CC BY
67
КОЕс, выявляемые с помощью экзотеста и эндотеста, представляют собой различные функциональные группы стволовых Кроветворных клеток [3]. Принято считать, что КОЕс, выявляемые с помощью экзотеста, относят к покоящимся стволовым кроветворным клеткам (на стадии Gp), тогда как КОЕс, выявляемые с помощью эндотеста, являются функционально активными плюрипотентными предшественниками, находящимися на других стадиях клеточного цикла. Таким образом, отличия в реакции стволовых кроветворных клеток, выявляемые методами экзотеста и эндотеста, могут объясняться или отличиями в чувствительности к исследуемым электромагнитным воздействиям различных функциональных групп стволовых клеток, или функциональными изменениями в группе стволовых кроветворных клеток, выявляемыми методом эндотеста (например, ускорение клеточного цикла или повышение доли этих клеток, вовлеченных в дифференцировку).
В результате исследования сделаны выводы о том, что воздействие ЭМИ РЧ с несущей частотой 925 МГц, частотной модуляцией 217 Гц и мощностью потока 1,2 мВт/см2 по 10 мин в течение трех суток приводит к увеличению количества ЯСК в костном мозге мышей, оказывает влияние на процесс созревания эритроцитов в костном мозге, увеличивая количество незрелых форм. Воздействие ЭМИ РЧ в исследуемом режиме не приводит к достоверному изменению количества КОЕс в костном мозге, выявляемых методом экзотеста, но способствует достоверному снижению количества КОЕс, регистрируемых методом эндотеста.
Список литературы
1. Bond, V. P. Mammalian radiation lethality. A disturbance in cellular kinetic / V. P. Bond, Т. M. Fliedner, J. O. Archambeau. N. Y,: Academic Press, 1965.246 p.
2. Van Den Heuvel, R. Haemopoietic cell proliferation in murine bone marrow cells exposed to extreme low frequency (ELF) electromagnetic fields / R. Van Den Heuvel [et al.] //Toxicol in Vitro. 2001. V. 15 (4-5). P. 351-355.
3. Переверзев, А. К. Кроветворные колониеобразующие клетки и физические стресс-факторы/ А, К. Переверзев. Л.: Наука, 1986. 172 с.
О. С. Козионова, О. Г. Площанская, А. В. Аклеев, Ю. Е, Ду&роеа
ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МИНИСАТЕЛЛИТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА КАК МАРКЕРА НЕБЛАГОПРИЯТНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ГЕНОМ
Изучена скорость мутирования по восьми минисателлитным ДНК локусам (В6.7, СЕВ1, СЕВ15, СЕВ25, СЕВЗб, М81, М831 и М832) в половых клетках облученных родительских пар, проживавших в прибрежных селах реки Течи, и контроль-ной группы необлученных семей. Соотношение полов среди потомков, возраст родителей на момент рождения ребенка, их профессиональная принадлежность и частота курильщиков в сравниваемых группах семей значимо не различались.
В настоящее время важной задачей радиационной генетики является поиск новых экспериментальных подходов к мониторингу радиационно-индуцированных мутаций в человеческой популяции. Одним из подходов к решению данного вопроса может быть исследование мутаций в минисателлитных локусах человека.
90
Минисателлитными повторами называют тандемно повторяющиеся последовательности ДНК с длиной минимальной повторяющейся единицы в 6-100 пн, которая имеет общий размер до 20 ООО пн [5; 6; 10; 12]. Минисателлиты могут быть мономорфными и полиморфными. У последних число повторов в последовательности варьирует между индивидами. В некоторых минисателлитных яокусах человека исследования показали уровень спонтанных мутаций, колеблющийся в пределах 0,5-13 % на гамету [6]. Полиморфные минисателлиты известны также как VNTR (variable number of tandem repeats) — повторы, они являются первыми высокополиморфными маркерами., описанными при генетическом анализе человеческих нарушений [16].
В ранее проведенных исследованиях, посвященных оценке влияния ионизирующих излучений на частоту минисателлитных мутаций, были получены противоречивые результаты. Наряду с работами, показавшими достоверное увеличение частоты миниса-теллитных мутаций в половых клетках облученных людей [9; 11], существуют такие исследования, в которых увеличения частоты мутаций обнаружено не было [13].
Материалы и методы
Характеристика исследованных групп
Данная работа проводилась с целью выявления влияния хронического радиационного воздействия на частоту мутаций в восьми минисателлитных локусах: В6.7, СЕВ1, СЕВ15, СЕВ25, СЕВ 36, MSI, MS31 и MS32.
Исследование проводилось с использованием образцов крови людей, проживавших на территориях, пострадавших в результате деятельности ПО «Маяк». В качестве основной группы выступали семьи, в которых один или оба родителя подвергались хроническому радиационному воздействию вследствие проживания на реке Тече. В качестве группы сравнения выступали семьи, проживающие на незагрязненных территориях тех же административных районов, что и семьи основной группы.
Основная группа была представлена 174 семейными ячейками 92 семьями, в которых было 174 потомка. Контрольная группа состояла из 99 семейных ячеек 49 семей, которые включали 99 потомков. Группы были сопоставимы по национальному составу, возрасту на момент рождения детей, социально-экономическим факторам: образованию, профессиональной занятости, курению и употреблению алкоголя, а также по фактору наличия профессиональных вредностей. u
Для каждого потомка, взятого в исследование, сотрудниками биофизическои лаборатории ФГУН УНПЦ РМ были подсчитаны гонадные дозы родителей на момент зачатия, мощность дозы облучения на момент зачатия, дозы внутриутробного и гостнатального облучения на красный костный мозг и мягкие ткани. Средняя гонадная доза отца составила 69,б±9,0 мГр, средняя доза матери — 71,5±7,6 мГр.
Большинство пренатально облученных потомков получили на мягкие ткани и р -ный костный мозг дозу менее 1 мГр, и лишь 18 человек — пренатальную дозу °л Только 6 человек получили постнатальную дозу на мягкие Доза на красный костный мозг для большинства постнатальн У составила 1-10 мГр. -
Выделение ДНК и генотипирование образцов ___
, В работе использовался метод выявления мутаций в
Такие мутации приводят к изменению анастроф р ную1е0тидов произош-
С помощью 1-kb маркера можно рассчитать, на скол Р У
Ло Уменьшение или увеличение длины аллеля. 91
Выделение ДНК осуществлялось из образцов периферической крови людей по стандартному фенол-хлоро формному методу (модификация Ю. Дуброва) [2,3,4]. Выделенную ДНК растворяли в воде и в последующем хранили при -20 °С.
Электрофорез проводили на 40-сантиметровом 0,8 %-и агарозном геле в течение 36 часов. После электрофореза ДНК переносили на нитроцеллюлозный фильтр и гибриди-зовали с 32Р-мечеными зондами.
Каждый родитель на дорожке электрофоретического геля был представлен двумя аллелями, потомок наследует по одному аллелю от каждого из родителей. О появлении мутации говорили в том случае, если полоса потомка на авторадиограмме находилась иштта или ниже соответствующей родительской полосы.
Результаты
Было обнаружено, что частота мутаций у отцов основной группы значимо выше, чем в группе сравнения. В группе матерей различий между основной группой и группой сравнения не обнаружено, Можно предположить, что в мужских половых клетках мутации возникают чаще, чем в женских. Поскольку не было обнаружено увеличения частоты мутаций в материнских половых клетках, дальнейший их анализ не проводился.
Таблица 1
Количество мутаций и частота мутирования минисателлитных локусов отцовских и материнских половых клеток
Сравниваемые признаки Группа отцов Группа матерей
основная контрольная основная контрольная
Локусы 861 1064 1001 885
Мутации 42 31 6 10
Частота мутаций 0,049* 0,029 0,006 0,011
* р<0,05.
В нашем исследовании показано достоверное увеличение частоты мутирования двух минисателлитных локусов: В6.7 и СЕВ1 (р<0,05). В предыдущих исследованиях [8-10] показана высокая частота мутирования локуса СЕВ1, но для локуса В6.7 достоверного увеличения уровня мутирования обнаружено не было.
Дозовые зависимости В нашем исследовании использовались оценки гонадной дозы отца на момент зачатия ребенка, дозы внутриутробного и постнатального облучения потомка.
Было обнаружено, что не существует статистически значимой зависимости между частотой мутаций и суммарной гонадной дозой облучения отца (рис. 1)
Частота
0,16 0,14 0,12 0,10 0,08
0,06----------
0,04 ■
0,02 — 0
Контроль До 10 '' Ю,0~300,0 ’ >100 0 Гонадная доза облучения, мГр
Рис. 1. Частота мутаций в минисателлитных локусах мужских половъгх клеток
в дозовых подгруппах гонадной дозы отщ
Внутриутробное облучение могло оказать влияние на результаты исследования, если бы Происходило на начальных этапах эмбрионального развития, когда изменение генотала даже одной клетки способно вызвать изменение генотипа всего формирующегося организма или части его клеток, приводя к мозаицизму. Однако в нашем исследовании не было обнаружено зависимости между частотой возникновения мутаций в мужских подовых клетках и дозами внутриутробного облучения на мягкие ткани и красный костный мозг.
Доза постнатального облучения не могла играть роли в возникновении мутаций, поскольку к этому времени стволовые клетки крови уже были сформированы. В данном случае облучение могло вызвать появление мутации в ограниченном количестве клеток крови, которое не смогло бы оказать влияние на результаты исследования в связи с разрешающей способностью метода.
На рис. 2 показана зависимость частоты минисателлитных мутаций от мощности дозы облучения в год зачатия ребенка. Было показано, что имеется тенденция к повышению частоты мутаций при возрастании мощности дозы, хотя и-тест Манна-Уитни не выявил значимых различий между контролем и основной группой.
Частота
0Д0
0,18
0,16 0,14 0,12 ОД 0 0,08 0,06 0,04 0,02 о
Мощность дозы облучения, мГр/год
Контроль * До 1 1,0-10,0 >10,0
Рис, 2. Частота мутаций в минисателлитных локусах мужских половых клеток в различных дозовых подгруппах мощности дозы облучения отцовских гонад
в год зачатия ребенка
Анализ влияния нерадиационных факторов на частоту мутаций в минисателлитных локусах Известно, что на частоту мутаций могут влиять не только внешние воздействия, но и внутренние факторы. По научным данным, возраст имеет существенное значение для частоты возникновения мутаций. Но в нашем исследовании частота мутаций, возникших в отцовских аллелях, не зависела от возраста отцов на момент зачатия потомков.
Поскольку мутации в минисателлитных локусах не являются специфическими маркерами радиационного облучения и частота этих мутаций может изменяться при любом воздействии на организм, то имело смысл определение частоты минисателлитных мута Ций в зависимости от факторов курения и употребления алкоголя. ^
В проведенном исследовании нами не было обнаружено значимимеется ния на частоту возникновения мутаций в минисателлитных лову а . ^ ^ бшю
тенденция к увеличению частоты мутаций у интенсивно куряш• * воз_
обнаружено статистически значимого влияния употреблен накновения мутаций в минисателлитных локусах человека.
Таким образом, обнаружено увеличение в 1,7 раза частоты мутаций в минисател-литных локусах ДНК мужских половых клеток у облученных лиц по сравнению с контрольной Группой. Не было обнаружено дозовой зависимости частоты мутаций, а также зависимости между частотой мутаций и мощностью дозы облучения.
Не обнаружено влияния факторов нерадиационной природы — возраста отца на момент зачатия ребенка, курения и употребления алкоголя — на частоту возникновения мутаций в минисателлитных локусах ДНК половых клеток человека.
Список литературы
1. Геномика—медицине / под ред. В. И. Иванова, Л. Л. Киселева. М.: Академкнига, 2005.392 с.
2. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. М.: Мир, 1984.421 с.
3. Alien, N. D. Mammalian development: a practical approach / N. D. Alien [et al.]. Oxford : ERL Press, 1987.392 р.
4. Bell, G. I. The highly polymorphic region near the human gene is composed of simple tandemly repeating sequences / G. I. Bell, М. I Serby, W. J. Rutter // Nature. 1982. V. 295. P. 31-35.
5. Bois, P. R. J. Hypermutable minisatellites, a human affair? / R R J. Bois // Genomics. 2003. V. 81 P. 349-355.
6. Bois, P. Minisatellite instability and germline mutation / P. Bois, A. J. Jeffreys 11 Cellular and Molecular Life Sciences. 1999. V. 55, P. 1636-1648.
7. Buard, J. Influences of array size and homogeneity on minisatellite mutation [et al.] / J. Buard // EMBO J. 1998. V. 17. P. 3495-3502.
8. Dubrova, Y. E. Germline mutation induction at mouse and human tandem repeat DNA loci / Y, E. Dubrova // Mutation Research. 2004. V. 544, P. 433-439..
9. Dubrova, Y. E. Long-term genetic effects of radiation exposure / Y, E. Dubrova // Mutation Research. 2004. V. 544. P. 433-439.
10. Dubrova, Y. E. Human minisatellite mutation rate after the Chernobyl accident / Y. E. Dubrova [et al.] // Nature. 1996. V. 380. P. 683-686.
11. Jeffreys, A. J, Minisatellite repeat coding as a digital approach to DNA typing
I A. J. Jeffreys [et al.] //Nature. 1991. V. 354. P. 204-209.
12. Jeffreys, A. J. Complex gene conversion events in germline mutation at human
minisatellites / A. J. Jeffreys [et al.] // Nat. Genet. 1994. V. 6. P. 136-145,
13. Kodaira, M. Lack of effects of atomic-bomb radiation on genetic instability of tandem-repetitive elements in human germ-cells / M. Kodaira [et al] // Am. J. Hum. Genet 1995 V. 57. P. 1275-1283.
14. May, C. A. Minisatellite mutation frequency in human sperm following radiotherapy / C. A. May [et al] // Mutation Research. 2000. V. 453. P. 67-75.
15. May, C. A. Mutation rate heterogeneity and the generation of allele diversity at the human minisatellite MS205 (D16S309) / C. A. May, A. J. Jeffreys, J. A. L. Armour // Hum. Mol Genet. 1996. V. 5. P. 1823-1833.
l6' Ь ^enome~wide Prediction of human VNTRs / K, Naslund [et al.] // Ge-
nomics. 2005. V. 85. P. 24-35.
