CC BY
301
УДК 634.11+634.13:581.16:581.144.3
ВИТРИФИКАЦИЯ ПОБЕГОВ IN VITRO: АНАТОМИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ И ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ
О.В. МАТУШКИНА, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник
И.Н. ПРОНИНА, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник
Е.Н. ТКАЧЁВ, кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник
ВНИИС им. И.В. Мичурина Россельхозакадемии E-mail: [email protected]
Резюме. В статье рассмотрено влияние основных факторов культивирования in vitro на витрификацию побегов яблони и груши, а также особенности их анатомического строения. Наиболее подвержены гипергидрации подвои яблони ПБ 9 и груши ПГ 12 (до 100 %). У витрифицированных растений наблюдаются утолщение стебля, удлинение и искривление листьев из-за морфологического изменения тканей и увеличения размера клеток, изменения в строении устиц. Регенерационная способность таких побегов на этапе собственно микроразмножения ниже, чем у нормально развитых, в 2-3 раза, а на этапе укоренения - в 1,6-2,1 раза. Однако они лучше адаптировались и развивались в нестерильных условиях. Для решения проблемы витрификации в зависимости от генотипа целесообразно снижать концентрацию БАП в среде до 0,5 мг/л, либо использовать более слабый цитокинин - кине-тин или безгормональные питательные среды, разбавленные по минеральному составу.
Ключевые слова: яблоня, груша, витрификация, in vitro, побег, лист, устьица.
Во многих лабораториях при культивировании растений in vitro сталкиваются с проблемой сильного обводнения растительного материала, известного как витрификация (гипергидра-ция, стекловидность). Такое состояние характеризуется как морфологическое отклонение микрорастений, которые теряют способность размножаться и акклиматизироваться. У витрифицированных побегов наблюдается утолщение стебля, увеличение размера клеток, удлинение и искривление листьев. При этом из-за сильного обводнения и изменения структуры листья и стебли кажутся прозрачными, меняют форму.
Исследователи по-разному объясняют механизм образования витрифицированных побегов и предлагают разные пути решения этого физиологического отклонения. Некоторые [1]
говорят о наличии связи между аномалиями в развитии побегов с регуляторами роста в питательной среде, другие [2] о влиянии на устойчивость к витрификации различных форм углеводов.
В связи с этим цель наших исследований - не только изучение основных факторов, влияющих на витрификацию побегов и оптимизация условий культивирования, но и определение особенностей их анатомического строения.
Условия, материалы и методы. Объекты исследований: клоновые подвои яблони - 54-118, 62-396, 57-545, Р 60, 76-6-13, 76-6-6, 76-8-13, ПБ 9, груши -ПГ 12 и сорт яблони Лобо. Основной средой служила среда Кворина-Лепуавра. Растения культивировали при температуре воздуха 24±2оС, освещенности 2...3 тыс. люкса и 16-часовом фотопериоде. Гистологические исследования проводили с использованием
Рис. 1. Анатомическое строение нормально развитых и витрифицированных побегов подвоя груши ПГ 12 (слева направо): внешнее различие А и Б; устьица листьев В и Г; стебель Д и Е.
Таблица 1. Размеры устьиц нормальных и витрифицированных листьев подвоя груши ПГ 12, мкм
Лист Диаметр Длина Ширина Ширина устьичной щели
Нормальный Витрифицированный 31,5±0,18 28,2±0,13 31,2±0,15 29,4±0,47 22 21 1+ 1+ 13 00 СП 7,6±0,16 5,2±0,22
программно-аппаратного комплекса «ВидиоТест мастер-морфология 4.0».
Результаты и обсуждение. По нашему мнению, растения in vitro часто испытывают стресс, который создается условиями культивирования и зависит от состава питательной среды, размера сосудов, продолжительности и частоты пассажей, температурного и светового режимов и др.
Так, в наших исследованиях витрификация побегов нередко проявлялась уже во 2 пассаже и варьировала в зависимости от генотипа от 7,6 % у подвоя яблони 62-396 до 53,0 % у сорта яблони Лобо, достигнув у
Таблица 2. Последействие витрификации на укореняемость микропобегов
Подвой Витри- фикация Укореняемость через . . недель, % Число корней, шт. Длина корней, см
1 1 2 1 3 4
ПГ 12 — 31,4 84,9 90,7 94,1 а* 3,6 1,6
+ 0,0 29,8 55,8 58,9 в 2,2 3,4
Р 60 — 10,0 10,0 20,0 20,0 с 2,3 2,7
+ 0,0 9,5 9,5 9,5 с 1,3 1,5
НСР05 1,0 1,2
* - 1-критерий Дункана (наличие одинаковых букв при цифровых показателях указывает на отсутствие различий при Р=0,05).
отдельных генотипов яблони (ПБ 9) и груши (ПГ 12) при последующих субкультивированиях 100 %. Культивирование подвоев яблони 54-118, 76-6-13, ПБ 9 на средах с концентрацией БАП в среде повышенной до 3,0 мг/л, не только увеличивало гипергидрацию побегов (у 54-118 на 24,3 %, у ПБ 9 на 60,3 %), но и снижало количество побегов пригодных для укоренения в 2-5 раз в зависимости от генотипа.
При этом следует заметить, что даже в одном и том же культуральном сосуде можно наблюдать обводнение как всех пролифирирующих побегов, так и отдельных, наряду с нормально развитыми. Регенерационная способность побегов без признаков гипергидрации в 2-3 раза выше, чем у витрифицированных, вне зависимости от гормонального состава питательной среды.
Изучение особенностей анатомического строения витрифицированных побегов яблони и груши показало, что визуально их листья в значительной мере отличаются от нормально развитых, они мелкие и искривленные.
В ходе гистологических исследований установлено, что клетки эпидермиса таких побегов характеризу-
1400
1200
1000
800
г
* 600 400 200 0
т
гР 1
*■ 1
I 1
й 1 | 1
г 1 [* 1 г- 1 г 1
нормальные витрифицированные 54-118
Рис. 2. Размеры тканей нормальных и витрифицированных побегов подвоев яблони и груши: □ - общая толщина листа, мкм; □ - диаметр стебля, мкм; ■ - диаметр сердцевины, мкм
ются вытянутой формой и менее развитой сосудистой системой. Структура тканей витрифицированных листьев более однородна, отсутствует четкая дифференциация палисадного и губчатого мезофилла. Помимо этого отмечена меньшая толщина кутикулярного слоя листьев. Значительные различия выявлены в строении устьиц. У нормально развитых листьев они были широко открыты (рис. 1 В), в то время, как у витрифицированных - искривлены и имели узкие устьичные щели (рис. 1 Г; табл. 1). В клетках тканей листьев с признаками обводенности отмечено очень малое количество хлорофильных зерен.
Как правило, стебли гипергидрированных побегов были короче и толще, чем у нормальных (рис. 2). Кроме того, отмечены изменения в строении тканей: клетки паренхимы тканей коры крупнее с более тонкими клеточными стенками и большими межклетниками, а клетки эпидермиса у нормальных тканей имели меньшие размеры, по сравнению с витрифицированными (рис. 1 Д, Е).
По данным [3], различия в размерах клеток между витрифицированными и нормальными тканями может быть связано с вызванным высоким давлением ускорением диффузии воды в клетках. Помимо этого, согласно нашим исследованиям, одной из причин индукции изменений может выступать низкая транспирация, обусловленная деформацией устьиц и строением покровных тканей.
Поэтому для снижения уровня обводненности тканей мы вводили в состав среды более слабый цитокинин -кинетин. Результаты исследований свидетельствуют, что «выпрямление» побегов у подвоев 54-118, 76-6-13 и 76-8-13 наблюдается при культивировании эксплантов на средах с БАП 1,0 мг/л и кинетин 5,0 мг/л (рис. 3).
Увеличение концентрации кинетина до 10,0 мг/л, а также совместное введение в состав среды БАП и кинетина повышает уровень витрификации у всех изученных форм. Наиболее подверженных гипергидрации тканей был подвой яблони ПБ 9, у которого стекловидность проявлялась во всех вариантах опыта, в том числе на среде с кинетином 5,0 мг/л, где формировалось на 20,0 % витрифицированных побегов больше, чем в контроле. Снизить их количество и получить до 25 %
нормально развитых микрорастений удалось только при использовании безгормо-нальных питательных сред, разбавленные по минеральному составу.
Наименьшее обводнение тканей отемеченно у подвоя яблони 76-6-13, у которого только на среде с кинетином 10,0 мг/л наблюдалась незначительная гипергидрация.
Стекловидность побегов существенно влияла и на корнеобразование. Укореняемость «выпрямленных» после витрификации микро-
нормальные витрифицированные пг 12
Рис. 3. Влияние цитокининов на витрификацию побегов яблони: □ - БАП 1,0 мг/л; □ - БАП 1,0 мг/л + Кин 2,5 мг/л; 0 - Кин 5,0 мг/л; Н - Кин 10,0 мг/л.
побегов была в 1,6 (ПГ 12)-2,1 (Р 60) раза меньше, чем у изначально нормальных растений (табл. 2). У таких
побегов наблюдалась низкая скорость корнеобразо-вания, а у растений-регенерантов хуже развивалась корневая система. В то же время необходимо отметить, что они лучше адаптировались и развивались в нестерильных условиях.
Выводы. Таким образом, при витрификации у растений наблюдается утолщение стебля, удлинение и искривление листьев из-за морфологического изменения тканей и увеличения размера клеток, что, прежде всего, связано с нарушением водного обмена. Одной из причин индукции таких изменений может быть низкая транспирация, вызванная аномальным развитием устьиц и строением покровных тканей.
Для решения проблемы витрификации, в зависимости от генотипа, целесообразно снижать концентрацию БАП в среде до 0,5 мг/л, либо использовать более слабый цитокинин - кинетин или безгормональ-ные питательные среды, разбавленные по минеральному составу.
Литература.
1. Masuda T., Yoshida Y., Bessho H. Studies on cell tissue and shooptip culture in apple //1 Relation ship between abnormal shoot formation and plant hormones: Bull Fruit Tree Res Stat Ser, Morioka, Iwate. - 1988. - № 15. - P. 21-28.
2. Druart P. C-source and growth response of Prunus glandulosa «Sinensis» Thund and Malus pumila Mill M 26 and M9 Clone 29 during in vitro propagation // Bull Rech agron. Gembloux. - 1995.-V. 30, № 1/2. - P. 29-37.
3. Bornman C.H., Vogelman T.C. Effect of rigidity of gel medium on benzyl-inducedadventitious bud formation and vitrification in vitro in picea abies. //Physiol. Plant., - 1984. - V. 61. - Р. 505-512.
SHOOT VITRIFICATION IN VITRO: ANATOMIC STRUCTURE AND POSSIBLE WAYS
OF THE PROBLEM SOLUTION O.V. Matushkina, I.N. Pronina, Ev.N. Tkachyov
Summary. The effect of main factors of cultivation on apple and pear shoot vitrification and the characteristics of their anatomic structure are under consideration. PB 9 apple rootstocks and PG 12 pear rootstocks show the highest level of hyperhydration (up to 100 %). It has been established that morphological changes of tissue and enlargement of cell size, stomata structure changes result in stem thickening, leaf elongation and distortion in, vitrified plants. At the stages of proliferation and rooting a regenerative ability in such shoots is 2-3 fold and 1,6-2,1 fold lower than in normally developed ones correspondingly. However these plants have more high lever of adaptivity and develop in non-sterile conditions. Reduction of concentration of BAP in the medium up to 0,5 mg/l or cytokinin - kinetin or lack of hormones in nutrient media with diluted concentration of macroelements promote solution of the vitrification problem.
Key words: apple, pear, vitrification, in vitro, shoot, leaf, stomata.
УДК 58.00:502.75
ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИДА КАК ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ФАКТОРЫ УСПЕШНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РАСТЕНИЙ В ОЗЕЛЕНЕНИИ
В.М. СТАРЧЕНКО, доктор биологических наук, зав. лабораторией
Амурский филиал Ботанического сада-институда Дальневосточного отделения РАН Н.А. ТИМЧЕНКО, зав. кафедрой Дальневосточный ГАУ E-mail: [email protected]
Резюме. В статье на примере 39 адвентивных представителей дендрофлоры Амурской области рассматриваются особенности растений (эколого-ценотическая приуроченность, зимостойкость, общий ареал), определяющие успешность их использования в озеленении населенных пунктов области. Ключевые слова: озеленение, адвентивные виды, эколого-ценотическая приуроченность, ареал, Амурская область, Дальний Восток России.
В последние годы использование представителей дендрофлоры в озеленении населенных пунктов развивается в двух направлениях. Для мест общего пользования и придомовых территорий в период заселения решающее значение имеет экономический фактор, поэтому при их благоустройстве используют преимущественно дешевые (низкие по себестоимости) растения. В результате в озеленении наблюдается преобладание 1...3 наиболее доступных видов и биоразнообразие дендрофлоры населенных пунктов заметно снижается [1...3]. Второе направление связано с озеленением частных владений и территорий крупных организаций, обладающих финансовой самостоятельностью. В этом случае заказчик обычно руководствуется своими желаниями (амбициями) и
