CC BY
114
УДК 57.086.83 И.П. Филиппова
ВИТРИФИКАЦИЯ У ЭКСПЛАНТОВ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (PINUS SYLVESTRIS L.)
В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
В статье рассматривается явление витрификации у эксплантов сосны обыкновенной (Pinus sylve-stris L.) при обработке их высокой концентрацией 250 цМ бензиламинопурина (БАП). Процент витрификации зависит от длительности обработки БАП, ориентации эксплантов на среде К MS и концентрации агара (6, 8 мг/л). Автором приводятся анатомические характеристики витрифицированных растений.
Ключевые слова: Pinus sylvestris L., витрификация, культура in vitro, 6-бензиламинопурин.
I.P. Filippova
ORDINARY PINE (PINUS SYLVESTRIS L.) EXPLANTS VITRIFICATION IN THE IN VITRO CULTURE
The phenomenon of vitrification at the ordinary pine (Pinus sylvestris L.) explants at processing it by a high concentration of 250 цМ benzilaminopurine (BAP) is considered in the article. The vitrification percent depends on the BAP processing duration, orientation of the explants on the l MS medium and an agar concentration (6, 8 mg/l). The author gives the anatomic characteristics of the vitrified plants.
Key words: Pinus sylvestris L., vitrification, in vitro culture, 6-benzilaminopurine.
При выборе оптимального метода для размножения в культуре in vitro исследователи очень часто сталкиваются с проблемой витрификации. Витрификацией (полупрозрачностью, стекловидностью) называется физиологическое и морфологическое расстройство тканей растений [1], поражающее экспланты как травянистых, так и древесных, видов в ходе вегетативного размножения in vitro [2]. Пораженные растения кажутся гладкими, отстают в росте, имеют толстые и уродливые стебли и листья [3-6]. Стекловидность растений - серьезная проблема, так как она может затронуть скорость размножения побегов и препятствовать переносу микроразмноженных растений в естественные условия, таким образом ограничивает применение методов in vitro как средства для массового размножения [7].
Витрификацию наблюдали у дыни (Cucumis melo L.), гвоздики (Dianthus caryophyllus L.) [2], вишни (Prunus) [7], каштана (Castanea sativa Mill.) [5], розы (Rose hybrida cv. Madame G. Delbard) [8], ивы (Salix baby-lonica L.) [9], ели европейской (Picea abies L.) [10], артишока (Cynara scolymus L.) [11], яблони (Malus) [12-13], лука (Allium cepa L.) [14-15] и др.
Были предложены некоторые гипотезы для выяснения механизма витрификации и были методы, развитые для преодоления витрификации, через манипулирование условиями культуры. Однако большинство усилий имело только ограниченный успех и определенная техника обычно не может быть применена для всех растений. Анализ предложенных средств, для того чтобы избежать витрификации, показывает, что ни одно из них не дает удовлетворительного решения этой проблемы. Одна из самых важных трудностей в объяснении физиологических причин витрификации связана с разнообразием физических и химических факторов, вовлеченных в процесс [1].
Большинство исследователей сходятся во мнении, что индукторами витрификации на твердых средах являются фитогормоны. Показано, что у гвоздики концентрация 1,0 мг/л нафтилуксусной кислоты увеличивает пропорцию апексов побегов, развивающихся в витрифицированные растеньица, хотя БАП дает противоположный эффект [16]. Gaspar и др. [12] обнаружил, что наличие БАП в среде индуцирует витрификацию у яблони. Нормальные экспланты на среде с БАП все становятся витрифицированными, в то время как на среде без гормона многие из растений остаются нормальными и только единичные растения становятся временно или постоянно витрифицированными. Подобная решающая роль цитокининов в вызывании вит-рификации была показана для БАП у вишни в концентрации 2 мг/л [7], дыни - 0,7 мг/л [2], лука - 70 рМ [15], для бензиладенина у ирги (Amelanchier) - 4,4 рМ [17], кинетина у артишока - 3 мг/л [11]. Снижение концентрации фитогормонов приводит, как правило, к уменьшению витрификации, однако оно одновременно снижает и коэффициент размножения, что не всегда приемлемо.
Цель данной работы - выявить особенности витрифицированных эксплантов сосны обыкновенной и подобрать условия культивирования in vitro для снижения интенсивности витрификации.
Материал и методы исследований. Зиготические зародыши Pinus sylvestris L. выделяли из семян в асептических условиях [18] и переносили для пульсирующей обработки в раствор 250 |jM БАП на 2, 4 и 6 часов, затем помещали вертикально или горизонтально на питательную среду / MS [18] без гормонов с 6 и 8 г/л агара. Пробирки с эксплантами содержали при температуре 23-250 С и 16-часовом фотопериоде.
Образцы растительного материала фиксировали на 7-е, 14-е сутки культивирования in vitro и изготовляли постоянные микротомные препараты по стандартной методике [19]. Полученные препараты просматривали на световом микроскопе Axiostar plus.
Результаты исследований и их обсуждение. В нашем исследовании с выделенными зиготическими зародышами сосны обыкновенной при использовании пульсирующей обработки с БАП (250 jM) разной длительности мы также столкнулись с проблемой витрификации. Анализ литературы показал, что у некоторых видов витрификация может быть преодолена только увеличением концентрации агара в среде [11; 13; 17]. Низкие концентрации агара 4-5 мг/л в гормональной среде всегда приводят к витрификации у эксплантов, поскольку водный потенциал агаровой среды является высоким, а водоудерживающая сила геля увеличивается линейно с увеличением его концентрации [8]. Мы также увеличили содержание агара с 6 до 8 мг/л. Дальнейшее увеличение концентрации агара не проводилось, так как Bornman, Vogelmann [10] выявили очень существенную обратную корреляцию между накоплением 14С-бензиладенина эксплантами и степенью плотности агаризованной среды. И марка и концентрация агара также влияют на химические и физические особенности культуральной среды. Примеси, внесенные с агаром ответственны за существенные различия в концентрации элемента в аналогичных средах с различными уровнями агара [17].
Результаты экспериментов показали, что при концентрации агара в питательной среде 6 мг/л длительность экспозиции при пульсирующей обработке зиготических зародышей сосны обыкновенной с БАП сильно влияет на интенсивность витрификации (рис.). Так, если время инкубации в растворе БАП равно 2 ч, количество витрифицированных растений составляет 52-60 %, тогда как при 6-часовой обработке интенсивность витрификации достигает уже 83-92% в зависимости от положения экспланта относительно поверхности питательной среды. Повышение содержания агара до 8 мг/л позволяет резко снизить витрификацию до 20 % у стоячих эксплантов и до 35 % у лежачих (2 и 4 ч).
Влияние длительности экспозиции в растворе БАП 250 цМ, концентрации агара и ориентации эксплантов на интенсивность витрификации у эксплантов сосны обыкновенной на 21-е сутки в культуре in vitro: а - стоячие; б - лежачие экспланты
Анатомический анализ витрифицированных образцов на постоянных препаратах показал следующие изменения. Клетки становятся гипертрофированными. Межклеточные пространства в тканях эксплантов значительно увеличены по сравнению с нормальными растениями. Эти пространства очень часто развиваются в семядольных хвоинках и являются причиной их хрупкости. Наблюдается также отделение эпидермиса от мезофилла в разных участках семядолей. Некоторые устьица возвышаются над эпидермисом и имеют замыкающие клетки ненормальной формы. Встречаются разрывы в паренхиме центрального цилиндра гипоко-тиля. Апексы побегов испытывают постепенную акропетальную редукцию своих меристем вплоть до исчезновения меристематических клеток и их полной дифференцировки. Впоследствии при пересадке таких растений, даже на безгормональные среды, все они дают образование каллуса.
Подобные изменения наблюдаются и у других витрифицированных растений. Так для листьев покрытосеменных характерна слабая дифференцировка между столбчатым и губчатым мезофиллом, сокращение числа слоев столбчатого мезофилла и увеличение межклеточных пространств в губчатом мезофилле [1; 13]. В стеблях происходит гипертрофия и увеличение размеров клеток кортикальной паренхимы и сердцевинной паренхимы, а также образование крупных межклетников. Ксилема и склеренхима менее дифференцированы и лиг-нифицированы, чем у нормальных побегов. Известно, что внутренняя структура листа модифицируется в соответствии с экологическими условиями. Для многих гидрофитов характерно наличие ткани с большими межклетниками называемой аэренхимой. Эти изменения коррелируют с высокой относительной влажностью [5].
Гипертрофия клеток, появление межклетников и разрывов в тканях хвоинок и гипокотилей эксплантов сосны обыкновенной происходит, с одной стороны, вследствие увеличения водной диффузии в клетки. Так, содержание воды в витрифицированных растениях сосны обыкновенной было больше, чем у нормальных -92 ± 1,8 и 85 ± 2,5 % соответственно. С другой стороны, это происходит, по-видимому, из-за изменений в строении клеточных стенок. Известно, что клеточные стенки растений являются высокоорганизованной структурой, которая может регулировать рост и дифференциацию клеток [20]. Одним из необходимых условий морфогенеза in vitro является усиление межклеточных контактов, в частности, посредством разветвленной структуры пектинов, которая усиливает их «цементирующую» функцию в серединных пластинках [21]. Наблюдаемые нарушения прочности связей клеток в тканях при витрификации у сосны и приводят в дальнейшем к образованию каллуса, не способного к морфогенезу при следующих пассажах. Тогда как эксплан-ты, не подверженные витрификации, впоследствии образуют адвентивные почки.
Так Kevers и др. [3] показал дефицит целлюлозы и лигнина у витрифицированных растений, допускающий большее поглощение воды из-за уменьшения давления клеточной стенки. Предполагается, что параллельное снижение активности фенилаланин аммиак-лиазы и кислых пероксидаз препятствует процессам лигнификации и уменьшение синтеза целлюлозы обусловлено конверсией углеводов в аминокислоты. Для витрифицированных побегов ирги отмечено увеличение содержания общего азота [17]. У Olearia microdisca, Prostanthera calycina, Prostanthera eurybioides и Swainsona viridis наблюдается пониженная плотность хлоро-пластов, дефицит хлорофиллов a и b и снижено содержание фенольных соединений [1].
В результате проведенных исследований выявлено, что витрифицированные экспланты сосны обыкновенной отличаются от нормальных наличием гипертрофированных клеток, появлением межклеточных пространств, редукцией меристем и повышенным содержанием воды. Повышение концентрации агара в среде (8 мг/л) позволяет снизить интенсивность витрификации более чем в два раза.
Литература
1. Taji, A.M. Comparative anatomy of four rare Australian plants grown in vitro I A.M. Taji, R.R. Williams, W.H. SheatherII Botanic Gardens Micropropagation News. - І996. - Vol. 2. - P. 2-5.
2. Leshem, B. The effect of cytokinins on vitrification in melon and carnation I B. Leshem, E. Werker, D.P. Sha-levII Annals of Botany. - i9BB. - Vol. 62. - P. 27І-276.
3. Physiological and biochemical events leading to vitrification of plants cultured in vitro I C. Kevers, M. Con-mans, M. Gilles [at el.] II Physiol. Plant. - i9B4. - Vol. 6І. - P. 69-74.
4. Phan, C.T. Possible metabolic basis for the developmental anomaly observed in in vitro culture called "vitreous plants"I C.T. PhanII Plant Cell Tiss. Org. Cult. - i9B6. - Vol. 6. - P. B3-94.
б. Anatomical and chemical studies of vitrified shoots of chestnut regenerated in vitro I A.M. Vieitez [at el.] II Physi-
ologia Plantarum. - І9В5. - Vol. 65. - P. І77-iB4.
6. Ziv, M. Malfunctioning stomata in vitreous leaves of carnation (Dianthus caryophyllus) plants propagated in vitro.
Implications for hardening I M. Ziv, A. Schwartz, D. FlemingerII Plant Sci. - i9b7. - Vol. 52. - P. І27-І34.
B7
7. Borkowska, B. Influence of BA and other cytokinins on proliferation and metabolic status of sour cherry cultures cultivated in vitro / B. Borkowska, M. Opitowska // Fruit Science Reports. - 1988. - Vol. 15. - № 4. -P. 147-156.
8. Ghashghaie, J. Effects of agar concentration on water status and growth of rose plants cultured in vitro / J. Ghashghaie, F. Brenckmann, B. Saugier// Physiologia Plantarum. - 1991. - Vol. 82. - P. 73-78.
9. Daguin, F. Ammonium-induced vitrification in cultured tissues / F. Daguin, R. Letouze // Physiologia Plantarum. - 1986. - Vol. 66. - P. 94-98.
10. Bornman, C.H. Effect of rigidity of gel medium on benzyladenine-induced adventitious bud formation and vitrification in vitro in Picea abies / C.H. Bornman, T.C. Vogelmann // Physiologia Plantarum. - 1984. -Vol. 61. - P. 505-512.
11. Debergh, P. Mass propagation of globe artichoke (Cynara scolymus): Evaluation of different hypotheses to overcome vitrification with special reference to water potential / P. Debergh, Y. Harbaoui, R. Lemeur // Physiologia Plantarum. - 1981. - Vol. 53. - P. 181-187.
12. Gaspar, T. Vitrification: morphological, physiological and ecological aspects / T. Gaspar, C. Kevers, P. Debergh [at el.] // In book: Cell and Tissue Culture in Forestry. Eds. J.M. Bonga, D.J.Durzan. - 1987. - Vol. 1. -P. 162-166.
13. Pasqualetto, P.L. The influence of cation and gelling agent concentrations on vitrification of apple cultivars in vitro / P.L. Pasqualetto, R.H. Zimmerman, I. Fordham // Plant Cell Tiss. Org. Cult. - 1988. - Vol.14. -P. 3140-3146.
14. Schloupt, R.M. 645 (ps 4) vitrified vs. glaucus onion (Allium cepa L.) leaves: a microscopic comparison / R.M. Schloupt, W.E. Splittstoesser, R.M. Skirvin // HortScience. - 1993. - Vol. 28. - P. 443-591.
15. Schloupt, R.M. 250 induction and avoidance of vitrification of micropropagated onion (Allium cepa L.) /
R.M. Schloupt, W.E. Splittstoesser, R.M. Skirvin // HortScience. - 1994. - Vol. 29. - P. 427-581.
16. Leshem, B. Vitrified Dianthus - teratomata in vitro due to growth factor umbalans / B. Leshem, T. Sachs // Annals of Botany. - 1985. - Vol. 56. - P. 613-617.
17. Brand, M.H. Influence of agar and ammonium nitrate on tissue nitrogen, culture growth, and vitrification / M.H. Brand// HortScience. - 1993. - Vol. 28. - P. 546-591.
18. Биотехнология растений: культура клеток: пер. с англ. В.И. Негрука; предисл. Р.Г. Бутенко. - М.: Аг-ропромиздат, 1989. - 280 с.
19. Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева. - М.: Агропромиздат, 1988. - 271 с.
20. Валиева, А.И. Динамика полисахаридного состава клеточных стенок каллусов татарской гречихи с
различным морфогенным потенциалом в процессе роста и морфогенеза / А.И. Валиева, Н.И. Румянцева, В.В. Лозовая // Цитология. - 1999. - Т. 41. - № 7. - С. 598-604.
21. Kikuchi, A. Differences in pectin polysaccharides between carrot embryogenic and non- embryogenic calli / A. Kikuchi, S. Satos, N. Nakamura // Plant Cell Reports. - 1995. - Vol. 14. - P. 279-284.
