CC BY
50
УДК 723:551.435:579 В.М.Катола
РЕАКЦИЯ СТРУКТУР КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ГРИБОВ ИЗ РОДА PENICILLIUM
НА СТРЕССОРНУЮ СРЕДУ
АмурКНИИ АмурНЦ ДВО РАН, Благовещенск
РЕЗЮМЕ
На электронно-микроскопическом уровне установлено, что в процессе взаимодействия грибов из рода Pénicillium с ртутьсодержащими отходами золотодобычи действенную роль играет каждый слой клеточной стенки. Это относительно самостоятельные структуры, активно участвующие в защите пеницилл, их геохимической деятельности и дезинтоксикации среды. Они адсорбирует остатки разрушенных минералов, аккумулирует и трансформирует ионы выщелоченных рудных элементов в полиморфные частицы. На основании особенностей поведения слоев клеточной стенки в экстремальной среде дифференцировано несколько клеточных мофотипов: высокочувствительные, чувствительные, умеренно устойчивые и высокоустойчивые. С ними, как предполагается, связаны толерантность и выживаемость микромицетов.
SUMMARY
V.M.Katola
REACTION OF CELLULAR WALL STRUCTURES OF MUSHROOMS OF PENICILLIUM GROUP TO STRESS ENVIRONMENT
Ultramicroscopic studies showed that each cellular wall layer plays an important role in interaction of mushrooms of Penicillium group and mercury containing gold-mining remnants. These structures participate in penicill defense, their geo-chemic activity environment desintoxication. They absorb mineral destroyed remnants, accumulate and transform ions of leached ore elements and polimorphm particles. The study of cellular wall activity resulted in differentiating several cellular mophotypes: highly sensitive, sensitive, slightly resistant and highly resistant types. They are assumed to be connected with mi-cromycete tolerance and survival.
В предыдущей работе мы показали [2], что в присутствии техногенных отходов, содержащих различную валовую концентрацию рудных элементов, клеточная стенка (КС) грибов из рода Penicillium представляет основную наглядную структуру, отражающую общую реакцию этих организмов на стрессоры. Ее суть заключается в том, что в результате непрямой экстракции элементы переводятся в раствор, кристаллическая решетка разрушается, и на гифах адсорбируются полиморфные частицы. Ими могут быть
остатки разрушенных минералов, ассоциированные с тяжелыми металлами, и ионы, аккумулированные КС. Тогда мы их не разграничивали, не детализировали и поведение отдельных компонентов КС. Однако полученная нами новая информация потребовала вернуться к этому вопросу. Напомним, что в химическом отношении КС состоит на 80-90% из полисахаридов и гликопротеидов [1, 3, 5, 6], которые в изолированном виде являются эффективными адсорбентами тяжелых металлов [1, 4, 8, 9]. Текстуру же КС формируют, по одним данным [3], четыре слоя (наружный глюкановый, гликопротеидный, протеидный и внутренний хитиновый), по другим [5] всего три слоя: электронно-плотный тонкий поверхностный (гликопротедный), самый широкий и светлый средний, представляющий гликопротеидный матрикс, и электронно-плотный опорный или внутренний слой, тесно примыкающий к плазмолемме. С возрастом культуры количество слоев меняется.
Настоящая работа есть логическое продолжение предыдущей [2]. Ее цель - на электронно-микроскопическом уровне охарактеризовать слои КС у двухнедельных пеницилл, выросших в присутствии техногенных отходов золотодобычи, и на этой основе выделить клеточные морфотипы.
Исследования выполнены по методике, описанной ранее [2].
Результаты и обсуждения
Отметим, что клетки-мишени грибов получают адресованную информацию за счет функционирования аденилатциклазного комплекса и через каскадную цАМФ-зависимую систему приводятся в состояние раздражимости [7]. Но так как строго индивидуализировать внешние пусковые сигналы не всегда возможно, то выделяют клеточные функции, составляющие физиологический ответ. Оказывается, инду-цибельный ответ на раздражение проявляется последовательными и закономерными изменениями каждого из слоев клеточной стенки, причем одинаково у штаммов Р.сапе^сет', P.citreo-nigrum и
Р.chrysogenum, выделенных из отходов золотодобычи, и у штамма Р.с^у^^епит, изолированного из бронхоальвеолярной жидкости больного хроническим бронхитом (рис 1а, в). Рассмотрим поведение компонентов КС глубинного мицелия и колонии.
Рис. 1 показывает, что среди трех отчетливо видимых слоев КС глубинных гиф, реагирующей на сдвиги в культуральной среде (возрастание концентрации ионов, вторичных новообразований, метаболитов и пр.), ведущим является ее поверхностный слой (ПС). В противоположность ему подлежащий средний слой продолжает сохранять типичные раз-
в
Рис. 1. Электронная микроскопия ультратонких срезов глубинного мицелия представителей рода Pénicillium : а - начало отслойки поверхностного слоя клеточной стенки P.canescens. Под удаляемым участком ПС плотный гранулированный пласт. Ц уплотнена, ячеистой структуры. Увеличение х 22000; б - фрагмент гифы P.chrysogenum. ПС расположен преимущественно за пределами клеток, неравномерно утолщен и уплотнен. Остальные два слоя представляют равномерный плотный монослой за счет сорбированных ионов. Межклеточные септы (МС) расширены и уплотнены, Ц ячеиста. Рядом часть крупной клетки с отслоенным ПС и высокоплотной Ц. Увеличение х 9000; в - отслойка ПС у клетки P.chrysogenum, выделенного от больного хроническим бронхитом. Увеличение х 16000.
меры и тональность. Более реактивный ПС представляет собою плотноватую рыхлую мембрану, сплошным чехлом окружающую мицелиальные нити. На рис. 1 а проиллюстрировано уникальное событие -начало его отслойки с поверхности одной из них. Как видно, в ситуациях, чрезвычайных для организма пеницилл в целом, ПС удаляется в виде деформированного, неравномерно уплотненного жгута, состоящего из отдельных микрофибрилл. Скорее всего, эти тончайшие и длиные волокна объединяются в пучки, которые располагаются параллельными рядами. Будучи непрочно связанными между собою, они, вероятно, слущиваются друг за другом по мере того, как нарастает токсичность среды, о чем свидетельствует плотный и сильно гранулированный пласт, находящийся на месте отторгающегося участка. Еще одно допущение: микрофибриллы построены из чередующихся звеньев разного химического состава полисахаридов, липидов и протеинов. Именно благодаря такой гетерогенности ПС способен изменять не только пространственную конфигурацию, но и увеличи-
вать клеточную поверхность, соответственно, надежно связывать различные ионы. Эти свойства позволяет ему одновременно быть и протектором клетки, и средством детоксикации места обитания.
Толщина ПС в каждый конкретный момент может сильно варьировать в зависимости от химической природы ионов. Если в инкубационном растворе преобладает концентрация особо токсического элемента, то вокруг гиф образуется мощный слизистый барьер. Утолщение поверхностного слоя можно расценивать как признак, свидетельствующий о высоком уровне физиологической регенерации данной поверхностной и относительно самостоятельной структуры КС. У других клеток ПС занимает совершенно разные позиции: он может либо оставаться в качестве неотъемлемой, но фрагментированной части клеточной стенки, или обособляться от прочих ее компонентов в виде неравномерно утолщенных тяжей, спиралей и глобул. Примечательно, что в таких случаях отслойка затрагивает целые клеточные комплексы, начиная от апекса (рис. 1 б). Покинувшие
гифы фрагменты ПС формируют межгифальный матрикс, какая-то их доля даже поступает в культуральную жидкость.
Поскольку разрушение кристаллической решетки минералов, значит, и адсорбция их частиц гифами наступает позднее, чем начало выщелачивания рудных элементов, то ПС клеточной стенки, в том числе его фрагменты служат центрами поглощения и трансформации прежде всего ионов тяжелых металлов. Последние не только сорбируются ими, прокрашивают, уплотняют и, по-видимому, изменяют некоторые их физико-химические свойства, в частности вязкость, но и преобразуются в многочисленные полиморфные электронноплотные частицы, трудно отличимые от разрушенных минеральных зерен. Частицы локализуются на поверхности гиф, в межги-фальном пространстве, культуральной среде. В соот-ветстии с химическими свойствами металлов частицы располагаются на ПС по-разному: одни неравномерно фиксируются вдоль всей его поверхности, другие только на отдельных металлосвязывающих локусах (коллоидное золото), одни разрозненные и единичные, другие, наоборот, множественные, а третьи скапливаются крупными агрегатами. Такое размещение и форма частиц наблюдаются и в межги-фальных промежутках.
У ряда клеток после удаления ПС модулируется следующий за ним средний слой. Не отслаиваясь от подлежащих структур, он уменьшается в размерах и почти сливается с опорным слоем. Определить теперь, кому же из них принадлежит приоритетная аккумуляция тяжелых металлов весьма сложно (рис. 1
б, 2 б). Несмотря на это обращает внимание, что в отличие от ПС, они не формируют частицы. Впрочем, депонирование ионов в КС без формообразования такая же защитная и дезинтоксикационная функция, как и та, которая осуществляется на поверхности гиф. Кроме того, регистрируется не только достоверно многократное расширение септ, но и превышение
их плотности над плотностью цитоплазмы. Чтобы найти объяснение, уместно напомнить, что при росте пеницилл на искусственных средах средний слой непосредственно переходит в светлые межклеточные перегородки, сходные с ним по ширине. Наблюдаемая электронномикроскопическая картина в рассматриваемом случае означает, во первых, что у данной группы клеток плазмолемма не повреждена и продолжает активно осуществлять барьерную функцию, во вторых, не исключает, что структурная часть септы, которая образуется средним слоем, разрушена и пространство между клетками заполнено ионами, поступившими из инкубационного раствора.
Таким образом, связывание и концентрирование ионов, лимитирующее токсическое воздействия на гриб, есть главнейшая протекторная функция всех слоев КС и она обусловлена их химической природой [1, 3, 5, 6]. Вместе с тем мы полагаем, что общебиологическая значимость каждого слоя выходит далеко за указанные рамки. Возможно, ПС принадлежит одна из решающих ролей в колонизации и выживаемости пеницилл в конкурентных условиях природной обстановки, преобразовании минерального вещества в запасной трофический фонд, контролировании транспорта микроэлементов. Его высвобождение во внутреннюю среду человека или высших животных и формирование в ней комплексов с тяжелыми металлами может индуцировать неблагоприятные специфические и неспецифические процессы.
Аналогичным образом реагируют на токсический прессинг клетки колонии, однако исход здесь чаще один - полное либо, что реже, частичное разрушение КС, то есть, ее слоев. Но степень их реакции различна у разных групп клеток (рис. 2 а). На остатках КС и плазмолемме также адсорбируются минеральные корпускулы и аккумулируются и модифицируются ионы. В итоге гетерополиморфные частицы могут отличаться своей массивностью (рис. 2 б). С повреждением плазмолеммы цитоплазма (Ц) сильно преоб-
Рис. 2. Электронная микроскопия ультратонких срезов поверхностной колонии P.canescens.
а - две крупные клетки с различными поведением ПС, склонностью к адсорбции минеральных частиц, трансформации ионов и плотностью Ц. Увеличение х 16000; б - продольный срез клетки с преимущественно поврежденной КС и крупными конгломератами. Ц ячеиста, вакуолизирована, ясно виден участок, ограниченный тонкой стенкой. Увеличение х 16000.
разуется: уплотняется, становится ячеистой, вакуоли-зируется, отдельные ее участки отграничиваются тонкой стенкой. Такое многообразие ультраструк-турных (и химических) эффектов со стороны КС колонии служит, по нашему мнению, показателем обильного спорообразования, которое обнаруживается уже на 5-е, 6-е сутки развития культуры, и сигналом к началу ее ускоренного старения.
Итак, в течение всего времени экстремального воздействия полностью разрушаются взаимосвязи слоев КС, их связи с плазмолеммой и другими мембранами, необходимые для создания сложной системы по регуляции обмена веществ и поддержания клеточного гомеостаза пеницилл. Последовательное функционирование каждого слоя, особенности его участия в геохимических преобразованиях, закономерные и быстрые адаптивные реакции есть не что иное как следствие единого целого - морфологии и физиологии организма микроскопических грибов.
Дополнение морфолого-функциональных изменений клеточной стенки [2] анализом разнонаправленного поведения ее отдельных слоев позволило дифференцировать в мицелии определенные клеточные морфотипы. Их количество еще требует уточнения, однако предварительно мы можем выделить следующие из них: 1) высокочувствительные. При контакте с геологической средой у некоторых клеток глубинного мицелия и колонии целиком разрушаются клеточная стенка вместе с плазмолеммой. Вероятно, их гибель запрограмирована генетически; 2) чувствительные. Это клетки, которые в процессе миковыщелачивания не могут, по видимому, регенерировать ПС, поэтому у них повреждается лишь клеточная стенка, хотя жизнеспособность самой клетки может поддерживаться на протяжении определенного времени; 3) умеренно устойчивые. У них в той или иной мере повреждается лишь поверхностный слой клеточной стенки без нарушения большинства функций. Это средние и крупные клетки глубинного мицелия, быстро восстанавливающие ПС; 4) высокоустойчивые (ареактивные). К ним отнесены мелкие (молодые) клетки, не способные трансформировать ионы и адсорбировать минеральные частицы в силу особых качеств либо структуры ПС. В меньшей степени к ним относятся средние и крупные клетки. К отдельной группе причислены еще два типа клеток: один, осаждая из раствора ионы и образуя частицы в виде монослоя, дополнительно формирует и/или фиксирует на стенке крупные конгломераты. К другому типу относятся такие «дефектные клетки» как полностью лишенный КС цитоплазматический комплекс. На наружной поверхности плазмолеммы им создаются крупные конгломераты, например, из коллоидного золота.
Разнообразие морфотипов в популяции грибных
клеток биологически оправдано, поскольку помогает сохранить жизнеспособность микромицетов: саморегуляцию, саморепродукцию, дифференцировку и устойчивость в осмотически неравновесной и токсической среде.
Выводы
1. Имитация взаимодействия грибов из рода Penicillium с техногенной средой обнаружила, что слои клеточной стенки в функциональном отношении проявляют себя как относительно самостоятельные структуры, назначение которых - защита организма от избыточных концентраций токсических ионов, минеральных и химических новообразований. Сорбция ионов - однотипная реакция для всех слоев, их модификация в полиморфные частицы - свойство, принадлежащее лишь поверхностному слою.
2. Вариантные изменения в структуре клеточной стенки на фоне стрессорных воздействий отражает реальное существование у пеницилл клеточных мор-фотипов, обеспечивающих им природную толерантность и видовую сохранность.
ЛИТЕРАТУРА
1. Давидова Е.Г., Каспарова С.Г. Сорбция тяжелых металлов клеточными стенками дрож-жей//Микробиология.-1992.-Вып.5.-С.838-842.
2. Катола В.М. Визуальный анализ геохимической деятельности микромицетов из рода Penicillium//Бюл. физиол. и патол. дыхания.-2003.-Вып.14.-С.83-86.
3. Мирчик Т.Г. Почвенная микология.-М.: МГУ, 1978.-220 с.
4. Сенцова О.Ю., Максимов В.Н. Действие тяжелых металлов на микроорганизмы М.: Наука, 1985.-Вып.20.-С.227-252.
5. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов.-М.: Наука, 1983.-247 с.
6. Benhamou N. Ultrastructural localization of carbohydrates in the cell of two pathogenic fungi: A comparative study//Mycologia.-1988.-Vol.80, №3.-P.324-337.
7. Ishicava T. Control of grouth and differention by ciclic AMP in fungi//Bot. Mag. Jokyo.-1989.-Vol. 102, №1067.-P.471-490.
8. Ford N.E., Maki J.S., Mitchel R. The role of metal-binding bacterial exopolymers in corrosion processes//Corrosion 87, San Francisco, Calif., March 913, 1987.-Pap. №380.-Houston:NACE, 1987.-7 p.
9. Scott J.A., Palmer S.J., Sage G.K. Metal adsorption by capsular polysaccharide coatings//Recent Dev. Ion Exchange:Int. Conf. Ion Exchange Processes, Wrexham, Apr. 3, 1987.-Pap.№16.-London; New York, 1987.-P.332-338.
□ □□
