CC BY
32
УДК 633.11: 632.938
ВИРУЛЕНТНОСТЬ И ДНК-ПОЛИМОРФИЗМ ИЗОЛЯТОВ PUCCINIA TRITICINA ИЗ СЕВЕРНОГО КАВКАЗА И ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ
UDC 633.11: 632.938
VIRULENCE AND DNA-POLYMORPHISM OF PUCCINIA TRITICINA ISOLATES FROM NORTH CAUCASUS AND LENINGRAD REGION
Кудинова Ольга Александровна аспирант
Кремнева Оксана Юрьевна к. б. н.
Kudinova Olga Aleksandrovna post graduate student
Kremneva Oxana Yurievna Cand. Biol. Sci.
Волкова Галина Владимировна д. б. н.
Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений, г. Краснодар, Россия
Проведено сравнение изолятов Puccinia triticina из Северного Кавказа и Ленинградской области по генетической структуре, фенотипическому составу, а также частоте встречаемости RAPD-фенотипов и полиморфных мажорных фрагментов с использованием индекса Роджерса. Не найдено значимых отличий по генетической структуре и по встречаемости мажорных фрагментов ДНК-полиморфизма. Различие изолятов данных регионов с высокой степенью достоверности определено по фенотипам вирулентности и RAPD-фенотипам
Ключевые слова: PUCCINIA ШПат, МОНОПУСТУЛЬНЫЕ ИЗОЛЯТЫ, ФЕНОТИП ВИРУЛЕНТНОСТИ, RAPD-ПОЛИМОРФИЗМ
Volkova Galina Vladimirovna Dr. Sci. Biol.
All-Russian Research Institute of Biological Plant Protection, Krasnodar, Russia
Puccinia triticina isolates from North Caucasus and Leningrad region were compared in regard to the genetic structure, phenotypic composition as well as frequency of occurrence of RAPD-phenotypes and polymorphous major fragments with the help of Rogers index. Did not demonstrate any significant differences according to their genetic structure and occurrence of major fragments of DNA-polymorphism. The difference of isolates from given regions was determined with high degree of confidence according to the phenotypes of virulence and RAPD-phenotypes
Keywords: PUCCINIA TRITICINA, , SINGLEPUSTULE ISOLATES, PHENOTYPE OF VIRULTNCE, RAPD-POLYMORPHISM
Возбудитель бурой ржавчины Puccinia 1гШ^по встречается
повсеместно во всех регионах культивирования пшеницы в мире. В годы эпифитотий потери урожая могут составить до 45% [1], а при умеренном поражении урожай снижается на 5-10%. Ареалы популяций ржавчинных грибов могут быть огромными и занимать целые континенты. Определение границ популяций патогена на территории страны имеет важное значение для стратегии защиты и территориального распределения генов устойчивости. Но определение точного числа популяций гриба затруднительно. Это связано с тем, что классическое понятие этого термина не применимо к возбудителю бурой ржавчины пшеницы,
поскольку гриб зимует в уредостадии и популяция является клональной. Поэтому ареалы популяций P. Пшш авторы определяют, исходя из частоты встречаемости изолятов, вирулентных или авирулентных к близкоизогенным линиям растения-хозяина [2]. В настоящее время существуют две точки зрения в отношении количества популяций на территории России и СНГ. Л. А. Михайлова за многолетний период исследований (1980-2000) выделила три популяции: кавказскую,
европейскую и западно-азиатскую [3]. Другая группа исследователей во главе со Смирновой Л. А. [4], проведя десятилетнее исследование, считает, что северокавказскую популяцию нельзя считать самостоятельной, ее следует рассматривать как субпопуляцию в пределах европейской популяции. Таким образом, согласно Смирновой с соавт., на территории СНГ можно выделить пять популяций возбудителя бурой ржавчины пшеницы:
1. Европейская (Северный Кавказ, Украина, ЦЧЗ).
2. Закавказская.
3. Западносибирская (Урал, Западная Сибирь, Казахстан).
4. Среднеазиатская (горные районы средней Азии).
5. Дальневосточная (Хабаровский край, Приморский край, Амурская область).
В нашей работе проведено сравнение изолятов возбудителя бурой ржавчины, собранных на территории Северного Кавказа и Ленинградской области, с помощью двух методов: фитопатологического тестирования и RAPD-ПЦР с целью установления степени различия изолятов P. 1гШ^по из двух отдаленных регионов, а также сопоставления данных, полученных с помощью двух различных методов изучения структуры популяции гриба.
Материалы и методы
В работе были использованы 36 монопустульных изолятов гриба из Ленинградской области и 40 изолятов из Северного Кавказа популяции 2007 года. Сбор, хранение, выделение монопустульных изолятов вели по методикам ВНИИФ [5]. Для накопления достаточного количества урединиоспор монопустульных изолятов проводили их размножение на восприимчивом сорте Michigan Аmber. Для идентификации каждого выделенного изолята гриба высевали линии Северо-Американского набора, состоящего из 16 близкоизогенных линий сорта Thatcher [6]. На 10
- 12 сутки после инокуляции оценивали в баллах типы реакции сортов-дифференциаторов и изогенных линий по шкале Мейнса и Джексона [7]. Фенотипическое разнообразие в популяциях определяли по формуле Шеннона [8]. Уровень различия между популяциями по генетической структуре и фенотипическому составу рассчитывали с помощью индекса Роджерса [8].
Экстракцию ДНК из урединиоспор осуществляли по методике Chen [9]. Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе Mastercycler 1 фирмы Eppendorf по протоколу разработчика праймера Kolmer et al. [10], с некоторыми модификациями: 3 мин при 94° С, далее 35 циклов: 94° С — 20 сек., 36° С — 20 сек., 72° С — 1 мин., после чего финальная экспозиция - 72° С на 15 мин. Амплифицированные фрагменты разделяли электрофорезом в 1,2% агарозном геле, в 0,5% ТВЕ буфере, гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в ультрафиолетовом свете. Для оценки размера полученных фрагментов использовали 50 bp маркер от Gene Ruler. Полученные электрофореграммы фотографировали и обрабатывали на компьютере. Критериями, на основании которых происходило разбиение выборки на RAPD-фенотипы, являлись количество
и величина мажорных фрагментов. В работе использовали 10 праймеров, из которых в результате предварительного скрининга на информативность и воспроизводимость были отобраны три: UBS 450, UBS 517 и ОРА 20.
Результаты и обсуждение
Результаты идентификации изолятов популяции возбудителя бурой ржавчины из Северного Кавказа и Ленинградской области на СевероАмериканском наборе из 16 близкоизогенных линий сорта Thatcher представлены в таблице 1.
Среди 40 монопустульных изолятов из Северного Кавказа выявлено 38 фенотипов с разным количеством генов вирулентности. Среди 36 монопустульных изолятов из Ленинградской области выявлено 36 изолятов с различным количеством генов вирулентности. Это указывает на высокий уровень разнообразия обеих популяций по фенотипическому составу.
Таблица 1 - Фенотипы вирулентности изолятов Puccinia МШто из Ленинградской области и Северного Кавказа в 2007 году
№ изолята Вирулентность (неэффективные гены Lr) Фенотип
1 2 3
Изоляты из Ленинградской области
1 2c,16,26,3ka, 11, B DHQL
2 1,3,16,11,30,B,10,14a MGHS
3 1,2c,16,26,3ka,11,30,B,10,14a NHRS
4 2a,2c,3,16,26,11,17,30,10 KHKG
5 3,16,30,B,10 CGCQ
6 3,16,B CGBL
7 1,2c,3,16,26,3ka PHLB
8 1,2c,3,16,26,3ka,11,30,B,10,14a PHRS
9 3,16,11 CGGB
10 1,2с,3,16,24,3ка,11,30,В PJRL
11 1,2а,2с,3,16,26,11,30,10,14а THHD
12 1,2а,2с,3,16,30,В
13 1,2а,2с,3,26,11,30,10 тона
14 1,2с,16,10 КОВО
15 1,2а,2с,3, 26,11,В тcаL
16 1,2а,2с,3,26,17,30,В TCFL
17 2с,3,16,3ка,17 БОШ
18 1,2с,3,3ка,10 pвLа
19 1,2а,16,3ка,17 ООкв
20 2а,2с,3,16,26,3ка,11,17,30,В,14а КНТК
21 1,2а,2с,3,16,3ка,11,17,30,10,14а,18 татк
22 2а,2с,3,26,3ка,11,17,10,14а,18 кшт
23 1,2с,3,16,26,3ка,11,17,10,18 РШН
24 1,2а,2с,3,3ка,11,17,10,18 твбн
25 2с,3,16,26,3ка,11,17,В,10,14а,18 КНБт
26 1,2а,2с,3,26,3ка, 11,17,14а,18 тСББ
27 3,16,26,3ка,11,17,В,10 СШО
28 1,2а,2с,3ка, 11,17,18 БВБС
29 1,3,3ка,11,17,10,18 ЫВБН
30 1,2а,2с,3,16,26,3ка,11,17,30,В,10,14а,18 тнтт
31 1,3,3ка,11,17,10 ЫВБО
32 2с,3,16,26,3ка,11,17,30,В,10,14а,18 БНтт
33 1,2а,2с,3,16,26,3ка,11,17,30,10,14а,18 тнтк
34 1,2а,2с,3,16,26,3ка,11,17,10,14а,18 тнбк
35 26,3ка,11,17,10,18 ВСБН
36 1,2а,3,26,3ка,11,17,10,14а RCSJ
Изоляты из Северного Кавказа
1 1,3,16,26,3ка,11,17,30,В,10,14а,18 мнтт
2 1,3,16,26,3ка,11,30,В,10,14а,18 MHRT
3 1,3,16,26,3ка,11,17,В,10,14а MHSS
4 2а,2с,3,16,26,3ка,11,30,В,10 KHRQ
5 2с,16,26,11,17,В,10,14а DHJS
6 2с,3,16,3ка,11,В,10 FGQQ
7 2а,2с,3,16,26,3ка,11,30,В,10 KHRQ
8 3,16,3ка,17,В cаNL
9 2а,2с,3,16,26,3ка,11,30,В,10 KHRQ
10 2а,2с,3,16,26,3ка,11,30,В,10,14а KHRS
11 2с,3,26,3ка,11,30,В,10 FCRQ
12 2а,2с,3,16,26,3ка,11,30,В,10,14а KHRS
13 2а,2с,16,26,3ка,11,30,В,10 JHRQ
14 2а,2с,3,3ка,11,17,30,В,10,14а KBTS
15 2с,3ка,11,30,В,10,14а DCRS
16 1,2а,2с,3,3ка, 11,30,В,10 TBRQ
17 1,2с,3,16,3ка,11,17,30,В,18 ратм
18 1,2с,3,10,14а,16,17,18 робт
19 1,2с,3,16,3ка,17,30,В,10 рарQ
20 1,3,16,26,3ка,17,30,В,10,14а,18 мнрт
21 1,2с,16,26,3ка,11,17,30,В,10,14а,18 кнтт
22 1,3,16,3ка,17,30,В,10,14а,18 март
23 1,2с,3,26,3ка,11,17,В PCSL
24 3,16,3ка,11,17,14а,18 cаsF
25 1,2а,3,3ка,11,17,30,В,14а,18 RBTP
26 1,3,16,26,11,17,В,14а MHJN
27 1,2а,2с,3,3ка,11,17,30,10,18 твтн
28 1,2с,3,26,3ка,11,17,30,10,14а,18 PCTK
29 1,3,16,26,3ка,17,30,В,18 мнрм
31 1,2а,2с,3,16,11,17,30,В,10,18 такR
32 1,3,26,3ка,11,17,30,10,18 мcтн
33 1,3,3ка,11,17,30,В,10,14а,18 мвтт
34 2с,3,16,3ка,11,17,30,10,14а,18 Fатк
35 1,2с,3,26,3ка,17,30,В,10,18 PCPR
36 1,3,16,30,В,10,14а маcs
37 1,2с,3,3ка,11,17,30,В,10,14а,18 рвтт
38 3,3ка,11,17,В,10,14а,18 cвsт
39 1,3,16,3ка,11,17,30,В,14а,18 матр
40 3,16,26,11,17,30,14а CHKD
Г енетическая структура изолятов из двух регионов приведена в таблице 2. Как видно из таблицы, среди изолятов из Северного Кавказа не обнаружены клоны, вирулентные к носителям генов Ьг9 и Ьг24.
Для изолятов обоих регионов отмечено высокое содержание клонов (40% и выше), вирулентных к Ьг: 1, 2с, 3, 16, 26, 3ка, 11, 17, 10. Среди изолятов из Северного Кавказа также много клонов, вирулентных к Ьг: 30,
В, 14а и 18. Выборка изолятов из Ленинградской области содержит большое количество клонов, вирулентных к Ьг2а и обнаружен 1 изолят, вирулентный к Ьг24. Индекс Роджерса между изолятами двух регионов составил 0,24, что свидетельствует о незначительных различиях по генетическому составу.
Таблица 2- Генетическая структура изолятов Puccinia МШіш из Северного Кавказа и Ленинградской области (2007 г.)
Ьг ген Частота вирулентных клонов ( %), собранных на территории
Северного Кавказа Ленинградской области
1 60,0 66.7
2а 27.5 47.2
2с 57.5 72.2
3 82.5 83.3
9 0,0 0,0
16 67.5 61.1
24 0,0 2.8
26 67.5 58.3
3ка 85,0 69.4
11 80,0 75,0
17 70,0 58.3
30 80,0 38.9
В 85,0 38.9
10 75,0 61.1
14а 57.5 38.9
18 47.5 36.1
В таблице 3 показано распределение изолятов по количеству генов вирулентности. Установлено, что для всех изолятов не обнаружены авирулентные фенотипы. У изолятов гриба из Северного Кавказа доля фенотипов с 1-9 генами вирулентности (из 16 отмеченных) составляет 42,0%, у изолятов из Ленинградской области - 63,9%.
Таблица 3 - Фенотипы изолятов Рысста МИста из Северного Кавказа и Ленинградской области с разным количеством генов вирулентности (2007)
Фенотип с «п» количеством генов вирулентности Количество изолятов, шт. Частота фенотипа, %
Ленинградская область Северный Кавказ Ленинградская область Северный Кавказ
0, 1, 2 0 0 0,0 0,0
3 2 0 5,6 0,0
4 1 0 2,8 0,0
5 4 1 11,0 2,5
6 4 0 11,0 0,0
7 4 5 11,0 12,5
8 4 5 11,0 12,5
9 4 5 11,0 12,5
10 5 12 12,8 30,0
11 3 6 8,3 7,5
12 3 3 8,3 2,5
13 1 1 2,8 2,5
14 1 0 2,8 0,0
Доля изолятов с 10 - 14 генами для изолятов Северного Кавказа и
Ленинградской области составляет 42,5% и 35,0% соответственно.
Приведенные данные указывают на то, что изоляты из Северного Кавказа более вирулентны, в то время как из Ленинградской области - более гетерогенны. Уровень фенотипического разнообразия (индекс Шеннона)
оказался равным единице для обоих регионов. Это указывает на высокий уровень разнообразия изолятов данных регионов по фенотипическому составу, несмотря на небольшую разницу в генетической структуре. Это еще раз подтверждает мнение ряда исследователей о том, что северокавказская популяция входит в состав обширной европейской, являясь субпопуляцией.
Также было проведено исследование изолятов гриба двух регионов по ДНК-полиморфизму. На предварительном этапе 10 RAPD-праймеров проверяли на информативность и воспроизводимость ДНК-фрагментов. В результате были отобраны три наиболее информативных: UBS 450, UBS 517 и ОРА 20. Из трех используемых праймеров, два разделяли выборки популяций на RAPD-фенотипы (рис. 1). Основными признаком, по которому происходило разбиение выборок на RAPD-фенотипы, являлся полиморфизм мажорных фрагментов. Критерием достоверности была воспроизводимость результатов при повторностях.
а)
б)
Рисунок 1 - ЯЛРЭ профили в 1.2% агарозном геле изолятов возбудителя бурой ржавчины: а) собранных в Северокавказском регионе (1-МНТТ, 2-МНЯТ, 3-МШ8, 4-КНЯд, 5-ЭШ8, 6-РОдд, 7-РСЯр, 8-БСЯ8, 9-РОРТ),
б) собранных в Ленинградской области (1-TGCL, 2-TBHG, 3-PBLG, 4-QGNB, 5-KHGT, 6-TBKH, 7-TCSF, 8-CHSQ, 9-SBSC, 10-THTT, 11-FHTT, 12-BCSH); m - маркер, К - контроль. Использовали праймер UBC 517.
Чтобы просуммировать данные по трем праймерам, каждому изоляту был присвоен трехзначный молекулярный фенотип (таблица 4). Первая цифра в трехзначном RAPD-фенотипе отражает праймер ОРА 20, вторая -UBS 450, и последняя -. UBS 517. Цифры от 1 до 4 означают различные варианты сочетания фрагментов описываемых изолятов.
Таблица 4 - RAPD-фенотипы изолятов Puccinia triticina из Северного Кавказа и Ленинградской области (2007 г.)
RAPD-фенотип Количество изолятов с данным фенотипом, шт.
Северный Кавказ Ленинградская область
111 5 1
115 1 4
215 1 0
211 3 0
213 1 0
411 1 1
315 0 2
415 0 2
Для сравнения изолятов по молекулярному полиморфизму, а также для сопоставления результатов анализа по вирулентности и ЯДРО-профилям, был определен индекс Роджерса между регионами по ЯДРБ-фенотипам и по ДНК-фрагментам. Индекс Роджерса по фрагментам составил 0,1, что указывает на незначительные отличия изолятов двух
регионов по наличию мажорных фрагментов. При сравнении по молекулярным фенотипам, индекс Роджерса составил 0,73, что означает высокую степень различия изолятов двух регионов по ЯДРБ-фенотипам.
Найденные значения индекса Роджерса по ЯДРБ-фенотипам и по ДНК-фрагментам аналогичны таковым по фенотипам вирулентности и генетическому составу. Из этого следует, что два метода исследования изолятов РиссШа МИста по вирулентности и ДНК-полиморфизму не противоречат, а дополняют друг друга и еще раз подтверждают тот факт, что различия изолятов из двух регионов основаны лишь на фенотипическом составе, т. е. незначительны. Значительных отличий в генетической структуре и составе мажорных фрагментов не найдено. Это позволяет сделать вывод о том, что изоляты из Северного Кавказа и Ленинградской области принадлежат к обширной европейской популяции, а значительная разница в фенотипическом составе позволяет обособить изоляты гриба Северного Кавказа в субпопуляцию. Для уточнения и дополнения полученных данных необходимо проследить динамику генетической структуры изолятов Р. МИста из двух регионов, а также увеличить выборку.
Благодарность.
Ведущему научному сотруднику Анпилоговой Л. К., научному сотруднику Вагановой О. Ф., лаборанту-исследователю Авдеевой Ю. В -за помощь в проведении исследований структуры северокавказской популяции гриба по вирулентности; Полушину П. А. - за помощь в проведении статистического анализа.
Список литературы
1. В. Б. Лебедев, А. Н. Васильев, Е. В. Якубова. Расчет возможных потерь яровой пшеницы от бурой ржавчины //Доклады ВАСХНИЛ. - №1. - 1994. - С. 14-16.
2. Л. А. Михайлова, С. В. Васильев. Ареалы популяций возбудителя листовой ржавчины пшеницы// Микология и фитопатология.- 19.
- вып 2.- 1985. - С. 158-163.
3. Е. И. Гультяева, О. А. Баранова, А. П. Дмитриев. Вирулентность и структура популяций Puccinia triticina в РФ в 2007 году // Вестник защиты растений. - вып. 4. - 2009. - С. 33-38.
4. Г. К. Сорокина, Л. А. Смирнова и др. Использование эффективных Lr-генов в селекции пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине (методические рекомендации)/ ВНИИФ, ВАСХНИЛ.-М., 1990. - 31 с.
5. Методические рекомендации по изучению расового состава возбудителей ржавчины хлебных злаков / ВНИИФ, ВАСХНИЛ.-М., 1977.-144 с.
6. Long, D. L., Kolmer, J. A. А North America System of nomenclature for Puccinia triticina //Phytopathology 79, 1989. - P. 525-529.
7. Mains E. B., Jackson H. J., Physiological specialization the leaf rust wheat (P. triticina Erikss.) // Phytopathology 16, 1926. - P.89-120.
8. Афанасенко О. С. Методы анализа популяций возбудителей пятнистостей листьев ячменя / О. С. Афанасенко //Сборник методических рекомендаций по защите растений. - СПб., 1998. -
C. 127-133.
9. ^en X.M., Line R.F., Leung H. Relationship between virulence
variation and DNA polymorphism in Puccinia striiformis
//Phytopathology 83, 1993. - P. 1489-1497.
10. Kolmer J. A., Liu J. Q., and Sies M. Virulence and molecularpolymorphism in Puccinia recondita f. sp. tritici in Canada //Phytopathology 85, 1995. - P. 276-285.
