CC BY
138
УДК 575.174.015.3:582.475.2
ОРГАНОГЕНЕЗ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (PINUS SYLVESTRIS L.)
В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
В.Г. Лебедев, К.А. Шестибратов
Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю. А.Овчинникова 142290 Московская обл., г. .Пущино, пр-т Науки, д.6, e-mail: vglebedev@mail.ru
Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.) является одной из основных хвойных пород лесов бореальной зоны. Повысить продуктивность лесных насаждений можно с помощью лесных плантаций плюсовых деревьев, заложенных посадочным материалом клонального происхождения. Мы провели оценку влияния различных факторов на регенерацию и укоренение побегов сосны обыкновенной in vitro. Оптимизация состава питательных сред, освещенности, типа ауксина и концентрации сахарозы позволила довести частоту образования побегов до 96 %, а укоренения - до 58 %. Полученные результаты могут быть использованы для разработки технологии клонального микроразмножения ценных генотипов P .sylvestris.
Ключевые слова: сосна обыкновенная, in vitro, витрификация, регенерация побегов, освещенность, укоренение
Scots pine (Pinus sylvestris L.) is one of the most widely distributed conifers in the boreal forests. For establishment of forest plantations the superior (plus) trees must be clonally propagated. We investigated influence of various factors, such as basal nutrient media, light intensity, sucrose, auxins on shoot regeneration and rooting of Scots pine in vitro. Obtained results may be used for development of clonal micropropagation protocol for valuable genotypes of P.sylvestris.
Key words: Scots pine, in vitro, vitrification, shoot regeneration, light intensity, rooting
ВВЕДЕНИЕ
Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.) является одной из основных лесообразующих хвойных пород Северного полушария. В России она занимает около 1/6 площади всех лесов и имеет большое экономическое значение, так как ее древесина используется в самых различных отраслях промышленности и строительства. Однако продуктивность северных российских лесов относительно невысока и составляет от 0,4 до 2 м3/га в год (Чибисов, 2000). Эффективность лесонасаждений можно повысить путем создания лесных плантаций с ценными генотипами, обладающими повышенной продуктивностью и дающими древесину высокого качества. Посадочный материал для таких плантаций нельзя получать путем семенного размножения, так как при этом ценные признаки у хвойных пород наследуются с частотой всего 10-20 % (Долголиков, По-пивщий, 1992).
Эту проблему можно решить с помощью технологии культивирования растений in vitro, которая обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными способами вегетативного размножения: имеет высокий коэффициент размножения, не зависит от времени года, не требует больших площадей. Однако хвойные растения являются наиболее сложными объектами в культуре in vitro, и поэтому разработка эффективной системы клонального микроразмножения для некоторых видов до сих пор является актуальной задачей. Сосна обыкновенная считается особенно трудной для культивирования in vitro даже среди других представителей рода Pinus (Hohtola, 1988). Исследования на эту тему ведутся с начала 1980-х годов, но публикаций в целом немного. Известно о работах по органогенезу из сеянцев (№ggman et al., 1996) или почек
взрослых деревьев (Andersone and Ievinsh, 2002), а также по соматическому эмбриогенезу (Lelu-Walter et al., 2008). Авторы сообщали о значительном влиянии генотипа, побурении тканей, приводящему к некрозу, низкой частоте укоренения. Цель нашего исследования заключалась в оценке влияния различных факторов на регенерацию и укоренение побегов из семенных эксплантов сосны обыкновенной в условиях in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В работе использовали семена сосны обыкновенной, любезно предоставленные В.Е. Падутовым (Институт леса НАН Беларуси, г. Гомель). Проростки получали проращиванием на фильтровальной бумаге. У них оставляли 5-7 мм гипокотиля, после чего стерилизовали 4 мин в 0,2 % растворе Hg(NO3)2 и помещали на среду без регуляторов роста, содержащую минеральные соли PM1 (Schestibra-tov et al., 2003), 30 г/л сахарозы, 200 мг/л PVP и 2,5 г/л Gelrite gellan gum (Sigma, USA). На этой среде экспланты выдерживали 7-8 дней для отбраковки инфицированных и ослабленных растений, после чего использовали в экспериментах.
Для регенерации побегов экспланты культивировали два пассажа по 6-7 недель каждый: вначале на 5 мг/л 6-БАП или кинетина, затем на среде без регуляторов роста. Для оценки влияния минерального состава питательной среды использовали среды MS (Murashige and Skoog, 1962), РМ1, QL (Quoi-rin and Lepoivre, 1977), AE (von Arnold and Eriksson, 1981), MCM (Bornman, 1983), DCR (Gupta and Dur-zan, 1985) и SH (Schenk and Hildebrandt, 1972).
Укоренение проводили на средах с различными концентрациями НУК или ИМК, результаты учитывали через 12 недель. Все среды содержали 30 г/л
сахарозы (если не указано иное), 200 мг/л РУР (кроме сред для укоренения) и 2,5 г/л Оеігіїе. рН сред доводили до 5,6-5,8 1 Н КОН и автоклавирова-ли в течение 20 минут при 121 °С. Регуляторы роста и витамины стерилизовали фильтрованием (МІ11І-роге, 0,22 мкм) и добавляли в среду после автокла-вирования. Растения выращивали при температуре 23±1 °С и 16 час. световом дне.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для оценки влияния минерального состава сред экспланты сосны обыкновенной культивировали на семи различных средах с добавлением 5 мг/л 6-БАП в течение 1,5 месяцев с целью закладки почек, после чего для элонгации побегов пересаживали на аналогичную среду, но без регуляторов роста (б/г). Поведение эксплантов значительно отличалось в разных вариантах. В первом пассаже состав среды оказал существенное влияние на все показатели, кроме количества побегов на эксплант (табл. 1).
На средах М8 и АЕ отмечалась сильная витри-фикация эксплантов -48 и 68 %, соответственно. Среда МСМ способствовала проявлению некроза у почти четверти всех эксплантов. Побегообразование на разных средах была довольно схожим и существенным образом выделялась только среда 8И, на которой к тому же хвоинки были светлее, чем в остальных вариантах. После второго пассажа много некроза наблюдалось на средах М8 и АЕ - эксплан-ты, витрифицированные в течение первого пассажа, погибли при последующем культивировании. Как и в первом пассаже, сильный некроз был отмечен на среде МСМ.
Побегообразование и количество побегов на эксплант во втором пассаже были максимальными на среде MS - 93 % и 5,0, соответственно. Побеги длиннее 7-8 мм, которые можно было отделить от исходного экспланта и культивировать индивидуально, мы учитывали отдельно и их доля в разных вариантах различалась несущественно. У эксплантов, находившихся на среде DCR, наблюдалось покраснение кончиков хвоинок. Витрификация, особый тип физиологического отклонения в культуре in vitro, значительно снижает качество растительного материала. К сожалению, в работах других авторов практически отсутствуют данные по уровню витри-фикации и некроза эксплантов сосен in vitro на различных средах. Результаты исследований влияния минерального состава на побегообразование у видов Pinus различаются довольно значительно. Например, в работах с P. kesiya и P. pinea мультипликация лучше всего шла на средах MS и 1/2 MS, соответственно (Nandwani et al., 2001; Sul and Korban, 2004). В экспериментах с P. halepensis и P. wallichiana оптимальной средой для индукции побегов оказалась среда DCR, которая превосходила среду SH (Lam-bardi et al., 1993; Mathur and Nadgauda, 1999), что противоречит нашим результатам. Скорее всего, это свидетельствуют о том, что разные виды нуждаются в разном количестве и соотношении минеральных элементов питания. Кроме того, эта потребность может различаться в зависимости от стадии развития. Из наших результатов можно сделать вывод, что на стадии закладки почек оптимальным вариантом для сосны обыкновенной оказалась среда SH, а на стадии их элонгации - среда MS, несмотря на сильную витрификацию эксплантов.
Таблица 1 - Влияние минерального состава среды на органогенез эксплантов P. sylvestris
Среда 1-й пассаж (закладка почек - 5 мг/л БАП) 2-й пассаж (элонгация побегов - б/г)
витрифи-кация, % некроз, % побегообразование, % кол-во побегов на эксплантов некроз, % побего-образование, % кол-во побегов на эксплантов доля побегов для срезки, %
MS 47,8 аб 8,Q аб 45,7 бв 2,8 65,Q а 92,9 а 5,Q 61,5
PM1 14,9 в 2,1 бв 51,1 бв 2,2 7,5 б 75,7 аб 2,4 58,2
QL 11,1 вг 2,2 бв 71,1 аб 2,7 5,3 б 88,9 аб 3,4 54,5
AE 67,5 а 13,Q аб 47,5 бв 2,7 78,1 а 57,1 б 1,8 42,9
MCM Q,Q г 23,9 а 65,7 абв 2,7 18,8 б 84,6 аб 3,2 52,1
DCR 26,7 бв 2,2 бв 62,2 абв 2,1 12,5 б 68,6 аб 3,Q 49,3
SH 11,8 вг Q,Q в 8Q,4 а 2,9 2,5 б 84,6 аб 3,7 61,5
Примечание: Здесь и далее - величины, достоверно различающиеся между собой (Р < 0,05), обозначены разными буквами. Таблица 2 - Влияние минерального состава среды и присутствия 6-БАП на разных пассажах на органогенез P. sylvestris
Вариант Среда 1-й пассаж 2-й пассаж
витрифи-кация, % - а -в оо гз еа, бре оби пон кол-во побегов на экс-плант побего-образование, % кол-во побегов на экс-плант доля побегов для срезки, %
б/г ^ 6-БАП PM1 4,7 - - 71,7 б 2,1 Q,Q б
SH 6,9 - - 95,7 а 2,5 Q,Q б
6-БАП ^ б/г PM1 16,7 27,7 1,5 5Q,Q бв 2,6 51,2 а
SH 9,5 26,Q 1,6 47,5 в 2,2 56,1 а
Рисунок І - Образование побегов на эксплантах сосны обыкновенной на среде с 5 мг/л 6-БАП
С целью проверки эффективности среды 8И на двух вышеупомянутых стадиях был проведен эксперимент, в котором сравнили варианты чередования среды с цитокинином (5 мг/л 6-БАП) и среды без регуляторов роста (б/г). Помимо среды 8И использовали среду РМ1, которая показала свою эффективность в предыдущем эксперименте, а также в работе с P .radiata (8сЬе8ИЪга1оу й а1., 2003). Вит-рификация эксплантов на среде без регуляторов роста была ниже, хотя разница не получила статистического подтверждения (табл. 2).
Это подтверждает известный факт, что цитоки-нины, особенно в высоких дозах, способствуют проявлению витрификации. Минеральный состав среды не оказал существенного влияния на побегообразование, если 6-БАП присутствовал в среде в 1-м пассаже. Однако если его добавляли во 2-м пассаже, то стимуляция органогенеза была лучше на среде 8И. Эксперимент показал, что эффективнее вначале стимулировать закладку почек (6-БАП в первом пассаже), а затем их элонгировать на без-гормональной среде, так как в этом варианте около половины всех побегов имели достаточный размер для раздельного культивирования в дальнейшем (рис. 1). В противном случае (1-й пассаж без регуляторов роста) количество побегов был существенно выше, но все они не превышали в длину 5 мм.
Так как среда MS наряду с высоким побегообразованием стимулировала витрификацию эксплан-тов сосны обыкновенной, в следующем эксперименте мы попытались уменьшить этот нежелательный эффект.
Для этого 6-БАП был заменен на кинетин в той же концентрации и изменена интенсивность освещения по сравнению с обычной (50 микромоль/м2/с). Кинетин, обладая более мягким цитоки-ниновым действием, чем 6-БАП, тем не менее успешно использовался для индукции побегов P. roxburghii (Kalia et al., 2007). Что касается интенсивности освещения, насколько нам известно, ранее такие эксперименты на видах Pinus не проводились. Мы культивировали экспланты в течение двух пассажей под освещением 12,5, 25, 50 и 100 микромоль/м2/с. Во всех вариантах, за исключением максимальной освещенности, витрификация на среде MS была значительно выше по сравнению со средой РМ 1 - 40-63 % и 17-23 %, соответственно (табл. 3).
Некроз эксплантов в обоих пассажах также был намного выше на среде MS. Таким образом, среда MS оказалась непригодной для культивирования эксплантов сосны обыкновенной, несмотря на повышенное побегообразования на этой среде для обоих цитокининов. Следует отметить, что кинетин оказался очень слабым стимулятором регенерации побегов - в незначительной степени она присутствовала только при освещенности 50 и 100 микромоль/м2/с. Интенсивность освещения повлияла также и на внешний вид эксплантов, в частности, их размеры увеличивались при усилении освещенности от 12,5 до 50 микромоль/м2/с. На 100 микромоль/м2/с растения выглядели более огрубевшими, появился некроз семядолей, хвоинки посветлели, их кончики покраснели, однако к положительному эффекту можно отнести снижение витрификации эксплантов. Во втором пассаже на максимальной освещенности признаки некроза хвоинок и покраснения их кончиков еще более усилились, что свидетельствует о ее избыточности для культивирования сосны обыкновенной in vitro. В других работах также отмечалось преимущество умеренного освещения на различных этапах клонального микроразмножения.
Таблица 3 - Влияние освещенности и минерального состава среды на культивирование эксплантов Р. sylvestris
Цитокинин, мг/л Освещенность, микромоль/м2/с Среда 1-й пассаж (с цитокинином) 2-й пассаж (б/г)
витрифи-кация, % некроз, % побегообразование, % некроз, %
5 БAП 5Q PM1 22,7 бвгд 1,4 вг 25,4 б 18,8 вгд
MS 55,2 аб 6,9 бвг 40,3 а 74,5 а
5 кинетин 12,5 PM1 17,1 вгд 2,8 бвг 0,0 г Q,Q е
MS 62,5 а 11,1 абв 0,0 г 68,2 аб
25 PM1 2Q,Q бвгд 2,8 бвг 0,0 г 12,5 где
MS 4Q,6 абв 11,1 абв 0,0 г 31,3 вгд
5Q PM1 2Q,Q бвгд 2,8 бвг 0,0 г 6,3 де
MS 4Q,Q абвг 16,7 аб 3,3 в 46,7 абв
1QQ PM1 8,3 гд Q,Q г 8,3 в 38,1 бвг
MS 4,2 д 33,3 а 16,7 б 47,1 абв
Например, в диапазоне освещенности 15-90 микромоль/м2/с показатели размножения и укоренения были существенно лучше на 30 микромоль/м2/с у Withania somnifera (Lee et al., 2007) и Alocasia amazonica (Jo et al., 2008). О побледнении окраски эксплантов абрикоса при высокой освещенности сообщали Perez-Tornero et al. (2001). По-светление хвоинок сосны при высокой освещенности может быть связано с разрушением хлорофилла. Jo et al. (2008) показали, что содержание хлоро-пластных пигментов (хлорофилла a и b, каротинои-дов) у растений при 90 микромоль/м2/с было в 4-5 раз ниже, чем при 30 микромоль/м2/с.
Почти двухкратное падение содержания хлорофилла наблюдалось у растений винограда, которые акклиматизировали при 90 микромоль/м2/с по сравнению с 40 микромоль/м2/с (Amancio et al., 1999). Ранее также сообщалось, что интенсивность света может влиять на витрификацию. Например, увеличение освещенности с 55 до 110 микромоль/м2/с снизило витрификацию двух сортов абрикоса в 3-5 раз (Perez-Tornero et al., 2001). Авторы связывают это с улучшением транспирации, чему способствует повышенная температура листьев при высокой освещенности. Однако представляется, что витрификация в большей степени зависит от других факторов культуры in vitro. Например, витрифика-ция побегов подвоя яблони при повышении освещенности снизилась только на среде с 0,5 мг/л 6-БАП, тогда как на среде с 1,5 мг/л она, наоборот, возросла (Шорников и др., 2009).
Таблица 4 - Влияние минерального состава среды и типа ауксина на укоренение побегов Р. sylvestris (сахароза - 30 г/л)_____________________________________
Среда AY^m, мг/л Укоренение, % ^л-во корней на побег
PM1 Q.5 НУХ Q,Q в -
Q.5 ffl^K Q,Q в -
1/2 SH Q.5 НЖ 13,3 б 3,Q
Q.5 ffl^K Q,Q в -
1/2 DCR Q.5 НЖ 46,7 а 2,9
Q.5 ffl^K Q,Q в -
Ряд экспериментов был проведен по укоренению побегов сосны обыкновенной in vitro. В частности, сравнивали три варианта состава среды: PM1 и уменьшенные вдвое концентрации солей сред SH и DCR, а также два ауксина, HУK и ИМ^ в концентрации Q,5 мг/л (табл. 4).
Между вариантами наблюдались существенные различия - укоренения не было на среде РМ1 и в вариантах с ИМК Побеги укоренялись только на Q,5 мг/л НУХ (рис. 2). Стоит отметить, что на среде 1/2 DCR частота укоренения было в 3,5 раза выше, чем на 1/2 SH, но различий в количестве корней на побег практически не было. Kонцентpация Q,5 мг/л HУK была выбрана для укоренения побегов P. syl-vestris и в работе Haggman et al. (1996). Наши результаты вполне согласуются с другими работами по различным видам сосен в культуре in vitro.
На разных видах было показано преимущество НУХ над другими ауксинами. Так, укоренение P.
roxburghii на 0,5-1,5 мг/л НУК составило 35-71 %, тогда как на таких же концентрациях ИМК и ИУК -26-58 % и 19-39 %, соответственно (Kalia et al., 2007). В широком диапазоне концентраций, которые проверяли для укоренения микропобегов P. massoniana, 0,05-1 мг/л НУК и по 0,5-4 мг/л ИМК или ИУК, лучшие результаты также были показаны на средах с НУК, затем на ИМК и потом на ИУК (Zhu et al., 2010). Однако, в отличие от нашей работы, эти виды все же укоренялись на среде с ИМК, хотя и с меньшей частотой. Nandwani et al. (2001) оценивали укоренение P. kesiya после нахождения побегов на 3 или 10 мг/л НУК или ИМК в течение 24 или 120 ч. Только длительная выдержка на 10 мг/л ИМК способствовала образованию корней с частотой 42 %, а во всех остальных вариантах с ИМК укоренения не происходило, хотя все варианты с НУК дали укоренение в диапазоне 33-67 %. Следовательно, НУК и среда 1/2 DCR гораздо больше подходят для укоренения сосны обыкновенной, и в последующих экспериментах мы использовали только эти варианты. В работе Haggman et al. (1996) укоренение разных генотипов сосны обыкновенной на 0,5 мг/л НУК составило в среднем всего 6%, что подтверждает сложность культивирования этого вида в условиях in vitro.
на среде с 0,5 мг/л НУК
Известно, что помещение растений в темноту, а также пересадка растений на безгормональную среду может стимулировать укоренение (Monteuuis and Bon, 2000). Для проверки этих утверждений на P. sylvestris был проведен эксперимент, в котором оценивали эффект одно- или двухнедельной экспозиции побегов в темноте или на среде с 0,5 мг/л НУК. Несмотря на колебания в частоте укоренения, статистический анализ не выявил преимуществ какого-либо варианта, хотя при нахождении на среде с НУК в течение одной недели и выдержке в темноте в течение двух недель результаты были несколько выше (табл. 5).
Существенно большее влияние тестируемые факторы оказали на количество корней на побег -корней было меньше при постоянной экспозиции на свету и при 2-хнедельной выдержке на НУК. В целом же, не было обнаружено значительного пре-
имущества какого-либо варианта. По-видимому, эффект экспозиции находится в зависимости от в темноте (Monteuuis and Bon, 2000), но у березы выдерживание в темноте привело к снижению укоренения (Wynne and McDonald, 2002).
Таблица 5 - Влияние экспозиции в темноте и на НУК на укоренение побегов Р. sylvestris (среда - 1/2 БСК, сахароза - 30 г/л)___________________________________
Экспозиция в темноте Экспозиция на 0,5 мг/л НУК Укоренение, % ^л-во корней на побег
Без темно- 1 неделя 25,Q 1,4 б
ты 2 недели 12,5 1,3 б
постоянно
(12 нед.) 21,9 2,3 аб
Темнота 1 неделя 15,6 3,6 а
1 нед. 2 недели 6,3 1 ,5 аб
постоянно
(12 нед.) 15,6 3,6 а
Темнота 1 неделя 28,1 2,2 аб
2 нед. 2 недели 21,9 1,4 б
постоянно
(12 нед.) 15,6 1,8 аб
Таблица б - Влияние концентрации сахарозы и НУК
на укоренение побегов P. sylvestris (среда - 1/2 DCR)
Сахароза, г/л НУХ, мг/л Укорене- ^л-во
ние, % корней
на побег
1Q Q,5 33,3 аб 2,1
1 58,3 а 1,6
3Q Q,5 34,2 аб 2,Q
1 45,8 аб 1,5
5Q Q,5 16,7 б 1,3
1 33,3 аб 1,8
Далее была проведена оценка влияния на укоренение концентрации сахарозы и НУК. Помимо стандартной концентрации 30 г/л сахарозы использовали также 10 и 50 г/л и включили вариант с содержанием 1 мг/л НУК. Повышение концентрации НУК положительно сказалось на укоренении, хотя на каждой концентрации сахарозы эти различия были статистически недостоверными (табл. 6).
Укоренение на 10 и 30 г/л сахарозы статистически не отличались, а на 50 г/л наблюдалось снижение укоренения. Различий в количестве корней на побег не наблюдалось во всех вариантах. Оптимальная концентрация НУК в среде для разных видов сосен была различной: P. roxburghii лучше всего укоренялась на 1 мг/л (КаИа й а1., 2007), а P. massoniana - на 0,2 мг/л (2Ии й а1., 2010). Что касается влияния сахарозы на укоренение, то обычно считается, что снижение концентрации углеводов в среде стимулирует ризогенез. Однако укоренение хурмы существенно не отличалось в диапазоне 1770 г/л сахарозы (Kagami, 1999), а подвой яблони лучше всего укоренялся на 30 г/л сахарозы (БаИ-тат й а1., 2009). У нас некоторое повышение укоренения на 10 г/л сахарозы наблюдалось в варианте с 1 мг/л НУК.
ряда других факторов. Например, у акации укоренение и количество корней было значительно выше Проведенные исследования позволили определить ряд факторов, оказывающих значительное влияние на органогенез P. sylvestris в культуре in vitro. Удовлетворительные результаты по индукции побегообразования были получены на среде SH c добавлением 5 мг/л 6-BAH. Укоренение побегов было достигнуто на среде 1/2 DCR, содержащей НУК Вместе с тем, было обнаружено, что требования культуры in vitro сосны обыкновенной довольно сильно различаются на разных стадиях, и необходима тщательная оптимизация условий на разных этапах клонального микроразмножения. По-
видимому, этим объясняется сложность культивирования хвойных пород в условиях in vitro.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Долголиков, В.И. Положительные стороны и недостатки клоновой селекции ели / В.И. Долголиков, И.И. По-пивщий // Лесоведение. -1992.- № 2.- С. 11-18.
Чибисов, r.A. Леса Европейского Севера: экологические проблемы / r.A.Чибисов // Лесоводственно-
экономические вопросы воспроизводства лесных ресурсов Европейского Севера : сб. науч. тр. Федер. службы лес. хоз-ва России. - Apxапгелъск : СевНИ-ИЛХ, 2QQQ. - С. 7-13.
Шорников, Д.Г. Влияние условий культивирования на эффективность побегообразования клонового подвоя 54-118 и уровень витрификации тканей в культуре in vitro / Д.Г. Шорников, AB. Верзилин, О.М. Aкимова, Е.В. Шорникова // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета.- 2QQ9.- № 2. - C. 9-13. Amancio, S. Improvement of acclimatization of micropropagated grapevine: Photosynthetic competence and carbon allocation / S. Amancio, J.P. Rebordao, M.M. Chaves // Plant Cell Tiss. Organ Cult.- 1999.- V. 58.- P. 31-37.
Andersone, U. Changes of morphogenic competence in mature Pinus sylvestris L. buds in vitro / U. Andersone, G. Ie-vinsh //Ann. Bot.- 2QQ2.- V. 9Q.- P. 293-298.
Bornman, C.H. Possibilities and constraints in regeneration of trees from cotyledonary needles of Picea abies in vitro / C.H. Bornman // Physiol. Plant.- 1983.- V. 57.- P. 5-16. Gupta, P.K. Shoot multiplication from mature trees of Doug-las-fir (Pseudotsuga manziesii) and sugar pine (Pinus lam-bertiana) / P.K. Gupta, D.J. Durzan // Plant Cell Rep.-1985.- V. 4.- P. 177-179.
Hаggman, H.M. Early flowering Scots pines through tissue culture for accelerating tree breeding / H.M. №ggman, T.S. Aronen, A.-M. Stomp // Theor. Appl. Genet.- 1996.-V. 93. - P. 84Q-848.
Hohtola, A. Seasonal changes in explant viability and contamination of tissue cultures from mature Scots pine / A. Hohtola // Plant Cell Tissue Organ Cult.- 1988.- V. 15.- P. 211-222.
Jo, E.-F. Effect of photoperiod and light intensity on in vitro propagation of Alocasia amazonica / E.-F. Jo, R.K. Tewari, E.-J. Hahn, K.-Y. Paek // Plant Biotech. Rep.- 2QQ8.- V. 2.- P. 2Q7-212.
Kagami, H. Effect of sugars on rooting of shoots of Japanese persimmon propagated in vitro / H. Kagami // Plant Biotech.- 1999.- V. 16.- P. 371-374.
Kalia, R.K. Plantlet regeneration from fascicular buds of seedling shoot apices of Pinus roxburghii Sarg / R.K. Ka-
lia, S. Arya, S. Kalia, I.D. Arya // Biologia Plant.- 2007.-V. 51.- P. 653-659.
Aleppo pine (Pinus halepensis Mill.)/ M. Lambardi, K.K. Sharma, A.T.A. Thorpe // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant.-1993.- V. 29.- P. 189-199.
Lee, S.-H. Photon flux density and light quality induce changes in growth, stomatal development, photosynthesis and transpiration of Withania Somnifera (L.) Dunal. Plant-lets / S.-H. Lee, R.K. Tewari, E.-J. Hahn, K.-Y.
Paek // Plant Cell Tiss. Organ Cult.- 2007.- V. 90.- P. 141151.
Lelu-Walter, M.-A. Clonal plant production from self- and cross-pollinated seed families of Pinus sylvestris (L.) through somatic embryogenesis / M.-A. Lelu-Walter, M. Bernier-Cardou, K. Klimaszewska // Plant Cell Tiss. Organ Cult.- 2008.- V. 92.- P. 31-45.
Mathur, G. In vitro plantlet regeneration from mature zygotic embryos of Pinus wallichiana A.B. Jacks / G. Mathur, R. Nadgauda // Plant Cell Rep.- 1999.- V. 19.- P. 74-80.
Monteuuis, O. Influence of auxins and darkness on in vitro rooting of micropropagated shoots from mature and juvenile Acacia mangium / O. Monteuuis, M.-C. Bon // Plant Cell Tiss. Organ Cult.- 2000.- V. 63.- P. 173-177.
Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture / T. Murashige, F.A. Skoog // Physiol. Plant.- 1962.- V. 15.- P. 473-497.
Nandwani, D. Micropropagation of Pinus kesiya Royle ex Gord (Khasi pine) / D. Nandwani, S. Kumaria, P. Tandon // Gartenbauwissenschaft.- 2001.- V. 66.- P. 68-71.
Perez-Tornero, O. Control of hyperhydricity in micropropagated apricot cultivars / O. Perez-Tornero, J. Egea, E. Ol-
Lambardi, M. Optimization of in vitro bud induction and plantlet formation from mature embryos of
mos, L. Burgos // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. -2001.- V. 37.- P. 250-254.
Quoirin, M. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. / M. Quoirin, P. Lepoivre // Acta Hort.- 1977.- V. 78.-P. 437-442.
Schenk, R.U. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures / R.U. Schenk, A.C. Hildebrandt // Can. J. Bot.-1972.- V. 50.- P. 199-204.
Schestibratov, K.A. Plantlet regeneration from subculturable nodular callus of Pinus radiate / K.A. Schestibratov, R.V. Mikhailov, S.V. Dolgov // Plant Cell Tiss. Organ. Cult.- 2003.- V. 72.- P. 139-146.
Sul, III-W. Effects of salt formulations, carbon sources, cyto-kinins, and auxin on shoot organogenesis from cotyledons of Pinuspinea L. / III-W. Sul, S.S. Korban // Plant Growth Regul.- 2004.- V. 43.- P. 197-205.
von Arnold, S. In vitro studies on adventitious shoot formation in Pinus contorta / S. von Arnold, T. Eriksson // Can. J. Bot.- 1981.- V. 59.- P. 870-874.
Wynne, J. Adventitious root formation in woody plant tissue: the influence of light and indole-3-butyric acid (IBA) on adventitious root induction in Betula pendula / J. Wynne, M.S. McDonald // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant.- 2002.-V. 38.- P. 210-212.
Zhu, L.-H. Micropropagation of Pinus massoniana and my-corrhiza formation in vitro / L.-H. Zhu, X.-Q.Wu, H.-Y. Qu et al. // Plant Cell Tiss. Organ. Cult.- 2010.- V. 102.- P. 121-128.
Поступила в редакцию 29 декабря 2011 г. Принята к печати 01 марта 2012 г.
