Вивчення трансепітеліального електричного опору культури клітин кишковика свині в присутності трихотиценових мікотоксинів Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

УДК 619:615.918:633.16:58228.1

Цибульський Д.В. астрант © Сумський нацюнальний аграрный утверситет

ВИВЧЕННЯ ТРАНСЕП1ТЕЛ1АЛЬНОГО ЕЛЕКТРИЧНОГО ОПОРУ КУЛЬТУРИ КЛ1ТИН КИШКОВИКА СВИН1 В ПРИСУТНОСТ1 ТРИХОТИЦЕНОВИХ М1КОТОКСИН1В

Анотащя. У статт1 наведена тформащя щодо негативного еплиеу трихотиценоеих мтотокситв на ркт i розеиток клтин кишкоеику свит.

Ключовi слова: мкотоксикози, деоксишваленол, трансепiтелiальний електричний отр, ентероцит, бар'ерна функщя.

Вступ. Мжотоксикози - захворювання, що розвиваються у тварин та птищ внаслщок пощання kopmîb, контамшованих мiкотоксинами, якi е продуктами бюсинтезу токсигенних мiкромiцетiв i3 родiв Aspergillus, Pénicillium, Fusarium й ш. Бшьшкть мiкотоксинiв володiють високою токсичнiстю, а деяю зумовлюють канцерогенний, тератогенний, мутагенний, ембрiотоксичний, дисбактерiозний, iмунодепресивний, алергенний, дерматонекротичний ефект [ 3 ].

Спричинене мжотоксинами отруення тварин та птищ завдае господарствам значних економiчних збитюв через втрати кормiв, зниження ïx кормово1 цiнностi, пiдвищення чутливостi тварин до мжозних, бактерiальниx i вiрусниx захворювань, загибель тварин, витрати на проведення лiкувальниx та профiлактичниx заxодiв [ 2 ].

Одними з найнебезпечшших е триxотиценовi мiкотоксини, що продукуються, в основному, грибами роду Fusarium. Серед них основними е Т-2 токсин, шваленол, деоксишваленол та ш.[ 1 ].

Токсична дiя триxотиценiв проявляеться головним чином у формi запалення слизових травного тракту, iнодi до некротичного. Вони вражають також нервову й серцево-судинну системи, печшку, пригнiчують iмунiтет. Умовами для утворення даних токсишв е тдвищена вологiсть й низька температура. Як правило, в одному продукт знаходять вщразу декiлька триxотиценiв[ 4, 5 ].

Кишковик е головним вмктилищем забруднюючих речовин та токсишв, що мютяться у кормi та вод^ й являе собою перший бар'ер тд час проковтування контамшованого корму з можливими високими концентращями мiкотоксинiв.

Кищковик мае бар'ерну функщю, що забезпечуеться епiтелiальними кишковими кл^инами, якi забезпечують, з одного боку фiзичний бар'ер, а з шшого, беруть участь у здйсненнi мiсцевоï iмунноï реакцiï (Eckmann et al. , 1995 ; Pitman et Blumberg, 2000). ïxня участь у вродженому й набутому iмунiтетi вщбуваеться за допомогою рiзниx меxанiзмiв, таких як: продукщя

© Науковий кер1вник Т.1.Фотша Цибульський Д.В., 2008

274

мукусу (слизу), антибактерiальних пептидiв, продукщя Ig A, запальних цитокмв (Oswald, 2006). Численш фактори, таю як: гормони, протеази, цитокши, нейротрансм^ери, а також ксенобiотики можуть порушувати структуру й функцiю кишечного епiтелiального бар'еру.

Кишковик, який е першим бар'ером тд час проковтування контамiнованого корму, може вражатися дiею високих концентрацiй мiкотоксинiв, якi в свою чергу можуть порушувати здатнсть ентероцитсв тдтримувати бар'ерну функцiю (Lewis et al.,1995).

Лiнiя клiтин IPEC - 1, що використовувалась у дослвд, була отримана з кишкового епiтелiю голодно! та клубово! кишки новонародженого поросяти. Фiбробласти були видалеш послiдовними етапами трипсишзаци й вибiрковоl пересадки. Ця лiнiя клiтин може культивуватися до 100 пасажiв, не змшюючи при цьому характеристик росту й транспортування (Pinton, 2007).

Метою нашо¥ роботи було вивчення трансепiтелiального електричного опору ( TEER -Transepithelial Electrical Resistance) культури кл^ин кишковику свиш.

Матер1али та методи : Дослщи виконувались на базi фармаколопчно-токсиколопчно! лаборатори Нацiонального iнституту сшьськогосподарських дослiджень (INRA) м. Тулуза, Франщя.

В дослiдах проводилось вимiрювання трансепiтелiального електричного опору (ТЕЕО) культури кл^ин кишковику свинi (IPEC-1), яка вирощувалася в присутностi трихотиценових мiкотоксинiв (деоксишваленол, нiваленол, 15-О-Ацетил-4-деоксинiваленол та 3-Ацетилдеоксишваленол) напротязi 11 дiб.

ТЕЕО е корисним параметром для кшьккного вираження бар'ерно! функци в ендотелiальних й епiтелiальних клiтинах. Впродовж останнiх двох десятирiч метод вимiру ТЕЕО став ушверсальним, зручним, надiйним та неруйшвним методом, який добре зарекомендував себе щодо визначення й контролю росту культур клггин in vitro [14 ],[ 9 ],[7 ].

Для вимiрювання використовували фiльтри для культури кл^ин (cell culture inserts), по 1 для кожного зразка (контроль, ДОН, шваленол, 15-АДОН та 3-АДОН). В кожен з них додавали 0,5 мл. клггин у концентраци 100000 0 / фшьтр. Зовш також додавли середовище - 1 мл. (рис.1). Через 2-3 доби, коли кл^ини розмножились у фшьтр^ замшюемо середовище для пролiферацil на середовище, яке сприяе диференщаци кл^ин. В подальшому диференцiйне середовище замшюемо кожш 2 доби й додаемо новий розчин мжотоксишв. Вимiрювання ТЕЕО здшснювали щодня в один i той же чac за допомогою вольтометру EVOM (X). Фiнальна концентращя для кожного токсину у розчиш становить 5цМ. Впродовж дослiду зразки залишали в термостатi при t 390С в присутностi СО2 на рiвнi 5%.

Впродовж всього етапу дослщженнях використовували токсин деоксинiваленол, шваленол, 15-О-Ацетил-4-деоксишваленол та 3-Ацетилдеоксинiваленол (виробник Sigma, USA), культуру кл^ин кишечнику свиш IPEC, фiльтри для культури кл^ин (Falcon). Для пролiферацil кл^ин використовували поживне середовище, яке складаеться iз: середовища DMEM HAM F-12 - Sigma, USA, сироватки телячого ембрюну, L- глютамшу (200мМ) виробник - Eurobio (Франщя), водний розчин антибютиюв (пенщилшу й

275

стрептомщину) по 10 000 ul/ml, рщини ITS ( шсулш-(5^/т1), трансферин (5^g/m1) й селен (5ng/m1)) та EGF (етдермальний фактор росту)- 100^g/m1. Для диференщаци - такий самий склад, але замють сироватки телячого ембрiону додавали дексаметазон (20 ^g/ml) [11, 13 ]. Рис.1 Схема роташування фiльтру.

П 5

4

2

3

Позначення:

1. Мембрана

2. Клiтини

3. Поживне середовище

4. Фiльтр

5. Розташування електродiв вольтометра

Результати дослщжень i обговорення. При вимiрюваннi електричного опору культури клiтин кишковику свиш (1РЕС), яка вирощувалася в присутност деоксинiваленолу, нiваленолу, 15-О-Ацетил-4-деоксинiваленолу та 3-Ацетилдеоксишваленолу, вiдмiчено, що в присутностi кожного з зазначених токсишв спостерiгаeться рiзне пригнiчення росту клiтин.

1стотне зниження показниюв вiдбуваeться в першi 2-4 дш. Потiм спостерiгаeться незначне тдвищення i стабiлiзацiя показникiв в межах норми ( контроль, 3-Ацетилдеоксишваленол) або подальше !х зниження (деоксинiваленол, шваленол, 15-О-Ацетил-4-деоксинiваленол). Максимальне пригнiчення росту кл^ин, згiдно показникiв ТЕЕО, вiдбуваeться приблизно на 8 - 10 день.(рис.2).

Таким чином встановлено, що:

276

1.PicT показниюв ТЕЕО культури кл^ин IPEC в присутност деоксiнiваленолу, нiваленолу, 15-О-Ацетил-4-деоксiнiваленолу та 3-Ацетилдеоксiнiваленолу уповiльнюeться по pi3HOMy для кожного з токсишв.

2.Найтоксичнiшим серед представлених е 15-О-Ацетил-4-деоксiнiваленол.

3.Найменшу токсичнiсть щодо культури клiтин IPEC мае 3-Ацетилдеоксiнiваленол.

Вiдповiдно до наведених результат можемо сказати, що 15-О-Ацетил-4-деоксiнiваленол порiвняно з шшими представленими мiкотоксинами здiйснюе найсильнiший негативний вплив на кл^ини кищковика свиш, що обумовлюе iстотне пригнiчення його бар'ерно! функци, яке може призвести до зниження мкцево! iмунноl реакци та пiдвищення сприйнятливостi до збудниюв iнфекцiйних хвороб.

Рис.2 Визначення трансепiтелiального електричного опору ( TEER -Transepithelial Electrical Resistance) культури кл^ин IPEC-1 в присутностi трихотиценових мжотоксишв (деоксинiваленол, нiваленол, 3 -ацетилдеоксишваленол й 15 -О-ацетил-4-деоксинiваленол).

Л1тература

1. Ахметов Ф.Г., Иванов А.В., Тремасов М.Я. Профилактика микотоксикозов у животных // Ветеринария. - 2001. - № 2. - С. 47-50.

2. Волков М. Системний мжотоксиколопчний контроль кормiв -гаранта профшактики мiкотоксикозiв тварин та птищ // Вет. Медицина Украши. - 2005. - №3. - С. 20.

3. Гогин А.Е. Микотоксикозы: значение и контроль // Ветеринария, 2006. - №3. - С. 9-11.

4. Труфанова В. Частота контамшаци мжотоксинами кормiв для птищ // Вет. Медицина Украши. - 2004. - №9. - С. 26-28.

277

5. Хмельницький Г.О., Волков М.В. Максимально допустимi piBrn вмкту мжотоксишв у кормах для сшьськоговподарських тварин та методи ix визначення.- К.: ГУВ МСГ i П Украши, 1997. - 1с.

6. D'Mello, J.P.F., Placinta, C.M. and MacDonald, A.M.C. Fusarium mycotoxins: a review of global implications for animal health, welfare and productivity // Anim. Feed Sci. Technol. - 1999.- N80. - P. 183-205.

7. Eriksen,G.S.,Petterson,H.,Lundh, T.,2004. Comparative cytotoxicity of deoxynivalenol,nivalenol,their acetylated derivatives and deepoxy metabolies. www.sciencedirect.com

8. Fink-Gremmels, J. Mycotoxins: their implications for human and animal health // Veterinary Quarterly. - 1999. - N21. - P. 115-120.

9. Gonzalez-Vallina R, Wang H, Zhan R, Berschneider HM, Lee RM, Davidson NO & Black DD (1996). Lipoprotein and apolipoprotein secretion by a newborn piglet intestinal cell line (IPEC-1). Am J Physiol 271, G249-259.

10. J.Christopher Young, Ting Zhou,Hai Yu,Honghui Zhu,Jianhua Gong. Degradation of trichothecene mycotoxins by chicken intestinal microbes - 2006. www.sciencedirect.com

11. Taranu,I., Marin,D.E., Bouhet, S., Pascale, F., Bailly, J.D., Miller, J.D., Pinton, P., Oswald, I.P., 2005. Mycotoxin fumonisin B1 alters the cytokine profile and decreases the vaccinal antibody titer in pigs. www.sciencedirect.com

12. Schierack P, Nordhoff M, Pollmann M, Weyrauch KD, Amasheh S, Lodemann U, Jores J, Tachu B, Kleta S, Blikslager A, Tedin K, Wieler LH. Characterization of a porcine intestinal epithelial cell line for in vitro studies of microbial pathogenesis in swine. Histochem Cell Biol. 2006 Mar;125(3):293-305. Epub 2005 Oct 8.

13. Bouhet S, Hourcade E, Loiseau N, Fikry A, Martinez S, Roselli M, Galtier P, Mengheri E, Oswald IP. The mycotoxin fumonisin B1 alters the proliferation and the barrier function of porcine intestinal epithelial cells.Toxicol Sci. 2004 Jan;77(1):165-71. Epub 2003 Nov 4.

14. Sutton SC, et al. Simultaneous in vitro measurement of intestinal tissue permeability and transepithelial electrical resistance (TEER) using Sweetana-Grass diffusion cells.(1992 ) Pharm Res. Mar; 9(3):31

Summary

Tsybulskyy D.V., Sumy national agrarian university STUDING OF TRANSEPITHELIAL ELECTRICAL RESISTANCE OF CULTURE OF CELLS OF INTESTINE OF A PIG AT PRESENCE OF TRICHOTHECENE MYCOTOXINS.

Information about negative influence of trichothecene mycotoxins on the growing and development of culture of cells of intestine of a pig is presented in the article.

Key words: mycotoxicosis, deoxynivalenol, transepithelial electrical resistance, enterocyte, barrier function.

Стаття надшшла до редакцИ 9.09.2008

278