CC BY
41
УДК 723:551.435: 579 В.М.Катола
ВИЗУАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕОХИМИЧЕСКОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ МИКРОМИЦЕТОВ ИЗ РОДА РЕМСПЬШИ
АмурКНИИ АмурНЦДВО РАН, г. Благовещенск
РЕЗЮМЕ
При росте на жидкой среде в присутствии золотосодержащего материала из хвостов шлихообогатительной установки и природных цеолитов впервые у трех видов пеницилл обнаружены однотипные дифференцированные цитологические реакции глубинного мицелия и поверхностной колонии. Главным визуальным синдромом являются различной степени повреждения клеточной стенки. Все клетки аккумулируют тяжелые металлы и одновременно контрастируются ими, адсорбция более специфична. У глубинного мицелия адсорбируют частицы только крупные и средние клетки, в колонии - все гифы независимо от размера, их ответвления, растущая часть, отдельные споры, проростковые трубочки. Адсорбция не свойственна дегенеративным гифам.
SUMMARY
V.M.Katola
VISUAL ANALYSIS OF GEOCHEMICAL ACTIVITY OF MICROMYCETES OF PENICILLIUM STRAIN
We cultivated three types of penicilles in liquid medium with material containing gold and natural ceolites. We found that they have similar differentiated citologic reactions of deep mycelium and surface colony. Various cellular wall destructions are the main visual syndrome. All cells accumulate heavy metals and they are simultaneously contrasted by them, with adsorption being more specific. In deep mycelium only large and medium cells adsorb particles. In colonies all giphs regardless of their size do this. Degenerative giphs don’t have the ability to absorb.
Качественный анализ причин заболеваемости населения в районах горных разработок, совершенствование клинической, микробиологической и цитологической диагностики, осознание трудностей, связанных с внедрением в производство грибного выщелачивания и управления им - вот далеко не полный перечень проблем, доступных решению на основе всестороннего и углубленного изучения визуальных реакций микромицетов на минералы. Визуализации способствует три момента: во первых, извлеченные из пород химические элементы в водной среде вступают во взаимодействие между собой и метаболитами с образованием многочисленных соединений, отличающихся концентрацией, стабильностью, токсичностью, влиянием на микроорганизмы и
способных к детекции. Во вторых, специфическим свойством грибов, в частности широко распространенного рода Penicillium является множественность идиоморфных состояний, которые индуцируются тяжелыми металлами [2], синтезом антибиотиков [3], ферментов [4]. Поэтому не исключено, что взаимоотношения минералов с пенициллами также могут сказаться на структурной организации клеток. В третьих, ионы тяжелых металлов, избирательно захваты-ваясь различными химическими группами и ультраструктурами клетки, увеличивают плотность ее ком-партментов, тем самым способствуют их визуализации. В связи с изложенным целью настоящей работы явилось исследование структурного отклика клеток Penicillium на техногенные отходы и природные цеолиты, занимающие значительную часть территории Амурской области. До настоящего времени подобного рода исследования не проводились.
Методика
Выделенные из загрязненных ртутью хвостов шлихо-обогатительной установки (ШОУ) штаммы P.canescens, P.chrysogenum и P.citreo-nigrum выращивали в периодическом режиме на жидкой среде Чапека (источник азота NaNO3) в присутствии образцов того же биотопа, содержащего, кроме прочих химических элементов, среднекрупное высокопробное золото. Полагая, что можно обнаружить особенности в биологических эффектах минералов, в аналогичных опытах мы использовали природные цеолиты Вангинского месторождения Амурской области. Через две недели глубинный мицелий и верхний срез поверхностной колонии наносили на сеточки с форм-варовой подложкой либо прямо на объектные столбики, а из погруженной тыльной части колонии (reversum) делали отпечатки. После подсыхания препараты просматривали в просвечивающем (TESLA BS 500) и сканирующем (JEOL TSM 35 C) электронных микроскопах. Обработку биоматериала, заливку в блоки, приготовление и окрашивание срезов готовили традиционным способом.
Результаты и обсуждения
В геологической среде грибы развиваются, участвуют в круговороте веществ, адаптируются, противостоят стрессорам, следовательно, контакт с минералами - одно из необходимых условий для наблюдения за поведением клеток, выполняющих геохимическую функцию. Она многообразна, мы же остановимся на двух ее проявлениях - адсорбции и аккумуляции ионов, индицирующих сложную цепь функциональных и структурных ответных реакций пени-
цилл. В процессе миковыщелачивания и деструкции минералов в инкубационном растворе концентрируются рудные элементы, метаболиты, образуются новые минеральные формы (парагенезисы), понижается уровень рН. Часть нерастворимых новообразований осаждается, а тонкодисперсные полиморфные частицы, коньюгированные с тяжелыми металлами, остаются взвешенными в растворе. В первом приближении видно (рис. 1), что они, задерживаясь в межги-фальном матриксе, тесно окружают высокоплотные гифы и склонны к агломерации. Сами гифы различаются диаметром, у них четко контурирован прерывистый поверхностный слой клеточной стенки с адсор-бироваными частицами и крупными конгломератами. Вероятней всего, изоляция частиц мицелием поэтапна: на первом этапе они блокируются в межгифаль-ном пространстве, затем, когда их содержание превосходит некий предел, на поверхности гиф.
По нашим первым данным, основанных на сканирующей электронной микроскопии спустя 24-28 часов от начала инокуляции спор в увлажненные образцы, неоднородность мицелия и его тенденция к поглощению частиц заметны сразу после начала ветвления гиф, а в талломе эта информация появляется на 5-6 сутки роста. Впоследствие выяснилось, что адсорбция присуща многим другим элементам колонии.
Рис. 1. Вторичные новообразования в межгифаль-ном матриксе и на поверхности гиф. Увеличение х 12000.
Геохимическую работу, которую с некоторыми допущениями можно экстраполировать на эумикро-биоз человека, пребывающего в пыльной обстановке, осуществляют особые клеточные типы, скооперированные в дифференцированные по функции крупные, средние или тонкие гифы. В ходе миковыщелачивания содержание всех компонентов системы меняется, поэтому возникающий между средой и клетками градиент концентрации веществ определяет направление диффузии и активный транспорт через цитоплазматическую мембрану, соответственно, структурную организацию, функцию, обменные процессы. Нами было обращено внимание на тот факт, что при сравнении неокрашенных ультратонких срезов опытных штаммов с окрашенными цитратом свинца по Рейнольдсу срезами интактных культур клетки сохраняли одинаковую плотность цитоплазмы. Это свидетельствует о том, что пенициллы прижизненно
контрастируются металлами, которые из раствора транспортируются внутриклеточно, поэтому внутренняя структура клеток достаточно различима. Текстуру клеточной стенки составляет тонкий наружный слой, непосредственно контактирующий с окружающей средой и заявляющий о себе в качестве первого защитного звена, за ним следует широкий светлый слой, переходящий в такую же светлую межклеточную септу (рис. 2). Довольно четко дифференцируются плазмолемма, мезосомы, рибосомы, маленькое ядро. Более того, электронномикроскопический анализ цитоморфологии пеницилл позволил сделать принципиальное заключение - максимум элементов содержится не в самой биомассе, а в суммарном объеме адсорбированных частиц.
Рис. 2. Ультраструктура грибной клетки. Увеличение х 22000.
В биологическом отношении важным является то, что в присутствии минералов мицелий, развивающийся в глубине инкубационного раствора, и поверхностная колония, будучи, в сущности, производными одной клетки - споры, наряду со многими общими чертами различаются по геохимической деятельности. Физиологический смысл существующих различий полностью неясен.
Глубинный мицелий, находясь в оптимальной среде, первым начинает биотрансформацию минералов и первым воспринимает ее последствия. Их суть в следующем: через две недели роста с образцами из хвостов ШОУ у его клеток фрагментарно повреждается преимущественно поверхностный слой стенки, иногда все слои, очень редко плазмолемма. Другая особенность структуры состоит в том, что частицы равномерным монослоем связываются поверхностью только крупных и среднего диаметра клеток, правда, в 0,01% случаев они не проявляют адсорбирующих признаков. Встречаются разрозненные гифы, фиксирующие, а может быть, заново создающие в виде дополнений к монослою крупные агрегаты. Более существенно то, что все тонкие гифы (мелкие молодые клетки), с ними вкупе и соединительные нити остаются индифферентными к окружающим их частицам. По подсчетам в полях зрения процент гифов-адсорбентов в среднем равен 53, «инертных» тонких - 47. То есть, первых в 1,56 раза меньше, вторых в 2,76 раза больше, чем их доля во время роста пени-
цилл на искусственных средах без минералов [1]. В биоаккумуляции частиц трансформированных природных цеолитов также участвует около 53,5% крупных и средних клеток, однако, по сравнению с предыдущими опытами среди них гораздо больше экземпляров, которые не фиксируют частицы. Их содержание в совокупности с мелкими клетками достигает 46,5%. Повреждения клеточной стенки здесь редки, других особенностей не выявлено. Сопоставление результатов по анализу отклонений в ультраструктуре клеток глубинного мицелия позволяет сделать вывод о том, что: а) в присутствии минералов увеличение биомассы идет за счет молодых клеток. Определяемая разница между ними и более зрелыми клетками обусловленна, по-видимому, лизисом клеток с поврежденной плазмолеммой; б) исключительная прерогатива крупных и средних клеток, принадлежащих, вероятно, к зрелому типу - это извлечение из раствора и адсорбция на поверхности твердых веществ с наименьшим структурным уроном; в) в противоположность хвостам ШОУ нарушение нормальной структуры клеток природными цеолитами выражено слабее.
Более сложная картина открывается при исследовании поверхностной колонии, где удается дифференцировать специфику как субстратных, так и воздушных гиф. У погруженных клеток, формирующих плотный гвувп'ит колонии, аккумуляция ионов доминирует над адсорбцией частиц, в силу чего они характеризуются чрезмерно повышенной плотностью. По соображениям удобства, которые лимитируют многообразие процессов, происходящих в гифе как биологической системе, нам представляется вероятным, что геохимическая функция здесь реализуется тремя условными типами неравноценных клеток: металлочувствительных, умеренно- и высокотолерантных. Металлочувствительная, иначе «буферная» популяция максимально депонирует ионы, но из-за градиента концентраций вскорее отмирает вследствие цитоплазмолиза, превращаясь в изолированное депо поллютантов внутри гифы. Цитоплазмолиз проявляется по-разному: у одних клеток плазматическая мембрана с цитоплазмой отслаиваются от клеточной стенки, удерживающей на поверхности частицы, и трансформируются в высокоинтенсивную гомогенную структуру с волнистыми контурами; в других случаях в цитоплазме появляются многочисленные крупные вакуоли, смыкающиеся с нижней поверхностью плазмалеммы. Рядом соседствующие умеренно- и высокоустойчивые клетки меньше им-прегнируются ионами, зато связывают более крупные парагенезисы (рис. 3) Таким образом, в пределах гифы клетки отличаются не только геохимической активности, но и принадлежа к одной популяции, отдельно располагаются в различных ее локусах. Нарушения клеточной поверхности почти не встречаются.
Пожалуй, наиболее пестрые события констатируются в воздушном мицелии. Здесь предпочитается тотальная адсорбция - адсорбируют все гифы, включая их боковые ветвления, верхушечную часть, проростковые трубочки и отдельные споры.
отдельные споры.
б
Рис. 3. Клетки субстратных гиф: а) явления цитоплазмолиза; б) толерантная клетка с адсорбированными частицами. Увеличение х 12000.
Впрочем, на долю адсорбентов самого малого диаметра выпадает всего лишь 16,6%. Одни клетки связывают мелкие частицы, другие крупные, причем сцепленные игольчатые формы могут образовывать вдоль клеточного ансамбля широкий вал (рис. 4). У адсорбирующих клеток стенка в основном грубо повреждена, порою отсутствует и частицы располагаются прямо на плазмолемме.
Цитоплазматический комплекс может частично или полностью выходить («линять») из футляра стенки и размещаться рядом, не теряя связи с ее фрагментами. Довольно часты разрывы гиф в области септ, вакуолизация цитоплазмы, нарушения целостности оболочек спор, их полная деструкция. Дегенеративные нити гомогенны либо вакуолизированы и, как правило, не склонны к адсорбции частиц.
Таким образом, несмотря на то, что видоспецифические реакции на хвосты ШОУ или природные цеолиты у пеницилл не обнаружены, вариации поверхности клеток указывают на определенный путь развития популяций в присутствии генетически различных минералов. Это представляет пеницилл в совершенно новом формате, отличном от ранее из-
вестных идиоморфных состояний. Клеточным типам независимо от того, находятся ли они в составе
Рис. 4. Поперечный срез клетки воздушного мицелия с адсорбированными частицами. Увеличение х 22000.
глубинного мицелия или колонии, доступна аккумуляция выщелоченных ионов, следовательно, система их транспорта менее специфична. Адсорбция минеральных или химических форм характерна зрелым клеткам глубинных гиф и всем клеточным типам колонии. Рассматриваемая закономерность наблюдается на всех этапах жизненного цикла пеницилл. Вполне очевидно, в этом есть определенное преимущество: функциональная гетерогенность гиф позволяет жертвовать частью популяции для сохранения вида в стрессорных условиях. Такой тактикой достигается, например, относительное снижение концентрации поллютантов в биотопе, что уменьшает токсический пресс и на грибы, и на ассоциированные с ними бактерии. Установленный спектр структурных реакций со стороны мицелия, растущего в глубине среды, и клеток колонии служит примером ответа микромицетов на более широкий круг факторов, способных изменять структуру и функцию. Заодно, указывает на некоторую логическую схему адаптации: в
глубинном мицелии геохимическую работу выполняют лишь зрелые клеточные типы, молодым же, неадсорбирующим клеткам вменяется поддержка жизнестойкости вида. В колонии вся работа биологической системы направлена на достижение одной конечной цели - репродукции.
Выводы
1. При культивировании различных видов пени-цил совместно с минералами выявлена структурная и функциональная реактивность отдельно глубинного мицелия и поверхностной колонии, отражающая индивидуальные свойства клеток, их ритм в системе гифы, формы адаптации.
2. Изменения клеточной стенки в стрессорных условиях представляют собою ведущий визуальный синдром, позволяющий судить о степени токсичности геологической среды и инкубационного раствора. Наоборот, плазмолемма является самой прочной клеточной структурой.
3. Способность пеницилл задерживать минеральные и химические формы в межгифальном матриксе и на поверхности может быть использована для совершенствовании диагностики и лечения микозов.
4. Эффективное управление функциональным потенциалом микромицетов возможно при соответст-вующах методах воздействия на дифференцировку и специализацию клеток.
ЛИТЕРАТУРА
1. Катола В.М., Котенёва В.В., Комогорцева Ю.В. Экоморфофизиология грибов из рода РетсШшш, обитающих в аномальных зонах //Генезис месторождений золота и методы добычи благородных металлов: Материалы междунар. науч. конф., 2830 августа 2000 г.-Благовещенск, 2001.-С. 213-215.
2. Сенцова О.Ю., Максимов В.Н. Действие тяжелых металлов на микроорганизмы//Успехи микро-биол.-1985.-Т.20.-С.227-252.
3. Смирнов В.В. Василевская И.А., Резник С.Р. Антибиотики.-Киев, Выща школа, 1985.-187 с.
4. Тоскуева С.П., Аравийский Р.А., Ефимова Т.П. Цитоморфология РЕ№С1ЬЬШМ 80ЫТиМ- продуцента липазы//Антибиотики и химиотерапия.- 1988.-Т.ХХХШ, № 9.- С.647-650.
□ □ □
