CC BY
119
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© ХАСНАТИНОВ М.А., ДАНЧИНОВА Г.А., ЗЛОБИН В.И., ЛЯПУНОВ А.В., АРБАТСКАЯ Е.В., ЧАПОРГИНА Е.А., АБМЭД Д., БАТАА Ж., ЦЭРЭННОВОВ Д., ОТГОНБААТАР Д. - 2012 УДК 578.4
ВИРУС КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА В МОНГОЛИИ
Максим Анатольевич Хаснатинов1, Галина Анатольевна Данчинова1, Владимир Игоревич Злобин2, Александр Валерьевич Ляпунов1, Елена Валентиновна Арбатская1, Елена Александровна Чапоргина1, Даваажав Абмэд3, Жантсо Батаа3, Дамдиндорж Цэрэнноров4, Дашдаваа Отгонбаатар4 ('Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАН, г. Иркутск, Россия, директор - д.м.н., чл.-корр. РАМН, проф. Л.И. Колесникова, лаборатория трансмиссивных инфекций, руководитель -д.б.н. Г.А. Данчинова; 2Иркутский государственный медицинский университет, Россия, ректор - д.м.н., проф. И.В. Малов; Национальный Центр по изучению инфекционных болезней, Улан-Батор, Монголия, директор -д.м.н. Д. Нямхуу; 4Национальный Центр по изучению природно-очаговых инфекций, Улан-Батор, Монголия,
директор - д.м.н. Д. Отгонбаатар)
Резюме. В данной работе мы приводим результаты изучения основных биологических характеристик вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), циркулирующего на территории Монголии. Результаты молекулярно-генетических исследований показывают, что возбудители клещевого энцефалита в Монголии наиболее генетически близки ВКЭ из сопредельных районов Российской Федерации и относятся к Сибирскому и Дальневосточному субтипам. Вирусы КЭ, обитающие в северной Монголии, способны эффективно размножаться в клетках млекопитающих, нейрови-рулентны для модельных животных и обладают выраженной нейроинвазивностью. Кроме того, ВКЭ в Монголии могут вызывать смертельные случаи заболевания человека. Наибольшим риском заражения человека отличаются Селенгинский и Булганский аймаки Монголии.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, Монголия.
TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS IN MONGOLIA
M.A. Khasnatinov1, G.A. Danchinova1, V.I. Zlobin2,A.V. Liapunov1, E.V. Arbatskaya1, Е.А. Tchaporgina1,
D. Abmed3, J. Bataa3, D. Tserennorov4, D Otgonbaatar4 ('Scientific Center of Family Health and Human Reproduction Problems SB RAMS, Irkutsk, Russia;
2Irkutsk State Medical University, Irkutsk, Russia; 3The National Center for Communicable Disease,
Ulanbaatar, Mongolia; 4The National Center of Infectious Diseases with Natural Foci, Ulanbaatar, Mongolia)
Summary. In this work we present the results of the study of main biological characteristics of TBEV in Mongolia. The genetic characteristics of Mongolian TBEV indicate that Far Eastern and Siberian subtypes are most common in Mongolia and viral populations are closely related to TBEV from neighbor regions of Russia - Buryat Republic and Irkutsk Region. TBEV isolated in Mongolia are able to effectively reproduce in mammalian cells and are both neurovirulent and neuroinvasive for model animals. Besides this the TBEV in Mongolia is proven to cause fatal encephalis in humans. The highest risk of human infection with TBEV in Mongolia is the feature of Selenge and Bulgan aimags.
Key words: tick-borne encephalitis virus, Mongolia.
Клещевой энцефалит (КЭ) - это инфекционное заболевание, распространенное в лесной и лесостепной зоне Северной Евразии. Возбудитель КЭ - вирус, который передается человеку при укусе иксодовых клещей. Ежегодно в мире происходит порядка 10000 новых случаев заболеваний КЭ [7].
В настоящее время на основе фенотипических и генетических различий выделяют 3 субтипа ВКЭ - дальневосточный (ДВ ВКЭ), сибирский (СИБ ВКЭ) и европейский (ЕВР ВКЭ). Основным переносчиком первых двух субтипов является таежный клещ Ixodes persulcatus, который распространен в лесной и лесостепной зоне Азии и Восточной Европы, вплоть до Прибалтики. Основной переносчик вирусов Европейского субтипа - клещ I. ricinus, обитающий в лесах Западной и Восточной Европы до Урала [8].
В Монголии ВКЭ выявлен в 80-х гг. ХХ века [5], с 2001 г. начата официальная регистрация заболеваемости населения КЭ, при этом в 2005-2008 гг. отмечено 75 случаев заболеваний людей. В 1998-2005 гг. охарактеризованы природные очаги КЭ в Северной Монголии, а также проведены работы по идентификации ВКЭ в клещах I. persulcatus [1] Однако до настоящего времени очень мало известно о биологических и патогенетических характеристиках ВКЭ, циркулирующих в природных очагах Монголии. В данной работе мы приводим результаты изучения основных биологических характеристик ВКЭ, обитающих на территории Монголии.
Материалы и методы
Клещи и вирусы. Оценку численности переносчиков и отлов клещей проводили на ключевых участках, расположенных в лесной и лесостепной зоне Северной Монголии (рис. 1), по стандартной методике [2]. Идентификацию клещей производили по морфологическим признакам в соответствии с определителями фауны иксодовых клещей СССР [3,4]. Каждого клеща промывали 2 раза в 70% этаноле, 1 раз в стерильной дистиллированной воде, обсушивали на фильтровальной бумаге, суспендировали в стерильном фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) и центрифугировали. Зараженность клещей ВКЭ определяли с помощью иммунофермент-ного анализа с тест-системой «ИФА ТС АГ ВКЭ» (ФГУП «Микроген», Москва) согласно инструкции производителя. Супернатанты образцов, содержащих антиген ВКЭ, использовали для заражения монослоя клеточной линии СПЭВ (почка эмбриона свиньи) и для выделения РНК.
Вирусы и образцы РНК. Свойства исследованных образцов ВКЭ приведены в таблице 1.
ОТ-ПЦР и секвенирование: РНК выделяли из суспензий клещей и из культуральной среды с помощью наборов Рибо-Сорб (Амплисенс, Москва) согласно инструкции производителя. Обратную транскрипцию проводили с 11 мкл раствора РНК с помощью реверта-
зы Superscript II (Invitrogen) и случайных гексануклеотидов согласно инструкции производителя. Для амплификации фрагмента белка Е использовали праймеры TBEV-1089f (5'-YTCRATGGAYGTGTGGCTTGA-3') и TBEV-1643R (5'-GCCAGATCATTRAACCAGTC-3' и ДНК полимеразу «ДиаTaq» (Амплисенс, Москва). ПЦР-фрагменты очищали с помощью электрофореза в геле 0,8% агарозы и секвенировали с использованием ПЦР-праймеров. Секвенирование проводили с помощью анализатора Beckman Coulter Genetic Sequencing System 1800 (USA) и соответствующих наборов реагентов.
Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. Филогенетический анализ проводили по методу Maximum Parsimony. Кроме того, этот же набор последовательностей был проанализирован с использованием дистантных методов. Для расчета генетических дистанций использовали модель эволюции Tamura-Nei (Tamura and Nei, 1993). Для построения топологических схем использовали метод объединения ближайших соседей (neighbor-joining). Оценку достоверности реконструкции эволюционных взаимоотношений проводили с помощью бутстреп-анализа на основе 1000 повторов. Филогенетический анализ проводили с помощью инструментов программы MEGA 4.1. (Kumar,
Tamura, Nei, 2004).
Репродукция в культуре клеток млекопитающих. Эффективность репродукции ВКЭ в клетках млекопитающих оценивали в культуре клеток СПЭВ. Концентрацию инфекционного вируса, а также морфологию бляшек определяли с помощью титрования бляшкообразующих единиц (БОЕ/ мл) согласно Gould и Clegg, 1985 [5].
Каждый эксперимент проводили в 3 независимых повторах. Для оценки вариабельности результатов рассчитывали стандартную ошибку средних значений.
Оценка вирулентности на модели белых мышей. Беспородных белых мышей заражали подкожным (2000 БОЕ вируса) или внутримозговым (100 БОЕ) способом. Для каждого эксперимента использовали группу из 10 мышей и контрольную группу мышей, инфицированных чистой культуральной средой. Мышей наблюдали в течение 28 дней. При появлении признаков заболевания проводили безболезненную эвтаназию и забор материала. Для оценки вариабельности результатов рассчитывали стандартную ошибку средних значений.
Этическая экспертиза. Дизайн исследования одобрен Комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН. Работы с лабораторными животными проводились в соответствии с моральными и этическими требованиями к биомедицинским исследованиям с использованием лабораторных животных.
Таблица 1
Характеристика образцов ВКЭ из Монголии
Образец (форма) Источник изоляции Год изоляции Место изоляции (согласно рис.1)
92М (изолят) I. persulcatus 2001 3
940М (изолят) I. persulcatus 2001 1
283\9 (РНК) I. persulcatus 2005 1
290\2 (РНК) I. persulcatus 2005 1
TBEV-MN-2008 Human patient 2008 9, 10
Результаты и обсуждение
Исследование клещей, отловленных на ключевых участках (рис.1), показало, что природные очаги КЭ в
Северной Монголии приурочены к распространению основного переносчика вируса КЭ (ВКЭ) - таежного клеща I. репи1саШ$. В этих районах проходит южная граница ареала этих клещей и, соответственно, южная граница распространения ВКЭ. Численность имаго таежных клещей на территории Монголии варьирует от 0,2 до 43 особей на флаго/км и достигает наибольших показателей в Селенгинском, Булганском и Центральном аймаках. Средняя зараженность клещей ВКЭ варьирует от 1,2% до 5,9% в разных аймаках, однако, для ряда аймаков (Центральный, Хэнтийский, Орхонский, Хубсугульский) зараженность ВКЭ установить не удалось из-за низкой численности клещей и, соответственно, малочисленных выборок.
Из клещей I. репикаШ$, отловленных на территории Монголии в 2001 г., нами были получены и охарактеризованы 2 изолята вируса КЭ - 92М и 940М. Вирус 92М изолирован из самки клеща, отловленной на территории Центрального аймага, сомон Мандал. Вирус 940М изолирован на территории сомона Худэр (Селенгинский аймак) в непосредственной близости от Российско-Монгольской границы. Концентрация инфекционного вируса в культуральной среде достигает 4,2х108 (для штамма 92М) и 3,8х108 (для штамма 940М) БОЕ/мл. При этом деструкция монослоя клеток в обоих случаях составляет порядка 90%. Оба вируса формируют бляшки, диаметр которых достоверно не отличается и составляет 3,9±0,15 для 92М и 4,2±0,6мм для изоля-та 940М. Морфологически бляшки мутные, крупные, неправильной формы, что характерно для вирусов сибирского субтипа. Для штамма вируса 940М характерно усиленное разрушение монослоя клеток в центре бляшки (рис. 2). Также оба вируса формируют иммунный ответ у взрослых белых мышей. При заражении штаммом 92М антигемагглютинины в детектируемой концентрации появляются на 8 день после заражения, при заражении штаммом 940М - на 7 сутки. Пиковые концентрации антигемагглютининов наблюдаются на 13 и 17 день после заражения соответственно. Титры антигемагглю-тининов в сыворотках крови мышей, инфицированных вирусом 92М, достигают 1:320 при внутримозговом и 1:40 - при подкожном заражении. При инфицировании вирусом 940М титры антител, напротив, достигают 1:40 при внутримозговом заражении и 1:320 - при подкожном заражении. Средний титр антигемагглютиниов при заражении штаммом 92М составляет 121,6±62,8 (внутримозговое заражение) и 18,6±4 (подкожное заражение), для второго штамма (940М) эти показатели составляют 23,75±3,75 и 153,3±39,2 соответственно.
Анализ нейровирулентности проводили на осно-
Рис. 1. Сеть ключевых участков для изучения вируса клещевого энцефалита в северной Монголии. Точки с цифрами обозначают соответствующие места учета численности и отлова клещей.
940М
Рис. 2. Репродукция изолятов ВКЭ из Монголии в культуре клеток млекопитающих (клеточная линия почки эмбриона свиньи СПЭВ).
А) Титр вируса на 4 сутки репликации.
Б) морфология бляшек.
ве данных только от тех животных, в сыворотке крови которых обнаружены антигемагглютинины к ВКЭ. При внутричерепном заражении оба вируса нейрови-рулентны для взрослых белых мышей. Инкубационный период составляет 6-14 дней.
Заболеваемость при инфицировании обоими вирусами примерно одинакова - 75% для изолята 92М и 80% для изолята 940М, однако средняя продолжительность жизни заболевших мышей существенно выше при заражении штаммом 92М (10,3±1,4 дня) чем при заражении штаммом 940М (7,75±0,4 дня). При подкожном заражении смертность достигает 22,2% при инфицировании вирусом 92М и в два раза ниже (11,1%) при заражении вирусом 940М. Продолжительность жизни заболевших мышей при этом составляет 11,5±0,5 дня при заражении штаммом 92М и 17 дней при заражении штаммом 940М.
Для обоих вирусов расшифрована полноразмерная нуклеотидная последовательность гена Е белка оболочки. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что оба вируса проявляют наибольшее сходство последовательностям ВКЭ сибирского субтипа, изолированным в Восточной Сибири (Иркутская область), от клещей I. репи1саШ$. При этом вирус 92М формирует отдельную ветвь. Кроме того, получены нуклеотидные последовательности фрагментов гена Е для двух коллекционных образцов
РНК ВКЭ из клещей I. репи1саШ$ 290/2 и 283/9, отловленных в Селенгинском аймаке (участок 1, рис. 1) в 2005
г. Оба вируса также кластеризовались с изолятами из Иркутской области IR99-2f13 и IR99-2m3 (рис. 3).
В ходе изучения этиологии клещевых инфекций в Монголии в 2008 г. нами впервые получено биологическое подтверждение смерти человека от КЭ в Монголии. Образцы тканей умершего были взяты в соответствии с 40-м разделом «Закона о здоровье» Республики Монголия для подтверждения диагноза болезни и причины гибели больного. Забор выполнялся с соблюдением норм биомедицинской этики. РНК вируса КЭ была обнаружена в тканях головного мозга больного менингоэнце-фалитом, пострадавшего от укуса клеща в Булганском аймаке (ключевые участки 9 и 10, рис. 1). Для образца TBEV-MN-2008 был расшифрован фрагмент гена Е ВКЭ длиной 520 н.о. Фрагмент локализован в позициях 1124-1643 генома ВКЭ (здесь и далее позиции даны по геному вируса Vasilchenko, GenBank № L40361) и захватывает фрагмент белка Е ВКЭ между аминокислотными остатками (а.о.) 52 и 223. Наиболее филогенетически родственным оказался вирус 740-84 (EU878282), изолированный в 1984 г. в Бичурском районе Бурятии от красно-серой полевки (Clethrionomus rufocanus), а также ряд изолятов дальневосточного субтипа ВКЭ (сходство 89,6%). Наименьшее сходство - менее 85% - было с изо-лятами Европейского субтипа (рис. 3).
В целом, нами установлено, что в Монголии циркулируют популяции возбудителей клещевого энцефалита близкородственные ВКЭ, обитающим на сопредельных территориях Российской Федерации. Вирусы клещевого энцефалита, обитающие в северной Монголии, способны эффективно размножаться в клетках млекопитающих, нейровирулентны для модельных животных и об-
Zausaev group -вт Baltic group ▲ TBEV 92М Consensus m- Vasilchenko L40361 P Aina
|r Irkutsk-112-79
Ж--- '
352-81 г TBEV Z 14 EF566815 1942
”1 TBEV 1128 EU443274 L- TBEV Z 7 EF566818
_г Kemerovo-K34-67
* TBEV Z 10 EF566813 Ir □ IR99-lml '— A TBEV 940M Consensus ra- □ IR99-2fl3 □ IR99-2m3 Hi A. MNG-Ip-290\2 A MNG-Ip-283\9 Semeks group
г- □ 740-84 EU878282 JL ▲ MNG-TBE2008 107 and 108 V- □ 617-90 EU878283 lD 711-84 EU878281 - □ 886-84 EF469662
178-79 EF469661 -Senzhang - Glybinnoe/2004 -------Hehcir
SIBERIAN SUBTYPE
FAR-EASTERN SUBTYPE
---DXAL-18
-----Oshima group
mi Ekaterinburg-Bersenev
___Ц Ekaterinburg-Vinokurov
У 1------DXAL5 China
I ^ Sofjin group WESTERN EUROPEAN SUBTYPE
Kyasanur forest disease virus
Puc. 3. Филогенетические взаимосвязи ВКЭ из Монголии (обозначены черным треугольником) и на сопредельных территориях РФ (обозначены белым квадратом). Реконструкция проведена на основе анализа фрагмента гена Е белка оболочки ВКЭ с помощью метода neighbor joining. Эволюционные дистанции рассчитывали с помощью метода Tamura-Nei 93. Достоверность реконструкции оценивали с помощью бутстреп-анализа на основе 1000 псевдовыборок.
ладают выраженной нейроинвазивностью. Кроме того, ВКЭ в Монголии могут вызывать смертельные случаи заболевания человека. Наибольшим риском заражения
человека отличаются Селенгинский и Булганский аймаки Монголии. С учетом интенсивного хозяйственного освоения этих районов, необходимо проведение широкого спектра профилактических мер как для местного населения, так и для туристов, посещающих эти районы.
Авторы выражают благодарность сотруднику ФГУС Роспотребнадзора в Иркутской области М.М.
ЛИТЕРАТУРА
1. Данчинова Г.А., Хаснатинов М.А., Злобин В.И. и др. Современная ситуация по клещевому энцефалиту в Монголии // Материалы расширенного пленума проблемной комиссии «Клещевой энцефалит и другие вирусные энцефалиты». - М., 2003. - С.36-37.
2. Нецкий Г.И. Учет и прогноз изменений численности клещей Ixodes persulcatus P. Sch. и Dermacentor pictus Herm. в природных очагах клещевого энцефалита, омской геморрагической лихорадки и туляремии в Западной Сибири: Метод. указания. - Омск: Омский НИИ природноочаговых инфекций, 1972. - 13 с.
3. Сердюкова Г.В. Иксодовые клещи фауны СССР. - М., Л.: Изд-во АН СССР, 1956. - 122 с.
Верхозиной (Иркутск), сотруднику Лимнологического института СО РАН Н.В. Кулаковой (Иркутск) и сотрудникам Национального Центра по изучению природноочаговых инфекций МЗ Монголии и. ипиг8а1кЬап и В. и^гаа (Улан-Батор) за помощь в лабораторных исследованиях.
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №08-04-90206-Монг_а и и РФФИ№11-04-92221-Ыо^_а.
4. Филиппова Н.А. Иксодовые клещи подсем. Ixodinae // Фауна СССР. Паукообразные. - Т. IV (4) - Л.: Наука, 1977. -396 с.
5. Абмэд Д., Нимадава П., Андреев В.П. и др. Исследование по арбовирусным инфекциям в МНР Сообщение II. Изоляция вируса клещевого энцефалита в Селенгинском аймаке // Мон тезис. - 1990. - №22.
6. GouldE.A., CleggJ.C.S. Growth, titration and purification of togaviruses // B. W. J. Mahy (ed.), Virology: A Practical Approach.
- IRL Press, 1985. - P43-48.
7. Kunz C, Heinz FX. Tick-borne encephalitis // Vaccine. -2003. - Vol. 21. - P1-2.
8. LindquistL., Vapalahti O. Tick-borne encephalitis.// Lancet.
- 2008. - Vol. 371. - P1861-1871.
Информация об авторах: Хаснатинов Максим Анатольевич - ведущий научный сотрудник, к.б.н., 664025, Иркутск, а/я 525, тел. (3952) 333971; e-mail: khasnatinov@yandex.ru; Данчинова Галина Анатольевна - руководитель, д.б.н.; Злобин Владимир Игоревич - заведующий кафедрой, академик РАМН, д.м.н., профессор; Ляпунов Александр Валерьевич -научный сотрудник, к.б.н.; Арбатская Елена Валентиновна - научный сотрудник; Чапоргина Елена Александровна -старший научный сотрудник, к.б.н.; Даваажав Абмэд - руководитель группы, д.б.н.; Жантсо Бата - заведующий отделом, д.б.н.; Дамдиндорж. Цэрэнноров - заместитель директора, д.м.н.; Дашдаваа. Отгонбаатар - директор, д.м.н.
© ЛЕОНОВА Г.Н., ПАВЛЕНКО Е.В., МАЙСТРОВСКАЯ О.С., БЕЛИКОВ С.И., КОНДРАТОВ И.Г. - 2012 УДК: 577.123
ВИРУЛЕНТНОСТЬ ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, ИЗОЛИРОВАННЫХ ОТ ЛЮДЕЙ С РАЗНЫМИ ФОРМАМИ ИНФЕКЦИИ
Галина Николаевна Леонова1, Елена Владимировна Павленко1, Ольга Сергеевна Майстровская1, Сергей Иванович Беликов2, Илья Геннадьевич Кондратов2 ('Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток, директор - д.м.н., проф. Л.М. Сомова; 2Лимнологический институт СО РАН, Иркутск, директор -
д.х.н., акад. РАН М.А. Грачев)
Резюме. На основании данных, полученных в трех сериях экспериментов, представлена характеристика 11 штаммов вируса клещевого энцефалита. Комплексные исследования, направленные на изучение молекулярной характеристики и вирулентности в частности нейроинвазивности, показали значительные различия инфекционного потенциала штаммов, изолированных от людей с очаговыми формами КЭ и от лиц с инаппарантной формой. Штаммы, вызвавшие манифестные по сравнению с инаппарантными формами инфекции, обладали выраженной нейроинвазивностью, быстрее проникали через гематоэнцефалический барьер и вызывали быструю потерю веса белых мышей с последующей их гибелью.
Ключевые слова: штаммы вируса клещевого энцефалита, молекулярная характеристика, нейроинвазивность, вирулентность.
THE VIRULENCE OF STRAINS OF TICK BORNE ENCEPHALITIS VIRUS ISOLATED FROM HUMANS
WITH DIFFERENT FORMS OF INFECTION
G.N. Leonova1, E.V. Pavlenko1, O.S. Maistrovskaya1, S.I. Belikov2,1.G. Kondratov2 ('Research Institute of Epidemiology and Microbiology SB RAMS, Vladivostok, 2Limnological Institute SB RAS, Irkutsk)
Summary. Based on three series of experimental data, we have characterized 11 strains of tick-borne encephalitis (TBE) virus. Complex studies aimed at molecular characterization and virulence in particular of neuroinvasiveness have shown significant differences in infectious potential of the strains isolated from patients with focal forms of TBE and those with inapparent forms of TBE. Unlike inapparent forms, the strains caused clinical infections had a pronounced neuroinvasiveness and penetrated faster through blood-brain barrier causing rapid weight loss in white mice followed by their death.
Key words: tick-borne encephalitis virus strains, molecular characteristic, neuroinvasiveness, virulence.
Исполнилось 75 лет, как был открыт вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) на Дальнем Востоке России. За этот период случаи КЭ стали регистрировать во многих странах Евразии (Китай, Германии, Австрии, Чехии и др.). Но наиболее неблагоприятная обстановка по заболеваемости этой инфекцией наблюдается ежегодно на обширной территории Российской Федерации [7]. С
первых случаев изоляции ВКЭ исследователей интересовала важнейшая биологическая характеристика вируса - вирулентность, для изучения которой до настоящего времени остается классическая модель - белая мышь. Изучали, как правило, штаммы, изолированные из ик-содовых клещей и реже из мозга людей, умерших от КЭ [4]. На протяжении двух последних десятилетий наши
