CC BY
15
© Полянська В. П., Юнаш О. В., Коваленко Н. П., Саргош О. Д. УДК 579. 61
Полянська В. П., Кшаш О. В., Коваленко Н. П., Саргош О. Д.
ВИЗНАЧЕННЯ М1Н1МАЛЬНО1 ПРИГН1ЧУЮЧО1 КОНЦЕНТРАЦП
ЕФ1РНОТ ОЛИ ЕВГЕНОЛУ ДЛЯ КУЛЬТУРИ ГРИБ1В ВИДУ ASPERGILLUS FUMIGATUS
ВДНЗУ «УкраГнська медична стоматолопчна академiя» (м. Полтава)
microbiolumsa@gmail.com
Дослщження виконанi в межах НДР кафедри ппе-ни, екологiI та охорони пращ в галузi ВДНЗУ «Укра!-нська медична стоматологiчна академiя» м. Полтави «Наукове обфунтування профiлактики негативного впливу окремих чинниюв довкiлля на якють життя i стан здоров'я дтей в умовах геохiмiчноI провЫцп», № державно! реeстрацiI 0111и008522.
Вступ. Останнiм часом бiльшiсть дослiдникiв привертають увагу до можливостi пошуку та засто-сування екологiчно чистих технолопй та бiологiчних методiв боротьби з патогенними мiкроорганiзмами. Перспективним напрямком е використання фггопре-паратiв та ефiрних олiй.
Ефiрнi олií, якi е природним концентратом фггон-цидiв, являють собою багатокомпонентнi органiчнi сполуки альдегщв (цитронелаля, цитраля), фенолiв (тимола, евгенола, карвакрола, анетола, евкалтто-ла), монотерпенових спирав, кетонiв та iнших вуг-леводнiв. Бiльшiсть хiмiчних сполук, що входять до складу ефiрних олм, зумовлюють антимiкробнi, бак-терициднi, антивiруснi, протизапальнi, iмуномоделю-ючi властивостi. Протимiкробна активнiсть ефiрних олiй щодо гемолiтичного стафiлокока, стрептококiв, представникiв тифо-дизентерiйноI групи мiкроорга-нiзмiв доведена у наукових дослщженнях Рамазано-во! Н. Х. [10], Капелева О. I. та Ыш. [6]; фунпцидний вплив ефiрноI олií лофанту ганусового на Мюговрошт
canis, Trichophyton rubrum, Candida albicans - у роботах Великородова А. В. i Ковальова В. Б. [4], пригы-чуючу дю ефiрноI олп чаберу садового на Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Candida albicans встановили Mihajilov-Krstev та Radnovic [14], м^мальну пригы-чуючу концентрацiю ефiрноI олп монарди дудчасто' на Aspergillus fumigates визначено у дослщженнях Полянсько! В. П. та iн. [9]. Противiрусна активнiсть ефiрних олiй доведена у роботах С. С. Солдатченко, Кащенко Г. Ф., А. В. Пщаева [11], а проведення курсу аромотерапи знижувало захворюванiсть на ГРВ1 у 1,5-2,8 рази [3].
За лггературними даними широкого застосування у медицин набуло використання евгенолу (4-алт-2-метоксифенол), який вiдноситься до групи фенолiв i мае антибактерiальнi, протизапальы, знеболюючi властивостi [8]. Достатньо дослщжена дiя евгенолу на гриби роду Candida, з'ясовано його вплив на в^ рулентнють дрiжджеподiбних грибiв [2]. Проте, не-достатньо вивчена фунпцидна дiя евгенолу на мще-лiальнi гриби. Серед мiцелiальних грибiв особливу увагу привертають представники роду Aspergillus (А. fumigatus, A. flavus, A. niger). Асперпли е природ-ними мешканцями фунту, можуть зустрiчатися у вод^ деяких продуктах харчування, вентиляцмних системах, на поверхнi листюв кiмнатних i декоративних рослин. Збтьшення кiлькостi спор у повiтрi спосте-
Таблиця 1.
Визначення м^мально'Г пригшчуючо'Г концентрацм ефiрноГ оли евгенолу методом серiйних розведень
Компоненти, мл Проб1рки
контроль 1 2 3 4 5 6 7
Бульйон Сабуро 1 1 1 1 1 1 1
Робочий розчин е<^рноУ оли евгенолу (0,5 мл е<^рно'|' оли + 0,5 мл спиртового розчину) 1 1 1 => ■= 1 > ■=> 1 С 1 1
Суспензiя спор у бульйош Сабуро 1 1 1 1 1 1 1 1
Розведення е<^рноУ оли 1 : 4 1 : 8 1 :16 1 : 32 1 : 64 1 : 128 1 : 256
Концентрацiя ефiрноi оли, мг/мл 267,4 133,7 66,8 33,42 16,7 8,35 4,17
Облк через 24 год рют - - - - - - рют
Облк через 72 год рiст - рют
рiгаeться пiд час ремонтних та конструкцмних po6iT примiщень, що призводить до pi3Koro падiння бюло-пчно! активностi повiтря. lнгаляцiйний шлях потра-пляння спор Aspergillus spp. з повгтря пiд час дихан-ня може бути причиною рестраторних захворювань людини i тварин [12,15]. Тому у рамках ефективно-го оздоровлення атмосферного повггря доцтьним е розширення спектру вивчення фунгiцидноI дм ефiр-них олiй на мiцелiальнi гриби.
Мета дослщження. Визначення мiнiмальноI фунгiостатичноI та фунгiцидноI концентрацiI ефiрно,i оли евгенолу для культури грибiв виду А. fumigatus.
Об'ект i методи дослщження. В якост основно! дослiджуваноI речовини використовували ефiрну олiю евгенолу (виробник ЗАО «О6З ВладМиВа», Россия). Для визначення м^мально! пригычуючо! кон-центрацiI олi,i евгенолу для культури грибiв застосо-вували метод сермних макророзведень. Для якiсного розведення олм в бульйонi Сабуро використовували спиртовий розчин [8]. Протигрибкову дю ефiрних олiй краще оцiнювати у рщких середовищах, оскiльки гiдрофобна природа бтьшост компонентiв ефiрноI ол^ перешкоджае однорiдному розповсюдженню цих речовин в агарi [16].
Приготування суспензiI спор. Суспензт спор тест-культури готували на бульйон Сабуро, концен-трацiю колоыеутворюючих одиниць в 1 мл суспен-зi! визначали стандартним методом за допомогою камери Горяева [7]. Пщраховували кiлькiсть спор мiнiмум у п'яти великих квадратах камери Горяева по дiагоналi або у кутах сгтки та в II середин при збiльшеннi мiкроскопа 15 х10. Готували два препара-ти. Пщрахунок спор у першому препаратi проводили в обох Ытках камери, у другому препарат - в однм iз сiток. Вираховували середню ктькють спор n. Сiтка камери Горяева складаеться з 225 великих квадра^в, об'ем 1 квадрата дорiвнюе 0,004 мм3. Якщо в 1 квад-
ратi (в 0,004 мм3) виявлено n колонiеутворюючих одиниць, то в 1 мл (в 1000 мм3) !х ктькють Х дорiвнюе: X = n х 1000:0,004; X = n х 250000, отже X = n х2,5х 106
Було досягнуто необхщно! для методу серiйних розведень концентрацп спор Aspergillus fumigatus у ктькост 2 х106 КУО/мл, що вщповщае оптичному стандарту мутностi 0,5 за McFarland [9,13].
Посiви спор грибiв iнкубували при температу-рi 26°С протягом 72 годин [1]. Через 24 години та через 72 годин Ыкубацп з пробiрок, у яких немае ознак росту, проводили поЫв на середовище Сабуро у чашки Петрi для визначення фунпостатичного та фунгiцидного ефекту.
В якост тест- культури використовували 5- 6 денну чисту культуру грибiв виду Aspergillus fumigatus.
Результати дослщження та 'Гх обговорення. Результати дослщження мiнiмальноI пригнiчуючоI концентрацп ефiрноI оли евгенолу для культури гри-бiв виду Aspergillus fumigatus представленi в табли-цях 1 i 2.
Як свiдчать результати, вiдображенi у табли-цях 1 i 2, пригычення росту грибiв виду Aspergillus fumigatus спостер^алось у живильних середовищах з концентращею ефiрноI оли евгенолу у дiапазонi 267,4 мг/мл - 8,35 мг/мл пюля iнкубацiI 24 години та 72 години i м^мальна пригнiчуюча концентра-цiя евгенолу для Aspergillus fumigatus становила 8,35 мг/мл. Вщомо. що евгенол представлений лг пофтьними молекулами,
якi можуть проникати мiж ацiльними ланками жирних кислот, тим самим порушуючи текучють i про-никнiсть мембран. Це впливае на регуляцю i функцю мембрано-асоцiйованих ферментiв, якi каталiзують синтез основних полюахаридних компонентiв кглтин-но! стiнки, у тому числi бета-глiкану, хiтину, маннану, що призводить до порушення росту кгмтин i морфогенезу оболонки [2].
Таблиця 2.
Концентращя ефiрноl олГГ (мг/мл) Тривал^ть шкубацп (години)
24 72
контроль Помутнiння середовища, поверхневий рiст культури бархатистого вигляду св™ого кольору Помутнiння середовища, поверхневий рют культури бархатистого вигляду, з добре розвиненим тгментованим мiцелieм сiро-зеленуватого кольору, наявнi конiдiальнi голiвки
267,4 Ознаки росту вiдсутнi, суспензiя без змiн Ознаки росту вщсутш, суспензiя без змш
133,7 Ознаки росту вщсутш, суспензiя без змiн Ознаки росту вщсутш, суспензiя без змш
66,8 Ознаки росту вщсутш, суспензiя без змiн Ознаки росту вщсутш, суспензiя без змш
33,42 Ознаки росту вщсутш, суспензiя без змш Ознаки росту вщсутш, суспензiя без змш
16,7 Ознаки росту вiдсутнi, суспензiя без змш Ознаки росту вщсутш, суспензiя без змш
8,35 Ознаки росту вщсутш, суспензiя без змш Ознаки росту вщсутш, суспензiя без змш
4,17 Помутншня середовища, поверхневий рют культури бархатистого вигляду св^лого кольору Активний рют культури, помутншня середовища, поверхневий рют культури бархатистого вигляду, з добре розвиненим тгментованим мiцелieм сiро-зеленуватого кольору, наявш конiдiальнi голiвки
Особливост1 росту тест-культури при культивуванш з еф1рною ол1ею евгенолу в рщкому поживному середовищ1
Таблиця 3.
Визначення фунгщидно'Г концентрацГГ ефгрноГ оли евгенолу
Тривалгсть ¡нкубацп (години) Концентрацгя ефгрноГ олГГ в пробгрцг,з якоГ виконано пересгв на щгльне середовище Сабуро, мг/мл
Контроль 267,4 133,7 66,8 33,42 16,7 8,35 4,17
24 рют рют
72 рют рют
Результати дослщження мiнiмальноI фунгiцидно,i концентрацп оли евгенолу для культури грибiв виду Aspergillus fumigatus представленi в таблиц 3.
При аналiзi результатiв, вiдображених в таблиц 3, встановлено, що мiнiмальна фунгiцидна концен-трацiя ефiрноI оли евгенолу через 24 год та 72 год Ыкубаци становить 8,35 мг/мл. При цьому, фунпста-тична дiя евгенолу на гриби виду Aspergillus fumigatus за даних розведень не спостерталась.
Висновки
1. Ефiрна олiя евгенолу володiе вираженою фун-гiцидною активнiстю щодо культури грибiв виду Aspergillus fumigatus.
2. Мiнiмальна прип-лчуюча концентрацiя ефiрноI оли евгенолу через 24 та 72 години шкубаци станови-ла 8,35 мг/мл.
3. М^мальна фунгiцидна концентрацiя ефiрноI оли евгенолу становила 8,35 мг/мл.
4. Подовження експозици впливу оли евгенолу на культури грибiв виду Aspergillus fumigatus не сприяло зростанню II фунгiцидноI активностi.
5. Бактерiостатична активнють ефiрноI оли евгенолу щодо культури грибiв виду Aspergillus fumigates не виявлена.
Перспективи подальших дослщжень. У по-дальшому потребуе дослiдження вивчення фунпцид-но! ди евгенолу на Ыии види грибiв роду Aspergillus.
Л^ература
1. Билай В.И. Основы общей микологии: Учеб. пособие для вузов. - 2-е изд., перераб и доп. / В.И. Билай. - К.: Вища шк.: Главное
изд-во, 1980. - 360 с.
2. Брага П.С. Эвгенол и тимол по отдельности и в сочетании вызывают морфологические изменения оболочки Candida albicans /
П.С. Брага, М. Даль Сассо, М. Альфири // Физиотерапия. - 2007. - Т. 78. - № 6.-С. 396-400.
3. Вахова Е.Л. Аромофитотерапия в профилактике острых респираторных заболеваний у детей / Е.Л. Вахова // Курортные ведо-
мости. - 2005. - № 3. - C. 52-53.
4. Великородов А.В. Изучение химического состава и противогрибковой активности эфирного масла Lophanthus anisatum Benth /
А.В. Великородов, В.Б. Ковалев, А.Г. Тырков, О.В. Дехтярев // Химия растительного сырья. - 2010. - № 2. - С. 143-146.
5. Войткевич С.А. Эфирные масла для парфюмерии и ароматерапии / С.А. Войткевич. - М.: Пищевая промышленность, 1999. -
284 с.
6. Капелева О.И. Антибактериальные и фитонцидные свойства котовника лимонного / О.И. Капелева, Н.М. Макарчук. - В кн.:
Актуальные вопросы курортной фитотерапии. - Пятигорск, 1985. - C. 64-65.
7. Методы экспериментальной микологии. Справочник / И.А. Дудка, С.П. Вассер, И.А. Элланская [и др.]; Под ред. В.И. Билая. -
К.: Наук. думка, 1982. - 551 с.
8. Николаевский В.В. Биологическая активность эфирных масел / В.В. Николаевский, А.Е. Еременко, И.К. Иванов. - М.: Меди-
цина, 1987. - С. 144.
9. Полянська В.П. Визначення мЫмальноУ пригшчуючоУ концентрацп ефiрноi олп Monarda fistulosa для культури грибiв виду
Aspergillus fumigates / В.П. Полянська, О.В. Юнаш, Н.П. Коваленко, О.Д. Саргош // Свп" медицини та бюлогп. - 2015. -№ 2 (50). - С. 168-172.
10. Рамазанова Н.Х. О перспективном использовании некоторых эфиромасличных растений / Н.Х. Рамазанова. - В кн.: Актуальные вопросы изучения и использования эфиромасличных растений эфирных масел. - Симферополь, 1980. - C. 125-126.
11. Солдатенко С.С. Аромотерапия. Профилактика и лечение эфирными маслами / С.С. Солдатенко, Г.Ф. Кащенко, А.В. Пида-ев. - Симферополь: Таврида, 1999. - 206 с.
12. Сергеев А.Ю. Грибковые инфекции: Рук. для врачей / А.Ю. Сергеев, Ю.В. Сергеев. - Москва: Бином-Пресс, 2003. - 439 с.
13. Aspergillosis: From Diagnosis to Prevention / Edited by Alessandro C. Pasqualotto. - Springer Science+Business Media B.V., 2010. -1027 p.
14. Mihajilov-Krstev T Antimicrobial activiti of Satureja hortensis L. essential oil against pathogenic microbial strains / T Mihajilov-Krstev, D. Radnovic, D. Kitic, Z. Stojanovic-Radic and B. Zlatkovic // Biotechnol. & Biotechnol. - 2009. - 23 (4). - P. 1492-1496.
15. Polianska V.P. Medical mycology: textbook / V.P Polianska, N.P Kovalenko, I.A. Kovalenko. - Poltava: PUET 2012. - 80 p.
16. Sharma N. Tripathi A 2008. Effects of Citrus sinensis (L.) Osbeck epicarp essential oil on growth and morphogenesis of Aspergillus niger (L.) / N. Sharma. - Van Tieghem. Microbiol Res. - 163. Р. 337-344.
УДК 579. 61
ВИЗНАЧЕННЯ М1Н1МАЛЬНОТ ПРИГН1ЧУЮЧОТ КОНЦЕНТРАЦГГ ЕФ1РНОТ ОЛИ ЕВГЕНОЛУ ДЛЯ КУЛЬТУРИ ГРИБ1В ВИДУ ASPERGILLUS FUMIGATUS
Полянська В. П., Кшаш О. В., Коваленко Н. П., Саргош О. Д.
Резюме. Широке використання ефiрноI олп евгенолу обумовлене його антимiкробними, протизапаль-ними, знеболюючими властивостями. Проте, недостатньо вивчена фунпцидна активнють евгенолу щодо
мiцелiальних rpM6iB. Ми вивчали фунпцидну дiю олií евгенолу на гриби виду Aspergillus fumigatus шляхом ви-значення II мiнiмальноI фунгiостатичноI та фунпцидно'| концентрацiI. Встановлена протигрибкова дiя ефiрноI олií на Aspergillus fumigatus у дiапазонi 267,4 мг/мл - 8,35 мг/мл, виявлена м^мальна фунпцидна активнiсть олiI евгенолу на гриби виду Aspergillus fumigatus у концентрацп 8,35 мг/мл. Ефiрна олiя евгенолу може бути використана як протигрибковий заЫб.
Ключовi слова: ефiрна олiя, евгенол, гриби виду Aspergillus fumigatus, м^мальна пригнiчуюча концен-трацiя, м^мальна фунгiостатична концентрацiя, мiнiмальна фунгiцидна концентра^я.
УДК 579. 61
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИНИМАЛЬНОЙ УГНЕТАЮЩЕЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ЭФИРНОГО МАСЛА ЭВГЕНОЛА ДЛЯ КУЛЬТУРЫ ГРИБОВ ВИДА ASPERGILLUS FUMIGATUS
Полянская В. П., Кинаш О. В., Коваленко Н. П., Саргош О. Д.
Резюме. Широкое использование эфирного масла эвгенола обусловлено его антимикробными, противовоспалительными, обезболивающими свойствами. При этом, недостаточно изучена фунгицидная активность эвгенола по отношению к мицелиальным грибам.
Мы изучали фунгицидное действие эвгенола на грибы вида Aspergillus fumigates путем определения его минимальной фунгиостатической и фунгицидной концентрации. Установлено противогрибковое действие эфирного масла эвгенола на Aspergillus fumigates в диапазоне 267,4 мг/мл - 8,35 мг/мл, выявлена минимальная фунгицидная активность эвгенола на грибы вида Aspergillus fumigatus в концентрации 8,35 мг/мл.
Эфирное масло эвгенола может быть использовано как противогрибковое средство.
Ключевые слова: эфирное масло, эвгенол, грибы вида Aspergillus fumigatus, минимальная угнетающая концентрация, минимальная фунгиостатическая концентрация, минимальная фунгицидная концентрация.
UDC 579. 61
DETERMINATION OF EUGENOL ESSENTIAL OIL MINIMUM INHIBITORY CONCENTRATION FOR FUNGI CULTURE ASPERGILLUS FUMIGATUS
Polianska V. P., Kinash O. V., Kovalenko N. P., Sargosh O. D.
Abstract. Recently, most researchers focus attention on possibilities of development and application of ecologically clean technologies and biological methods of pathogenic microorganisms control. The use of phytoprepa-rations and essential oils is prospective direction in this respect.
Essential oils, that are the natural concentrates of phytoncids, represent a multi-component organic aldehydes compounds (citronellal, citral), phenols (thymol, eugenol, carvacrol, anethole, eucalyptole), monoterpenic alcohols, ketones and other hydrocarbons. Most of the chemical compounds comprising essential oils, condition the antimicrobial, antibacterial, antiviral, anti-inflammatory, immune modulating properties.
However, antifungal effect of eugenol on filamentous fungi is underinvestigated. Among filamentous fungi, the representatives of genus Aspergillus (A. fumigatus, A. flavus, A. niger) focus particular attention.
The aim of the study was to determine the minimum fungistatic and fungicidal concentration of eugenol essential oil for the fungi culture of species A. fumigatus.
According to obtained results, growth inhibition of fungi species Aspergillus fumigatus was observed in nutrient medium with concentration of eugenol essential oil, ranging 267,4 mg/ml - 8,35 mg/ml after incubation for 24 hours and 72 hours and minimum inhibitory eugenol concentration for Aspergillus fumigatus was 8,35 mg/ml. It is known, that eugenol is represented by lipophilic molecules that can penetrate between acyl chains of fatty acids, thereby affecting fluidity and permeability of membranes. This influences on the regulation and function of membrane-associated enzymes, that catalyze synthesis of the main polysaccharidic components of cell wall, including beta-glycan, chitin, mannan, which leads to cell growth disorder and membrane morphogenesis. When analyzing findings, it was stated that the minimum fungicidal concentration of eugenol essential oil in 24 hours and 72 hours of incubation is 8,35 mg/ml. Thus, fungistatic effect of eugenol on fungi species Aspergillus fumigatus according to these dilutions was not observed.
Conclusions
1. Eugenol essential oil has strong fungicidal activity towards the fungi cultures of species Aspergillus fumigatus.
2. Minimum inhibitory concentration of the eugenol essential oil in 24 and 72 hours of incubation amounted to 8,35 mg/ml.
3. The minimum fungicidal concentration of eugenol essential oil amounted to 8,35 mg/ml.
4. Elongation of eugenol oil effect exposure on the cultures of fungi species Aspergillus fumigatus did not cause the growth of its fungicidal activity.
5. The bacteriostatic activity of eugenol essential oil towards the fungi culture species Aspergillus fumigatus was not revealed.
Keywords: essential oil, eugenol, fungi culture Aspergillus fumigatus, minimum inhibitory concentration, minimum fungistatic concentration, minimum fungicidal concentration.
Рецензент - проф. Лобань Г. А.
Стаття надшшла 18.03.2016 року
