CC BY
84
ВИСЦЕРОПАТОЛОГИЯ И НЕПОСРЕДСТВЕННЫЕ ПРИЧИНЫ СМЕРТИ ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ ОПИЙНЫМИ НАРКОТИКАМИ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ CYP И СИСТЕМЫ ЦИТОКИНОВ
В.В. Сорокина, А.В. Кононов, Е.Г. Поморгайло
ГОУ ВПО Омская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России
E-mail: [email protected]
VISCEROPATHOLOGY AND DIRECT CAUSE OF DEATH UNDER INTOXICATION WITH OPIOID DRUGS AND GENETIC POLYMORPHIC OF CYP AND CITOKINS SYSTEM
V.V. Sorokina, A.V. Kononov, E.G. Pomorgaylo
Omsk State Medical Academy
Работа посвящена оценке причин смерти в случаях острой и хронической интоксикации опийными наркотиками. Установлено, что в случаях малых посмертных концентраций морфина в крови (до 0,5мг/л) при молекулярно-генетическом исследовании выявляются, как правило, мутантные аллели генов CYP2D6*3*4; CYP2C19*2*3. Причиной смерти субъектов в этих случаях является острое отравление наркотиками.
Проведено типирование генов цитокина ИЛ-Щ у лиц, погибших в результате наркотической интоксикации. Лица, погибшие в результате хронической наркотической интоксикации - носители провоспалительного аллеля Т ИЛ-Щ имели выраженную тенденцию к развитию заболеваний, имеющих в своей основе воспалительную реакцию.
Ключевые слова: генетический полиморфизм, ИЛ-Щ наркотическая интоксикация, CYP2D6; CYP2C19, причины смерти.
The work is dedicated to estimation of the cause of death in cases of acute and chronic intoxication with opioid drugs. It is founded that in case of small posthumous concentration of morphine in blood (upto 0.5мг/1) in molecular-genetic study are revealled, as a rule, mutant’s allels of genes Syp2D6*3*4; CYP2C19*2*3. The cause of death in these cases is the acute intoxication with drugs.
The typing of genes of cytokines IL-1 p was performed in persons dead as a result acute and chronic with narcotic drugs. The dead persons were the carriers of genotypes Т IL-1 p and had strongly marked trend to development of the complications based on inflammatory reaction.
Key words: genetic polymorphic, IL-1 p, narcotic intoxication, CYP2D6; CYP2C19, cause to death.
Введение
Употребление наркотиков с морфинным циклом приводит к запуску метаболических цепочек для ксенобиотиков. Помимо метаболических аспектов поступления опиатов в организм человека и чисто наркотических последствий (физиологическое действие), в организме наступает целый спектр изменений в органах и системах организма, обусловленный с одной стороны метаболи-
ческими последствиями наркотика в организме, а с другой - его физиологическим действием.
Помимо токсического действия наркотика, у лиц, употребляющих наркотические вещества внутривенно, часто отмечаются признаки хронических воспалительных и инфекционных заболеваний, что связано не только с выраженной иммуносупрессией вызванной непосредственным действием наркотика, но, возможно, и с генетически детерминированным характером воспалитель-
ного ответа. Согласно данным последних лет, полиморфизм генов цитокинов, включая семейство ИЛ-1Р, оказывает существенное влияние на общие особенности протекания воспалительного ответа - остроту, хрониза-цию, уровень лихорадки и др. По всей видимости, в зависимости от индивидуального ансамбля высоко- и низко-продуцируюших вариантов генов про- и противовоспалительных цитокинов характер воспалительного ответа может значительно различаться между индивидуумами с полярными (“провоспалительным” и “противовоспалительным”) генотипами. Такая поляризация может быть ответственна за выраженную дисрегуляцию воспалительного ответа [1].
Целью настоящей работы явилось изучение ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов ИЛ-1Р (С+3953Т) и ИЛ-Ша (ЖГК-тй2) и СYP2D6, СУР2С19 клинической патологией и причинами смерти лиц погибших в результате острой и хронической наркотической интоксикации
Материал и методы
Работа основана на результатах анализа наблюдений случаев смерти лиц, погибших с установленными данными употребления наркотических веществ. Проведено аутопсийное исследование 189 трупов лиц, страдавших опийной наркоманией за период 2005-2007 гг. Исследование трупов проводилось на базе ГУЗООБСМЭ.
В преобладающем большинстве случаев аутопсию проводили в сроки до 24 ч после наступления смерти. Макроскопическое исследование проводили с применением традиционных секционных методик. Полученные на вскрытии образцы органов и тканей 30-40 для каждого наблюдения заливали в парафин, парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, выборочно проводили ШИК-реакцию.
При исследовании трупов на длительное использование наркотиков указывали: следы от внутривенных инъекций различной давности 83 наблюдения - 93%, фиброзное очаговое утолщение стенок подкожных вен 39 наблюдений - 43,8%, положительный результат количественного определения концентрации морфина в крови, 174 наблюдения - 83.1%
Из всего массива случаев нами была выделена группа лиц количеством 130 человек давность наступления смерти, которых на момент осмотра трупа в морге не превышала 12 ч. Также была сформирована группа контроля -субъекты до 35 лет погибшие в результате насильственной смерти, без признаков употребления наркотических веществ внутривенно - 100 человек, давность наступления смерти которых, на момент осмотра трупа в морге также не превышала 12 ч. Проводился забор венозной крови (4-5 мл) с антикоагулянтом и последующим получением взвеси лейкоцитов, из которой выделяли ДНК методом перхлоратной экстракции с этанольным осаждением [7]. Исследование полиморфизма генов изоферментов цитохрома Р450, “медленных” мутантных аллелей СУР 2D6*3*4•, CYP2C19*2*3 проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПДРФ анализ).
Использованы олигонуклеатидные праймеры синте-
зированные в институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). Амплификацию проводили в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl (pH 8,9), 50 мМ KCl, 1,7 мМ MgCl, 0,05% Tween 20, с добавлением 0,2 мМ-ого раствора dNTP, 0,5 мкМ-раство-ра праймеров, 20 нг ДНК и 1,0 ед. акт. Taq- ДНК-полиме-разы. Реакционную смесь в объеме 20мкл покрывали 40мкл минерального масла. ПЦР проводили на ампли-фикаторе “Терцик” (“ДНК-Технология”, Москва). Анализ рестрикционных смесей проводили с помощью электрофореза в 3%-м агарозном геле с бромистым этидием.
Результаты исследований были статистически обработаны при помощи углового преобразования Фишера и X2. Статистически достоверными считали различия при р<0,05.
Частоты встречаемости аллелей генов ИЛ-ф в исследуемой и контрольной группах соответствовали закону распределения Харди-Вайнберга.
Результаты и обсуждение
При исследовании полиморфных вариантов генов CYP2D6*3*4*6 для удобства анализа, а так же поскольку 6 аллель встречалась редко, полиморфизм гена генов CYP2D6, мы описывали с учетом только аллели 3 и 4. Мы получили 6 групп с генотипами 1/3 1/1 и 3/3 соответственно по 3 аллели и 1/1, 1/4 и 4/4 по 4 аллели. После этого мы вычислили частоту встречаемости данных генотипов среди исследуемых лиц и в группе контроля, а так же частоту встречаемости аллелей соответственно. Достоверный уровень статистической значимости различия был получен при исследовании CYP2D6*3, аллель 3/3. По 4 аллели достоверный уровень статистической значимости различия выявлен не был, хотя в группе лиц, погибших в связи с употреблением наркотиков, доля наблюдений с генотипом 4/4 возрастала.
Среди исследований генотипов CYP2C19*2*3, которое проводилось таким же образом, распределение генотипов и аллелей в исследуемых группах и группе контроля не достигло статистической значимости различия, но количество гомозиготных (медленных) аллелей 2/2 и 3/3 в исследуемой группе лиц погибших в связи с употреблением морфина возрастало.
В группе гомозиготных носителей медленных мутантных аллелей OYP2D6 и CYP2C19 были идентифицированы лица, возраст которых составлял от 16 до 20 лет, стаж употребления наркотиков от 1 инъекции до 1 года. При этом, проанализировав результаты количественного определения наркотика в крови этой группы наблюдений, мы установили, что концентрация морфина в крови трупов колебалась от следовых количеств до 0,5 мг/л (табл. 1).
Распространенные метаболизаторы погибают при средних и высоких концентрациях морфина в крови (14,0 мг/л).
После этого мы проанализировали причины смерти лиц погибших в связи с употреблением морфина среди носителей гомозиготных медленных мутантных аллелей CYP2D6 и CYP2C19. Непосредственной причиной смерти медленных метаболизаторов явилась острая дыхатель-
ная недостаточность. При этом на секции, мы наблюдали: признаки острой эмфиземы и дистелектазов в легких, субплевральные кровоизлияния, периваскулярные кровоизлияния в стволе головного мозга, острое венозное полнокровие внутренних органов. Следовательно, мы можем говорить о так называемой “смерти на игле” при введении сравнительно небольшой дозы наркотического вещества, которая для них явилась смертельной.
Определяющим в морфогенезе острого отравления опиатами является полиморфизм генов, контролирующих скорость первой фазы метаболизма ксенобиотиков. Медленные метаболизаторы (гомозиготы по мутантным аллелям СYP2D6*3*4•• СУР2С19*2*3) погибают при сверхмалых концентрациях морфина в крови (до 0,5 мг/л). Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов СYP2D6*3 и СYP2D6*4 выявил достоверные отличия между лицами, употреблявшими наркотические вещества и группой контроля.
По результатам исследования изоферментов цитохрома Р450 можно полагать, что острые отравления характерны в основном в случаях, где манифестируют медленные метаболизаторы ксенобиотиков - гомозиготные носители “медленных” мутантных аллелей генов CYP2D6 и CYP 2С19.
Гены, кодирующие ИЛ-1 в и ИЛ-Ша кластеризуются на длинном плече хромосомы 2 [1]. Генетический полиморфизм найден в обоих генах. Для нуклеотидной замены С+3953Т в 5 экзоне ИЛ-1Р и ЖГИ повтора во втором интроне ИЛ-Ша гена (УОТК-тй2) доказана связь различных аллелей с продукцией соответствующих цитокинов.
Аллель Т полиморфного локуса С+3953Т большинство исследователей связывают с повышенной продукцией ИЛ-1 в [1] и, соответственно, с предрасположенностью к развитию воспалительных заболеваний. Полученные нами данные по генотипированию точечной нуклеотидной замены С+3953Т ИЛ-1Р представлены в таблице 2. Статистически значимые различия наблюдаются для гомозигот по аллелю Т, которые встречаются чаще в исследуемой группе (х2, р=0,025).
В гене ИЛ-1 Иа существует полиморфизм в интроне 2 в результате присутствия различного количества тандемных повторов с длинной 86 п.н. В настоящий момент описано 5 аллелей, которые обозначаются как 2И, 3И, 4И, 5И и 6И в соответствии с числом тандемных повторов. Наиболее часто в человеческой популяции встречаются аллели 2И и 4И. Остальные аллели встречаются с частотой не более 2%. С аллелем 2И связано повышение базального уровня ИЛ-Ша, а также увеличение продукции ИЛ-1Р стимулированными моноцитами [1, 6]. Данный аллель ассоциирован с различными воспалительными и иммунозависимыми заболеваниями. [1, 5] и т.д.
При изучении полиморфного локуса УЭТК-тй2 гена ИЛ-Ша нами было выявлено два аллеля с 2, 4 тандемными повторами. Наиболее высокая частота встречаемости в обеих группах была у аллеля 4И, что соответствует общепопуляционной закономерности. Аллель 2И, который зарекомендовал себя как маркер воспалительных заболеваний, встречался более часто в исследуемой нами группе, чем в группе контроля. Статистически значимое различие в частотах встречаемости аллелей и генотипов
Таблица 1
Абсолютные показатели распределения концентрации наркотика в крови трупа среди гомозиготных аллелей СYP 2D6*3*4; CYP2C19*2*3
Концентрация наркотика в крови трупа Гомозиготные аллели CYP2D6*3*4 Гомозиготные аллели CYP2C19*2*3
3/3 4/4 3/3 2/2
Менее 0,5мг/л Более 0,5мг/л 22 1 8 1 1 6 1
Таблица 2
Частота встречаемости генотипов полиморфного локуса С+3953Т ИЛ-1Р в группах лиц, употреблявших наркотики и контроле
Генотип Лица, погибшие при употреблении наркотиков 1 93 Контроль 1 100 Уровень статистической значимости различия
Количество (шт.) Частота встреча- емости Количество (шт.) Частота встреча- емости
С/С 46 0,49 61 0,60 Р>0,05
С/Т 37 0,40 39 0,37 Р>0,05
Т/Т 10 0,11 2 0,03 Р<0,05
между группой лиц погибших в результате хронической наркотической интоксикации и контроля нами выявлено не было. Однако в группе лиц погибших в результате хронической наркотической интоксикации доля субъектов с генотипом 2И/2И и аллелем 2И возрастала. Такое увеличение носителей аллеля 2И, обуславливающее большую продукцию ИЛ1-Иа на фоне увеличения продукции самого ИЛ-1Р, вполне закономерно. Полагают, что при реализации воспалительного ответа у носителей генетически обусловленного перевеса в сторону выработки ИЛ-Ша количество этого белка больше чем необходимо для адекватной реализации воспаления, что вызывает компенсаторное образование еще большего количества ИЛ-1р. При этом продукция ИЛ-Ша тоже увеличивается. Таким образом, носительства сочетаний генов ИЛ-1Р и ИЛ-Ша, определяющих перевес в сторону выработки ИЛ-Ша, приводит к более продолжительному воспалительному ответу с выраженной тенденцией к хронизации.
При рассмотрении гаплотипов обращала на себя внимание комбинация аллелей ИЛ-Ша 2И/2И+/ИЛ-1Р Т/Т+. В нашей выборке из 10 человек с генотипом ИЛ-1 р Т/Т ни один не имел генотип ИЛ-Ша-2К/2И, и из 7 человек с генотипом ИЛ-Ша-2К/2И не встретилось ни одного с генотипом ИЛ-1Р Т/Т. Логично было бы предположить, что при наличии этих двух провоспалительных генотипов увеличится вероятность крайне тяжелого течения воспалительных процессов. Возможно, носители данных сочетаний, в связи с редкой частотой их встречаемости, не попали в число лиц прошедших генотипирование. Дан-
ные о носительстве двух одинаковых гаплотипов в литературе отсутствуют. Можно предположить, что совместное носительство высокопродуцирующих аллелей элиминируется из популяции, поэтому функциональная мутация в одном из этих генов чаще встречается в сочетании с не мутантным аллелем другого из них.
Возможно, здесь имеет значение именно определенное соотношение продукции данных цитокинов. Так при небольшом увеличении соотношения в сторону провос-палительного ИЛ-1 в (гаплотипы ИЛ-Ша 2И/2И-/иЛ-1 в Т/ Т+ и ИЛ-Ша 2И/2И+/ИЛ-1в Т/Т-) наблюдается предрасположенность к воспалительным заболеваниям, а сильный перевес в сторону ИЛ-1в (гаплотип ИЛ-Ша 2И/2И+/ ИЛ-1 в Т/Т+) элиминируется из популяции или проявляется в более тяжелых формах заболеваний. В связи с этим логично сделать вывод о благоприятном прогнозе для носителей гаплотипа ИЛ-Ша 4И+/ ИЛ-1 в С+, однако данная гипотеза требует дальнейшего рассмотрения на большей выборке образцов для возможности более точного статистического анализа.
В нашем массиве случаев был выявлен ряд, часто встречающихся основных причин смерти лиц, употреблявших наркотические вещества опийной природы внутривенно. Их можно разделить на три основные группы. Первая группа это причины смерти связанные непосредственно с действием наркотика на организм: острые отравления опиатами. Вторая группа - причины смерти связанные с использованием не стерильного инструмента для инъекций, а также связанные с иммуносупрессивным действием наркотика на организм - сепсис, гепатит, пневмонии различной этиологии. Третья группа это причины смерти, патогенетически связанные с развитием хронической гипоксии органов и тканей, обусловленной действием наркотических веществ на центральную нервную систему, реализующееся через эпизодическое угнетение деятельности дыхательного центра - кардиоми-опатии, диффузный кардиосклероз.
В нашей работе мы проанализировали взаимосвязь ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов ИЛ-1 в (С+3953Т) с причинами смерти лиц погибших в результате острой и хронической наркотической интоксикации. Результаты представлены в таблице 3.
По нашим данным, в группе лиц носителей “не воспалительного” генотипа С/С среди причин смерти преобладали острые отравления наркотиками и патология системы кровообращения - кардиомиопатия. В группе лиц
Таблица 3
Соотношение основных причин смерти и воспалительных и невоспалительных генотипов
Причина смерти Генотип
1-0 1^' 1— 3 Т/Т, N=10
Острое отравление наркотиками Дилатационная кардиомиопатия 20, 0,43 5, 0,13 1, 0,1
и острая коронарная недостаточность 24, 0,53 10, 0,27 0
Гепатит и цирроз 1, 0,2 11, 0,3 2, 0,2
Пневмония 1, 0,2 11, 0,3 3, 0,3
Сепсис 0 0 4, 0,4
носителей “воспалительного” аллеля Т в генотипе, чаще присутствовали причины смерти связанные с развитием острого, хронического и ациклического воспаления в органах и тканях: гепатит, пневмонии различной этиологии, сепсис, пневмонии, туберкулез.
В этих группах нами была проанализирована длительность наркотического стажа. В первой группе с генотипом С/С преобладали лица со стажем употребления наркотиков до 1 года, а также более 5 лет. Во второй группе с генотипом С/Т преобладали лица с длительностью стажа употребления наркотиков 1-5 лет. В третьей группе с генотипом Т/Т, также преобладали лица с длительностью стажа употребления наркотиков 1-5 лет. Наркоманы носители высокопродуцирующего аллеля Т 1Ь-1 в имеют измененный иммунологический профиль. У этой категории лиц наблюдается быстрое прогрессирующее течение бронхитов, пневмоний, а так же туберкулеза, сепсиса, хронического гепатита с исходом в цирроз. Эти заболевания, в патогенезе которых лежит воспалительный процесс определяют спектр причин смерти и выживаемости в периоде от 1 года до 5 лет употребления алкалоидов опия. В ходе лечения, лиц злоупотребляющих наркотическими веществами либо употребляющих таковые с медицинскими целями необходимо исследование полиморфизма гена ИЛ-1 р. Наличие провоспалительного генотипа представляют собой потенциальный риск развития воспалительных осложнений наркомании и возможно крайне тяжелое течение гепатита, сепсиса, туберкулеза. Это требует специальной коррекции. В противном случае наличие вышеуказанного генотипа определяет крайне тяжелый прогноз хронической наркотической интоксикации.
Для оценки спорных и сложных случаев отравления сверхмалыми дозами опиатов (менее 0,5 мг/л) в крови следует помимо морфологической картины и непосредственной причины смерти исследовать генетический полиморфизм СУР 2D6*3*4
Таким образом, однозначно выявляются медленные метаболизаторы, которые погибают сразу после инъекции обычной и даже небольшой дозы наркотика, а распространенные и быстрые метаболизаторы, которые погибают, как правило, через несколько лет после начала употребления наркотиков.
Исходя из полученных в работе результатов, мы полагаем, что имеется реальная необходимость исследования полиморфных вариантов генов (СYP2D6*3 и СYP2D6*4, СУР2С19*2 и СуР2С19*3) на предмет выявления медленных метаболизаторов. Это позволит не применять с медицинскими и иными целями анальгетики с морфинным циклом.
Учитывая тот факт, что генетическая характеристика метаболизма сохраняется в течение всей жизни необходимо доводить эту информацию (конкретные варианты СYP2D6*3 и СYP2D6*4, СУР2С19*2 и СУР2С19*3) до сведения пациента и отмечать в медицинской документации.
Совершенно очевидно, что эта группа лиц подвержена риску внезапной смерти при любых вариантах употребления веществ с морфинным циклом.
Литература
1. Громова А.Ю., Симбирцев А.С. Полиморфизм генов семейства IL-1 человека // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4. № 2. - С. 3-12.
2. Смольникова М.В., Коненков В.И. Клиническая иммуногенетика заболеваний человека // Медицинская иммунология. - 2001. - Т. 3. - С. 379-389.
3. Шабанов ПД. Наркология: Практическое руководство для врачей. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2003. - С. 320-325.
4. Nicklin M.J., Weith A., Duff G.W. A physical map of the region encompassing the human interleukin-1 alpha, interleukin-1 beta, and interleukin-1 receptor antagonist genes // Genomics.
- 1994. - No. 19. - P. 382-384.
5. Pociot F., Molvig J., Wogensen L. A TaqI polymorphism in the human interleukin-ip (IL-1 P) gene correlates with IL-1 p secretion in vitro // Eur. J. Clin. Invest. - 1992. - No. 22. -P. 396-402.
6. Hacker U.T., Erhardt S., Tschop K. et al. Influence of the IL-iRa gene polymorphism on in vivo synthesis of IL-iRa and IL-1beta after live yellow fever vaccination // Clin. Exp. Immunol. - 2001.
- No. 125. - P 465-469.
7. Santtila S., Savinainen K., Hurme M. Presence of the IL-1RA allele 2 (IL1RN*2) is associated with enhanced IL-1beta production in vitro. // Scand. J. Immunol. - 1998. - No. 47. - P. 195-198.
Поступила 26.09.2010
