ни в группе облученных лиц, ни в контрольной группе.
Отдельные случаи адаптивного ответа или повышения радиочувствительности по различным критериям в различные сроки после воздействия разрешающей дозы 1 Гр отмечались в обеих группах. Однако ни по одному из критериев не было выявлено достоверных отличий между частотой случаев данных адаптивных реакций в группе лиц, подвергшихся хроническому облучению, и в контрольной группе в рассмотренные промежутки времени после воздействия разрешающей дозы 1 Гр.
Таким образом, результаты данной работы указывают на наличие достоверно более низких фоновых показателей длины хвоста и момента хвоста в группе облученных по сравнению с контролем. Подобные же отличия по частоте апоптоза позволяют предположить, что именно апоптотические клетки оказывают основное влияние на средние величины фонрвых параметров комет.
Тенденция к сохранению более низких уровней оцениваемых показателей в группе облученных отмечалась во всех пробах по всем параметрам комет и частоте апоптоза. Чаще всего достоверные отличия выявлялись по длине хвоста комет.
Вероятно, на анализируемые параметры оказывают влияние и условия инкубации. На вторые сутки все показатели в обеих группах превышают уровни в первые сутки независимо от наличия или отсутствия дополнительного острого облучения. Следует также отметить, что уровни во всех анализируемых пробах значительно выше фоновых. Здесь, по-видимому, имеет место эффект стимуляции инкубируемых лимфоцитов ФГА.
Как в контроле, так и в опыте не было отмечено достоверных изменений степени фрагментации ДНК в пробах до облучения в дозе 1 Гр, непосредственно после и 2 ч спустя. Это говорит либо об отсутствии ДР в ДНК облученных клеток (что идет вразрез с литературными данными [10; 12]), либо о невозможности зафиксировать их вследствие быстрой репарации. Однако репарация данного типа повреждений требует большого количества времени [10—12]. Можно предположить, что в каждом отдельном случае активность защитных систем репарации и регуляции апоптоза различна и зависит от тех или иных индивидуальных особенностей человека. Об этом свидетельствуют наблюдаемые как в контроле, так и в опыте случаи достоверного адаптивного ответа или повышения радиочувствительности в указанные моменты времени после облучения.
Список литературы
1. Аклеев, А. В. Медико-биологические и экологические последствия радиоактивного загрязнения реки Хеча / А. В. Аклеев, М Ф, Киселев. М.: Медбиоэкстрем, 2001.531 с.
2. Krestinina, L. Yu. Protracted Radiation Exposure and Cancer Mortality in the Techa River Cohort / L. Yu. Krestinina [et aL] // Radiation Research. 2005. Vol. 164. P. 602-611.
3. Пелевина, И. И. Феномен повышения радиочувствительности после облучения лимфоцитов в малых адаптирующих дозах / И. И. Пелевина [и др.] II Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т. 40, № 5. С. 544-548.
4. Аклеев, А. В. Адаптивные способности лимфоцитов крови у жителей Южного рала, подвергшихся хроническому облучению / А. В. Аклеев [и др.] // Радиационная
биология. Радиоэкология. 2004. Т. 44, № 4. С. 426-431.
98
5. Серебряный, А. М. О новом механизме формирования адаптивного ответа
/А. М. Серебряный [и др.] // Радиационная биология. Радиоэкология 2004 Т 44 № 6 С 653-656. ■ > - ■
6. СпитковскнЙ, Д. М. Теоретические и экспериментальные подходы к проблеме индуцируемых адаптирующими дозами ионизирующей радиации изменений функциональных возможностей клеток / Д. М. Спитковский, И. В. Кузьмина // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5, С. 599-605.
7. Бондарчук, И. А. Анализ роли репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза в радиационно-индуцированном адаптивном ответе клеток млекопитающих /И. А. Бондарчук // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43, № 1. С 19-28.
8. Тронов, В. А. Метод ДНК-комет индивидуальных клеток. Принцип и применение метода / В. А. Тронов, И. И. Пелевина // Цитология. 1996. Т. 38, № 4/5. С. 427-439,
9. Тронов, В. А. ДНК-кометы как маркер клеточной гибели / В. А, Тронов [и др.] //Биофизика. 1999. Т. 44, № 2. С. 288-295.
10. Газиев, А. И. Повреждение ДНК в клетках под действием ионизирующей радиации / А. И. Газиев // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39, № 6. С. 175— 183.
И. Шарова, Н. П. Как клетка восстанавливает повреждённую ДНК? / Н. П. Шарова //Биохимия. 2005. Т. 70, вып. 3.
12. Пелевина, И. И. Выживаемость облученных клеток млекопитающих и репарация ДНК / НИ. Пелевина [и др.]. М., 1985.
Е. А. Блинова, Г. А. Веремеева
АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ХРОНИЧЕСКИ ОБЛУЧЁННЫХ ЛЮДЕЙ
На основе анализа литературных данных и результатов собственных исследований рассмотрено влияние хронического облучения человека на апоптоз лимфоцитов периферической крови. Исследованы методом ТХШЕЬ с использованием проточной цитофлуориметрии исходный уровень апоптоза и уровень апоптоза после дополнительной нагрузки (инкубация 24 часа, инкубация 24 часа и о лучение в дозе 1 Гр). Отмечено увеличение исходного уровня апоптоза и уровня апоптоза после 24-часовой инкубации в группе лиц, подвергшихся хроническому ра иацион ному воздействию, по сравнению с контролем.
Апоптоз способствует защите организма от пролиферацш клето^ п
Циально опасные для организма генетические изменения [ 3* бапьерам,
таегся основным событием канцерогенеза, апоптоз можно ошес^ ^ Показано,
поящим на пути канцерогенеза, в частности вероятность развития он-
ч*> хроническое облучение организма человека увеличивает вероятность р
копатологин [2]. ^ спонтанного уровня в изучаемой
Исследование апоптоза предусматривает оценку дополнительных стан-
популяции людей и резервов, которые могут быть выявлены при доп
дартных нагрузках (облучение и производственной деятельности
В районе реки Течи, начиная с 1949 обдуЧения населения в широком
ПО «Маяк» сложились аварийные условия много 99
диапазоне доз [2]. Облучение носило комбинированный характер и включало два компонента; внешнее гамма- и внутреннее облучение, в основном за счет Sr.
В ранние сроки у облученных лиц отмечалось угнетение гемопоэза (лейкопения, ней-трсшбния, тромбоцитопения). В отдаленные сроки выявлено повышение частоты соматических мутаций и хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови [3].
Проведенные нами исследования были направлены на то, чтобы оценить эффективность апоптотических процессов у лиц, подвергшихся хроническому воздействию радиации в ситуации на р. Тече.
Материалы и методы. Принимая во внимание значительную неравномерность распределения доз в различных органах (максимальные дозы приходились на ККМ за счет 9°Sr) [2], а также высокую радиочувствительность кроветворной ткани и выраженность эффектов со стороны гемопоэза, эта система организма относится к критическим в ситуации на р. Тече.
Исследование апоптотической гибели лимфоцитов периферической крови проводилось у 38 жителей прибрежных сел р. Течи, подвергшихся хроническому облучению, хсоторые регулярно обследовались в условиях клинического отделения УНП ЦРМ. Из анализа исключали пациентов, страдающих аутоиммунными эндокринными, инфекционными заболеваниями и имеющих злокачественные новообразования.
Группу облученных лиц составили 8 мужчин (21,1 %) и 30 женщин (79,9 %) со средней кумулятивной дозой облучения красного костного мозга 0,62 Зв (от 0,01 Зв до 1,87 Зв).
Группу сравнения составили 25 человек, в том числе 4 мужчины (16 %) и 21 женщина (84 %), проживающих в сходных социально-экономических условиях. Средний возраст в каждой из обследованных групп составляет 69,1 года. Группы сходны по половому составу, в каждой из них преобладают женщины.
Метод исследования. Объектом исследования являлись лимфоциты периферической крови. Выделенную в стандартных условиях суспензию лимфоцитов (в среде 199 с солями Хенкса) распределяли по трем пробиркам. Лимфоциты из первой пробирки осаждали, затем фиксировали и окрашивали (исходный уровень апоптоза). Лимфоциты во второй пробирке облучали в дозе 1 Гр мощностью 0,011 Гр/сек на установке ИГУР1. Клетки в третьей пробирке не подвергались облучению. Облученные и необлученные лимфоциты инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 °С, после чего клетки в каждой из пробирок фиксировали, пермобилизировали и окрашивали.
Для фиксации клеток использовали 4 %-й раствор параформальдегида на фосфатносолевом буфере (рН=7,4). Пермобилизировали охлажденным на льду 70 %-м этиловым спиртом. Затем производилась окраска по методу TTINF.T. [4].
Подсчет клеток проводился на лазерном (длина волны 488 нм) проточном цитофлу-ориметре (EpixXL-MCL, Beckmancoulter, USA).
Оценивалось содержание (на 10 000 клеток) апоптозных лимфоцитов и лимфоцитов, условно отнесенных к терминальной стадии апоптоза (рис. 1). Из литературных данных известно [1; 4; 5], что уровень апоптотической гибели клеток можно оценивать по процентному содержанию клеток, находящихся в пике subG0/Gl. Дятштлй показатель характеризует количество клеток в терминальной стадии апоптоза.
Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи пакетов прикладных программ Microsoft Excel, Statistica 6.0.
Результаты и обсуждение. В группе хронически облученных людей и в контроле выявлено статистически значимое увеличение апоптозных лимфоцитов после 24-часовой инку ации, а также после инкубации и дополнительного облучения in vitro по сравнению со спонтанным. В контроле также выявлено увеличение апоптоза в лимфоцитах после
-облученные
-контроль
Рис. 1
облучения in vitro по сравнению с лимфоцитами, подвергшимися 24-часовой инкубации Данный факт свидетельствует о значимом влиянии облучения in vitro и инкубации на интенсивность апоптоза.
Сравнение интенсивное-та апоптоза лимфоцитов периферической крови у облученных и необлученных людей позволило выявил., что исходный уровень апоптоза, атаки® интенсивности апоптоза после 24-часовой инкубации в группе облученных достоверно выше по сравнению с контрольной группой (рис. 1). Количество апопто-тических клеток после облучения in vitro в дозе 1 Гр с последующей инкубацией в основной труппе и в груше сравнения статистически неразличимо,
ЙНТеНСИВНОСТЬ ИСХОД- Значение тка Sub G0/G1, %
ного уровня лимфоцитов периферической крови в терминальной стадии апоптоза статистически неразличим по сравнению с контрольной группой (рис. 2).
Количество лимфоцитов у облученных людей в терминальной стадии апоптоза после 24-ча-сс®ой инкубации достоверно ниже по сравнению с контрольной группой, а уровень после дополнительного облучения достоверно выше
по сравнению с контролем.
в Группе хронически облученных людей и в контроле количество клеток, находящихся В терминальной стадии апоптоза, после 24-часовой инкубации и после дополнительного Облучения и инкубации выше по сравнению с исходным уровнем. ^
На основании полученных результатов можно сказать, что наблюда У тпиаШ1_ интенсивности исходного уровня апоптоза у лиц, подвергшихся хрони у р онному воздействию, по сравнению с необлученными людьми, шшей
Повышенный уровень спонтанного апоптоза в группе функциональных
может быть обусловлен наличием большего количества структур _ ранеепр0_
дефектов В пуле СТВОЛОВЫХ Кроветворных клеток, что согласуется f> енных диэдей
веденных исследований. Снижение интенсивности апоп™3^ ^^неншо с контролем
после стандартного дополнительного облучения и инку тшЮдящих к срыву апоп-
Может свидетельствовать о наличии структурных поврежде .пр соматических
** У жителей прибрежных сел реки Течи отмечалось увеличение частоты соматич ^
•облученные
-контроль
мутаций и хромосомных аберраций [2]. Выявленное повышение средних значений апоптоза у облученных людей спустя десятилетия после того, как мощности доз облучения достигли фонового уровня, а также отсутствие дозовой зависимости можно объяснить вероятным наличием радиационно-индуцированной нестабильности генома. Дестабилизация хромосом, хромосомные аберрации, соматические мутации, длительно сохраняясь в клетках облученных людей и возникая de novo, могут привести к усилению их элиминации путем апоптоза.
Детальное изучение механизмов радиационно-индуцированного апоптоза лимфоцитов периферической крови, возможно, позволит понять процессы, лежащие в основе отдаленных эффектов облучения на молекулярно-генетическом уровне. Предполагается, что полученные результаты могут быть использованы в оценке индивидуальных рисков развития соматико-стохастических эффектов облучения.
Список литературы
1. Afford, S. Apoptosis / S. Afford, S. Randhawa // Clin. Pathol: Mol. Pathol. 2000. Vol. 53. P. 55-63.
2. Косенко, М. М. Риск возникновения опухолей у населения, подвергшегося хроническому облучению в прибрежных селах Течи / М. М. Косенко, О. В. Вьюшкова, М. О. Дегтева // Хроническое радиационное воздействие: риск отдаленных эффектов : материалы I междунар. симпозиум, 9-13 янв. Челяб., 1995 г. Челябинск, 1996. С. 3-4.
3. Косенко, М. М. Оценка радиационного риска популяции, облучившейся вследствие сбросов радиационных отходов в р. Течу / М. М. Косенко, М. О. Дегтева // Атомная энергия. 1992. Т. 72, вып. 4. С. 390-395.
4. Наапеп, С. Flow cytometry of apoptotic celldeath/C. Haanen [et al.] // J. oflmmunological Methods. 2000. Vol. 243. P. 167-190.
5. Hayashi. Quantitative Differentiation of oth Free 3-OH and 5-OH DNAEnds Between Heat-induced Apoptosis and Necrosis / Hayashi [et al.] // J. of Histochemistry & Cytochemistry. 1998. Vol. 46 (9). P. 1051-1059.
6. Медико-биологические и экологические последствия радиоактивного загрязнения реки Течи / науч. ред.: А. В Аклеев., М. Ф, Киселев, М., 2001.532 с.
7. Кудряшев, Ю, Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) / Ю. Б. Кудряшов. М.: ФизМатЛит, 2004, 357 с.
С А. Шалагинов, Е. К Пастухова, А. В. Аклеев
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ОБЛУЧЕНИЯ ЯИЧНИКОВ И СИСТЕМЫ ГИПОТАЛАМУС-ГИПОФИЗ НА ИСХОДЫ БЕРЕМЕННОСТЕЙ У ЖКШТШН ОБЛУЧЁННЫХ НА РЕКЕ ТЕЧЕ
Рассмотрено влияние облучения яичников и системы гипоталамус-гипофиз на исходы беременностей и родов у женщин, проживающих на побережье реки Течи, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию. Материалом для исследования послужили 197 анкет, включающих данные специального медицинского (гинекологического) обследования.
Исходы беременностей и родов зависят от действия комплекса факторов, среди которых определенная роль принадлежит состоянию репродуктивной системы беременных 102
женщин и рожениц. Так, например, угроза прерывания и невынашиваемость беременности могут быть прямым следствием гормонального дисбаланса женщины, следствием влияния средовых факторов, генетических нарушений в организме плода, иммунологического конфликта в системе мать—плод [2; 7; 8]. При этом действие ионизирующего излучения на процессы эндокринной регуляции течения беременности и прогноза исходов беременности изучены недостаточно. Вместе с тем есть основания полагать, что епштяя система гипоталамус—гипофиз—яичники может быть одной из критических при радиационном воздействии [1; 4]. В настоящей работе предпринята попытка разграничения возможных эффектов радиационного воздействия на гипоталамус и гипофиз, с одной стороны, и эффектов на яичники — с другой.
Мертворождаемость, ранняя неонатальная смертность и ВПР также относятся к группе мультифакториальных состояний [7; 9]. Конкретные причины происхождения этих состояний на практике бывает чрезвычайно трудно определить. С другой стороны, оценка действия ионизирующего излучения на репродуктивную функцию без учёта исходов беременностей и родов не может считаться полной.
Материалы и методы. Объектом исследования явились женщины, проживающие на побережье реки Течи. Материалом для исследования послужили 197 анкет, включающих данные специального медицинского (гинекологического) обследования. Анкеты заполнены в период с 1988 по 1990 г. Изученную группу составили женщины 1919-1949 гг. рождения, проживавшие в период с 1950 по 1953 г. в различных селах на побережье реки Течи в пределах Челябинской и Курганской областей. Среди них русских—126 женщин, татарок и башкирок — 71. Расчет всех показателей проводился на основе 1518 беременностей и 493 родов, состоявшихся у женщин изученной группы после 1950 г. (время начала облучения).
Дозовая информация была получена из дозиметрической базы данных, разработанной в физической лаборатории ФГУН УНПЦ РМ. Доза на костные поверхности рассматривается как аналог дозы на гипофиз. Для оценки дозовой зависимости использовался стандартный корреляционный анализ [3]. Дозы на плод и эмбрион, составившие для потомства изученной выборки женщин от 0,0178 мГр до 313,5 мГр, на данном этапе исследования не были учтены. и
Результаты исследования. Анализ исходов беременностей и родов, состоявшихся после 1950 г., проводился в объединенной группе женщин вне зависимости от их национальной принадлежности. Такой подход использован в связи с тем, что анализируемые исходы беременностей и родов относятся к категории относительно редко встречающихся событий, а размеры имеющейся выборки относительно невелики.
Таблица 3
Частота самопроизвольных абортоБ В Дозовьа 1^упп« ^ 195о п
^Доза облучения на яичники) без учета беременностей, наступи----
Дозовые группы, Гр
<адо1
Число самопроизвольных абортов_
Частота самопроизвольных абортов, %
Частота самопроизвольных абортов в дозовых группах ^ (доза облучения на костные поверхности) без учета беременностей,
наступивших до 1950 г. __________________
Дозовые группы, Общее число беременностей Число самопроизвольных абортов Частота самопроизвольных абортов, %
<0,01 202 2 0,99
0,01-0,099 77 1 1,30
0,1-0,49 327 6 1,83
0,5-0,99 165 3 1,82
1,0-1,49 174 2 1,15
1,5-1,99 222 17 7,66
2,0-2,49 184 3 1,63
2,5-2,99 123 3 2,44
3 и> 44 4 . 9,09
Всего 1518 41 2,70
Примечание. Коэффициент корреляции г = 0,87, Р < 0,001.
В табл. 1 и 2 представлены данные о числе самопроизвольных абортов в зависимости от дозы на яичники и дозы на костные поверхности соответственно. Отмечена достоверная связь с дозой как на яичники, так и на костные поверхности, при этом для дозы на яичники получен более высокий коэффициент корреляции (0,92 против 0,87), но уровень достоверности более высок для дозы на костные поверхности (Р < 0,001 и Р < 0,005 соответственно).
В табл. 3 и 4 представлены данные о частоте преждевременных родов в зависимости от дозы на яичники и дозы на костные поверхности. Несмотря на отсутствие достоверной зависимости от дозы на яичники, можно говорить о тенденции к увеличению частоты преждевременных родов с увеличением дозы облучения. При этом следует учесть тот факт, что максимальная частота отмечена в группе с максимальными дозами. Относительно высокий уровень изучаемого показателя в группе с минимальной дозовой нагрузкой может быть связан с неучтенными влияниями нерадиационных факторов на женщин данной группы, которые по ряду характеристик (возраст, национальность, место рождение) не идентичны женщинам из остальных дозовых групп.
Таблица 3
Частота преждевременных родов в зависимости от дозы на яичники
Дозовые группы, Гр Общее число родов Число преждевременных родов Частота преждевременных родов, %
<0,001 49 4 8,16
0,001-0,0049 126 4 3,17
0,005-0,0099 55 2 3,64
0,01-0,049 154 8 5Д9
0,05-0,099 61 2 3,28
ОД и> 59 11 18,64
Всего 493 31 6,29 .
Примечание. Коэффициент корреляции г =0,71, Р > 0,05.
Как следует из табл. 4, отмечена достоверная положительная корреляционная зависимость частоты самопроизвольных абортов от дозы на костные поверхности
(г= 0,72, Р < 0,01). При этом обращает на себя внимание наличие высокой частоты преждевременных родов в группе с дозой на костные поверхности < 0,01 Гр, которая значительно превышает среднее значение — 6,29 %.
Частота преждевременных родов в зависимости от дозы на костные поверхности
Таблица 4
Дозовые группы, Общее число родов Число преждевременных родов Частота преждевременных родов, %
<0,01 60 6 10,0
0,01-0,099 26 0 0
0,1-0,49 91 3 3,30
0,5-0,99 73 2 2,74
1,0-1,49 80 1 1,25
1,5-1,99 65 4 6,15
2,0-2,49 52 7 13,46
2,5-2,99 30 6 20,0
Зи> 16 2 12,5
Всего 493 31 6,29
примечание. Коэффициент корреляции г -и,/а г ^ и,ш.
Важным показателем, который может не только отражать состояние репродуктивной сферы облученных женщин, но и быть следствием поражения генетических структур половых клеток как самих облученных женщин, так и их мужей, являются врожденные пороки развития [9].
Как следует из табл. 5, достоверной корреляционной зависимости частот ВПР от дозы на яичники не отмечено. В то же время максимальная частота ВПР зафиксирована для женщин, получивших максимальные дозы на яичники, более 0,1 Гр. Не отмечено также Дозовой зависимости частоты ВПР от дозы на костные поверхности (табл. 6). При этом следует отметить более высокое значение коэффициента корреляции во втором случае по сравнению с первым (0,71 против 0,34). Более выраженным также является повышение частоты случае ВПР в дозовой группе женщин с максимальными доза (. , о против 5,08 %). г
Таблица 5
Частота ВПР в потомстве женщин, облученных на реке Тече, в зависимости от дозы на яичники^
Дозовые группы, Гр
^001-0^049
^005-^0099
<№Ч),049_
^05-^099 0,1 и>
Всего
Общее число родов
Частота ВПР в потомстве женщин, облученных на реке Тече, в зависимости от дозы на костные поверхности_______________
Дозовые группы, Гр Общее число родов Число детей с ВПР Частота Ь11Р, %
<0,01 60 2 3,33
0,01-0,099 26 1 3,85
0.1-0,99 164 1 0,61
1,0-1,99 145 3 2,07
2,0-2,99 82 2 2,44
3 и> 16 2 12,50
Всего 493 11 2,23
Примечание. Коэффициент корреляции г =0,71, Р > 0,05.
В табл. 7 и 8 представлены данные о частоте случаев ранней неонатальной смертности в зависимости от дозы на яичники и костные поверхности. Из представленных данных видно, что имеется достоверная зависимость изучаемого показателя как от дозы на яичники (г =0,73, Р < 0,05), так и от дозы на костные поверхности (г =0,86, Р < 0,02). Обращает на себя внимание наличие более высокой корреляционной связи от дозы на костные поверхности.
Таблица 7
Частота случаев ранней неонатальной смертности в потомстве женщин, облученных на реке Тече, в зависимости от дозы на яичники
Дозовые группы, Гр Общее число родов Число случаев неонатальной смертности Частота неонатальной смертности, %
< 0,001 49 1 2,04
0,001-0,0049 126 4 3,17
0,005-0,0099 55 0 0
0,01-0,049 154 8 5,19
0,05-0,099 61 2 3,28
0,1 и > 59 7 11,86
Всего 493 22 4,46
Примечание. Коэффициент корреляции г =0,73, Р < 0,05.
Таблица 8
Частота случаев ранней неонатальной смертности в потомстве женщин, облученных на реке Тече, в зависимости от дозы на костные поверхности
Дозовые группы, Гр Общее число родов Число случаев неонатальной смертности Частота неонатальной смертности, %
<0,01 60 2 3,33
0,01-0,099 26 1 3,85
0,1-0,99 164 6 3,66
1,0-1,99 145 6 4Д4
2,0-2,99 82 6 7,32
3 и> 16 1 6,25 _
Всего 493 22 4,46 _
Примечание. Коэффициент корреляции г =0,86, Р < 0,02.
По данным анкет, зарегистрировано 7 случаев мертворождаемости на 493 р<>' дов, состоявшихся в период после 1950 г. у облученных на реке Тече женщин. Частота 106
мертворождаемости составила 1,42 %, что соответствует данным литературы [7], В настоящем исследовании относительно небольшие размеры выборки проанкетированных женщин и небольшое число случаев мертворождаемости не позволяет провести детальный анализ мертворождаемости в зависимости от дозы облучения.
С учетом низких фоновых частот показателей, характеризующих исходы беременностей и родов, и относительно небольших размеров изученной выборки было принято решение проанализировать сумму состояний, характеризующих неблагополучие новорожденного. При этом то или иное состояние учитывалось только у одного конкретного ребёнка. Например, если ребенок родился мертворожденным с ВПР, то учитывался только один случай патологии новорожденного.
В табл. 9 представлены суммарные результаты, включающие данные о частоте мертворождаемости, смертности до 1 года и врожденных пороках развития в зависимости от дозы на яичники. Из представленных данных видно, что самые высокие показатели случаев неблагополучия новорожденных детей приходятся на группу женщин, получивших максимальные дозы облучения, при этом не отмечено достоверной корреляционной связи с дозой.
• Таблица 9
Частота всех случаев неблагополучия новорожденных детей в потомстве женщин, облученных на реке Тече, в зависимости от дозы на яичники
Дозовые группы, Гр Общее число родов Число случаев неблагополучия Частота случаев неблагополучия, %
<0,001 49 3 6,12
0,001-0,0049 126 6 4,76
0,005-0,0099 55 2 3,64
0,01-0,049 154 12 7,79
0,05-0,099 61 2 3,28
ОД и > 59 10 16,95
Всего 493 35 7Д0
Примечание. Коэффициент корреляции г =0,66, Р > 0,05.
Как следует из табл. 10, отмечен последовательный рост частоты изучаемого показателя в зависимости от дозы на костные поверхности (г = 0,82, Р < 0,02).
Таблица 10
Частота всех случаев неблагополучия (мертворождаемость, смертность до 1 года» ВПР) новорожденных детей в потомстве женщин, облученных на реке Тече, в зависимости от дозы на костные поверхности___________________________
Дозовые группы, Гр Общее число родов Число случаев неблагополучия Частота случаев неблагополучия, %
<0,01 60 5 8,33
0,01-0,099 26 1 00
ОД-0,99 164 9 5,49
1,0-1,99 145 9 6,21
2,0-2,99 82 7 8,54
3 и> 16 4 25,00
Всего 493 35 7Д0
В табл. 11 представлены обобщенные результаты корреляционного анализа различных показателей, отражающих исходы беременностей и родов в зависимости от дозы на яичники и костные поверхности. Достоверный уровень корреляционной связи изучаемых показателей в зависимости от доз на костные поверхности отмечен в 4 случаях из
5, в то время как от доз на яичники — только в 2 из 5, В тех двух случаях, когда была одновременно зафиксирована достоверная связь как от дозы на яичники, так и от дозы на костные поверхности, уровень достоверности для дозы на костные поверхности был более значимым.
Таблищ 11
Сравнительная оценка коэффициентов корреляции между показателями, характеризующими исходы беременностей и родов, состоявшихся после 1950 г., и дозой облучения
Показатель Величина показателя корреляции и уровень значимости в зависимости от дозы
на яичники на костные поверхности
Спонтанные аборты 0,92 (Р< 0005) 0,87 (Р < 0,001)
Преждевременные роды 0,71 (Р >0,05) 0,72 (Р< 0,01)
ВПР 0,34 (Р> 0,05) 0,71 (Р > 0,05)
Неонатальная смертность 0,73 (Р < 0,05) 0,86 (Р < 0,02)
Сумма случаев патологии новорожденного 0,66 (Р >0,05) 0,82 (Р< 0,02)
Таким образом, в настоящей работе показана зависимость от дозы на костные поверхности и яичники таких патологических состояний плода, как мертворождаемость и ранняя неонатальная смертность, а также состояний, характеризующих течение беременности (спонтанные аборты и преждевременные роды). Вместе с тем в условиях длительного хронического облучения в период, предшествующий зачатию, облучению также подвергались половые клетки облученных женщин, а в ряде случаев и половые клетки их мужей. Также имело место внутриутробное облучения эмбриона и плода.
По мнению авторов, наиболее значимым механизмом радиационного воздействия следует считать облучение гипоталамо-гипофизарной системы и последующее нарушение процессов регуляции течения беременности. При более значимом облучении гонад мы получили бы более выраженную зависимость показателей от дозы на яичники, и прежде всего ВПР и, возможно, случаев ранней неонатальной смертности. Однако в нашем исследовании наиболее значимые уровни зависимости отмечены для дозы на костные поверхности, при этом в большей мере для спонтанных абортов и преждевременных родов.
Наиболее вероятными исходами при облучении плода на ранних этапах внутриутробного развития могут быть ВПР и спонтанные аборты, на поздних этапах — ранняя неонатальная смертность [5; 6]. Полученные в работе результаты не позволяют исключить возможности непосредственного влияния ионизирующего излучения на плод и эмбрион. Вместе с тем^радиационно-индуцированные нарушения в системе гипоталамус-гипофиз беременной матери также являются значимым фактором, способным повлиять на все изученные показатели.
Список литературы
1. Банецкая, К В. Динамика фолликулогенеза в яичнике потомства от облученных в ^бриогенезе и ранней постштальной жизни животных / Н. В. Банецкая, А. а Амвросьев, 1 Пй ленко Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т. 40, № 3. С 250-253.
2. Гинекологическая эндокринология / под ред. К. Н. Жманкина. 3-є изд. М.: Медицина, 1980. 528 с.
3. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / Стентон Гланц ; пер. с англ. Ю. А, Данилова. М.: Практика, 199В. 459 с.
4. Голощапова, Ж. А. Морфологическая характеристика желез внутренней секреции крыс, получавших стронций-90 в течение всей жизни / Ж. А. Голощапова // Радиоактивные изотопы во внешней среде и организме / под ред. Ю. И. Москалева. М., 1970. С. 171-174.
5. Златорунская, Н. Б. Течение беременности, родов и послеродового периода у женщин, работающих в производстве урана / Н. Б. Златорунская, В. Н. Чусова // Бюл. радиан, медицины. 1978. № 1. С. 24-26.
6. Лягинская, А. М. Реакция основных систем организма. Репродуктивная система / А. М. Лягинская // Радиационная медицина / под ред. Л. А. Ильина. М.: ИздАТ, 2004. Т. 1. С. 352-369.
7. Неонатология / под ред. В. В. Гаврюшова. Л.: Медицина, 1985.336 с.
8. Татарчук, Т. Ф. Тиреоидньга гомеостаз и дисгормональные нарушения репродуктивной системы женщины / Т. Ф, Татарчук, Н. В. Косей, А. О. Исламова // Эндокринная гинекология: клинические очерки. Киев : Заповіт, 2003. Ч. 1.303 с.
9. Тератология человека / под ред. Г. И. Лазюк. М.: Медицина, 1991.479 с.
