CC BY
18МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 К.Р.Бондаренко1, А.Р.Мавзютов1, Л.А.Озолиня2
ВЕДУЩАЯ РОЛЬ ИНФЕКЦИИ В ФОРМИРОВАНИИ ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
башкирский государственный медицинский университет, Уфа; 2Российский государственный университет им. Н.И.Пирогова, Москва
Цель. Оценка роли эндотоксинемии при беременности, осложненной плацентарной недостаточностью. Материалы и методы. Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 130 беременных, у 70 из которых была диагностирована плацентарная недостаточность (основная группа). Обследуемые основной группы были разделены на 3 подгруппы: 36, 20 и 14 беременных с компенсированной, субкомпенсированной и деком-пенсированной плацентарной недостаточностью, соответственно. Контрольную группу составили 60 беременных с физиологическим течением гестации. Определяли уровень ЛПС, ЛПС-связывающего белка и IgG к еоге-региону, цитокинов (TNF-a, IL10, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IFNy), С-реактивного белка в плазме крови. Инфицированность Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Treponema vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum оценивали методом ПЦР. Результаты. В основной группе в 64,2% случаев установлено наличие инфекции генитального тракта, в 47,0% — мочевыделительной системы. Было показано повышение уровня ЛПС, титров IgG к core-региону ЛПС и ЛПС-связывающего белка в плазме крови беременных с плацентарной недостаточностью. Цитокиновый профиль при плацентарной дисфункции характеризовался достоверным повышением концентраций ТЫ-цитокинов IL10, IL8, TNF-a, Th2-цитокина IL10 и снижением уровня провоспалительных IL2, IFNy. Заключение. Результаты указывают на ведущую роль инфекции в формировании плацентарной дисфункции, а также доказывают участие ЛПС грамотрицательных бактерий в патогенезе данного осложнения.
Журн. микробиол., 2013, № 4, С. 3—9
Ключевые слова: плацентарная недостаточность, ЛПС, ЛПС-связывающий белок, антитела к core-региону ЛПС, цитокины
K.R.Bondarenko1, A.R.Mavzyutov1, L.A.Ozolinya2
LEADING ROLE OF INFECTION IN FORMATION OF PLACENTAL INSUFFICIENCY
1Bashkiria State Medical University, Ufa; 2Pirogov Russian State University, Moscow, Russia
Aim. Evaluate the role of endotoxinemia in pregnancy complicated with placental insufficiency. Materials and methods. Complex clinical-laboratory examination of 130 pregnant women in 70 of which placental insufficiency was diagnosed (main group) was carried out. The examinees of the main group were divided into 3 subgroups: 36, 20 and 14 pregnant women with compensated, subcompensated and decompensated placental insufficiency, respectively. The control group was composed of 60 pregnant women with physiological course of gestation. Levels of LPS, LPS-binding protein and IgG against core-region, cytokines (TNF-a, IL10, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IFNy), C-reactive protein were determined in blood plasma. Infection by Сhlamydia trachomatis, Мycoplasma genitalium, Treponema vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum were evaluated by PCR. Results. In the main group in 64.2% of cases the presence of genital tract infection was established, in 47.0% — urinary system.
An increase of LPS level, titers of IgG against LPS core-region and LPS-binding protein in blood plasma of pregnant women with placental insufficiency was shown. Cytokine profile in placental dysfunction was characterized by a significant increase of IL10, IL8, TNF-a Th1 cytokine and iLlO Th2 cytokine concentrations and a decrease ofpro-inflammatory IL2, IFNy levels. Conclusion. The results indicate a leading role of infection in formation of placental dysfunction as well as prove involvement of LPS Gram-negative bacteria in pathogenesis of this complication.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 4, P. 3-9
Key words: placental insufficiency, LPS, LPS-binding protein, antibodies against LPS core region, cytokines
ВВЕДЕНИЕ
Проблема невынашивания беременности в настоящее время приобрела особо актуальное значение для акушерства, что обусловлено переходом на новые критерии живорожденности, диктующие необходимость проведения реанимационных мероприятий среди глубоконедоношенных детей с массой тела 500 г и выше. Ведущую роль в невынашивании беременности играют инфекционно-воспалительные заболевания матери, приводящие, в частности, к формированию плацентарной недостаточности (ПН). Так, частота возникновения плацентарных нарушений у женщин, гестационный период которых протекает на фоне инфекционно-воспалительных заболеваний, достигает 50 — 60%. При этом спектр этиологически значимых вирусных и бактериальных патогенов, участвующих в развитии инфекционно-ассоциированной ПН, чрезвычайно разнообразен [7]. К одним из наиболее агрессивных инфекционных агентов относят доминирующие в урогенитальном тракте грамотрицательные микроорганизмы [4], имеющие в составе клеточной стенки уникальный по структуре биополимер — эндотоксин (липополисахарид, ЛПС) [3]. В период гестации инициируемый ЛПС комплекс иммунопатологических цитокинопосредованных реакций может приводить к массивному повреждению плацентарной ткани [10], нарушению гемостаза в сторону повышения коагуляционного потенциала крови с последующим тромбозом спиральных артерий, сосудов ворсин, хориальной пластины и сосудов пуповины, что клинически проявляется развитием плацентарных нарушений, гипоксией и гипотрофией плода [5 — 7].
В этой связи целью нашего исследования явилась оценка роли эндотоксине-мии при беременности, осложненной плацентарной недостаточностью.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 130 беременных во II — III триместрах гестационного периода, поступивших на стационарное лечение в отделение патологии беременных клинического родильного дома № 4 и наблюдавшихся в женской консультации ГКБ № 21 города Уфа в 2011 г. Основную группу наблюдения составили 70 беременных с ПН, контрольную группу — 60 пациенток с неосложненным течением беременности и отсутствием тяжелых экстрагенитальных заболеваний. Все обследуемые основной группы были разделены на 3 подгруппы в зависимости от формы ПН: 1 подгруппа включила в себя 36 женщин (51,43%) с компенсированной ПН, 2 подгруппа — 20 (28,57%) беременных с субкомпенсированной ПН, 3 подгруппа — 14 (20,0%) с
декомпенсированной степенью ПН, соответственно. Подбор пациенток в основную и контрольную группы позволял считать группы сопоставимыми.
Состояние плацентарного комплекса оценивали по результатам клинического обследования, ультразвуковой допплерографии, кардиотокографии, а также анамнестическим данным. Оценку функционального состояния системы мать-плацента-плод проводили по результатам допплерометрии с помощью ультразвуковых диагностических приборов фирмы «Accuvix XQ» фирмы Medison (Ксрея).
Лабораторные исследования включали определение иммуноферментным методом на микропланшетном фотометре (Bio Rad iMark, США) уровня цитоки-нов (TNF-a; IL1p; IL2; IL4; IL6; IL8; IL10; IFNy) и С-реактивного белка (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Оценку степени эндотоксинемии определяли по концентрации ЛПС с лизатом амебоцитов LIMULUS хромогенным методом по конечной точке состояния антиэндотоксинового иммунитета — уровню липополисахарид-связывающего белка и IgG к core-региону ЛПС в плазме крови («HyCult biotechnology», Голландия). Микробную обсемененность генитального тракта оценивали по результатам ПЦР (специфическая детекция безусловных патогенов
— C.trachomatis, M.genitalium, T.vaginalis, N.gonorrhоеае) и ПЦР в реальном времени (количественная оценка колонизации условно патогенными M.hominis, U.urealyticum, U.parvum) («ИнтерЛабСервис», Россия), а также проводили микроскопию влагалищного мазка (на микроскопе Люмам-Р8, ЛОМО, Санкт-Петербург).
Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ. Вычисляли среднюю арифметическую (М), стандартное отклонение средней арифметической (Sd). Производили расчет показателей структуры (в %). Для сравнения долевых показателей (%) использовали критерий
— угловое преобразование Фишера ^ф). При малочисленности групп и неясности закона распределения величин использовали непараметрические критерии Манна-Уитни (U).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изменение иммунологического гомеостаза в период гестации характеризуется развитием адаптационно-приспособительных реакций, направленных на формирование иммунологической толерантности к аллоантигенам плода. Последнее сопровождается физиологической (транзиторной) иммуносупрессией [2, 8], предрасполагающей к реактивации хронической бактериальной и/или вирусной инфекции. Так, в наших наблюдениях у 64,2% (45) пациенток основной группы было зарегистрировано наличие инфекционных заболеваний нижних отделов репродуктивного тракта, этиологически обусловленных преимущественно оппортунистической микрофлорой вагинального биоценоза, в том числе M. hominis и U.urealyticum (в 22,8 и 13,0% случаев, соответственно). Частота выявления безусловных патогенов Qtrachomatis при ПН составила 8,5%, M.genitalium
— 4,3%. При этом в группе контроля инфекционные заболевания генитального тракта, вызванные условно патогенной микрофлорой, были выявлены лишь в 9,0% случаев, а возбудители сексуально-трансмиссивных инфекций, таких как ^trachomatis, M.genitalium, T.vaginalis, N.gonorrhoeae, не были идентифицированы ни в одном случае. Инфекционная патология мочевыводящих путей ослож-
Таблица 1. Уровень эндотоксинемии, антиэндотоксинового иммунитета и цитокинового профиля при беременности, осложненной ПН (M±Sd)
Показатели ПН (п=70) Физиологическое течение беременности (п=60) Р Норма для здоровых взрослых доноров
LPS, Еи/мл 6,50+4,20 0,46+0,59 <0,001 0—1
LBP, нг/мл 47,2+12,9 43,1+16,0 >0,05 <10
ДО ЕпёоСАЪ,Ми/мл 141+128 64 +23 <0,001 Н.о.
SRP, мкг/л 0,9+0,5 1,1+0,8 <0,05 <8
^ф, пг/мл 90,1+18,2 1,8+0,9 <0,001 <11
^2, пг/мл 3,4+3,0 8,5+7,7 <0,001 0—10
^4, пг/мл 0,59+0,48 0,88+0,57 <0,01 <4
^6, пг/мл 3,2+2,4 2,8+2,6 >0,05 <10
^8, пг/мл 108,0+79,0 5,2+5,3 <0,001 <10
^10, пг/мл 33+28 18+33 <0,01 <31
TNF-a, пг/мл 16,2+22,0 5,0+8,4 <0,001 <6
№N7, пг/мл 14,5+8,5 30,6+6,1 <0,001 <10
Примечание. Н.о. — не определена.
Таблица 2. Уровень эндотоксинемии, антиэндотоксинового иммунитета и цитокинового профиля в зависимости от степени ПН
LPS, Еи/мл 8,1 [2,07—9,7] 2,9 [2—10] 8,4 [3-10]
LBP, нг/мл 50 [49—51] 49 [48—50] 46,5 [8—50]
ДО ЕпёоСАЪ, Ми/мл 106 [52—160] 130 [122—152] 38 [27—180]
няла течение гестационного периода женщин основной группы в 47,0% случаев, что в 3,5 раза превышало частоту ее выявления в контроле (13,3% случаев), (р<0,001).
На фоне гестации, осложненной ПН, уровень эндотоксинемии достигал 6,50+4,20 Еи/мл (в контроле — 0,46+0,59 Еи/мл; р<0,001). Вслед за повышением концентрации ЛПС в системном кровотоке наблюдали активацию антиэндо-токсиновых иммунных механизмов, что проявлялось двукратным увеличением ЕпёоСАЪ и нарастанием острофазного протеина ЬБР (табл. 1). Однако при этом С-реактивный белок определялся в кровотоке в следовых количествах в обеих сравниваемых группах. Аналогичная картина была характерна для противовоспалительного цитокина 1Ь4, уровень которого относительно снижался при развитии ПН, но поскольку изменения в концентрации 1Ь-4 колебались в пределах нормы, клинического значения они не имели. Интересен тот факт, что концентрация провоспалительных цитокинов 1Ь2 и №N7 в плазме значительно снижалась в группе беременных с плацентарными нарушениями. Одновременно
увеличивался регуляторный IL10. Уровень основных провоспалительных цито-кинов при ПН закономерно нарастал. Так, было отмечено многократное увеличение содержания IL1P c 1,82±0,96 пг/мл в группе с физиологическим течением гестационного периода до 90,1±18,2 пг/мл при ПН; IL8 — с 5,25,3 до 108,0±79,0 пг/мл, соответственно, а также двукратное повышение TNF-a с 5,0±8,4 до 16,2±22,0 пг/мл, (p<0,001). Исключение составил провоспалительный IL6, концентрация которого не отличалась в обеих группах сравнения и не превышала среднестатистические нормы для здоровых доноров.
Анализ иммунологических параметров антиэндотоксиновой защиты позволил выявить особенности изменений IgG EndoCAb и LBP в зависимости от степени выраженности плацентарных нарушений и уровня эндотоксинемии (табл. 2).
В 1 подгруппе было зарегистрировано повышение уровня ЛПС (медиана — 8,1 EU/мл) на фоне пиковых значений LBP и высокой концентрации IgG EndoCAb. Субкомпенсированое течение ПН проявлялось в резком падении уровня ЛПС с одновременным нарастанием содержания в кровотоке специфических IgG EndoCAb, концентрация которых достигала верхнего предела, составляя 130 MU/ мл (медиана). Переход в декомпенсированную форму ПН сопровождался повышением эндотоксиновой нагрузки до максимальных значений в 3 подгруппе и угнетением синтеза IgG EndoCAb со снижением его плазменной концентрации до минимума (медиана 38 MU/мл). Динамика изменений уровня LBP по мере усугубления нарушений морфо-функционального состояния плаценты характеризовалась постепенным, но незначительным падением его в системном кровотоке.
ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнительный анализ полученных данных выявил наличие инфекции гени-тального тракта в 64,2% случаев; мочевыделительной системы, соответственно, у 47,0% беременных с ПН, что в очередной раз указывало на ведущую роль инфекционного фактора в патогенезе плацентарных нарушений [7]. На сегодняшний день участие ЛПС грамотрицательных бактерий в генезе осложнений гестации подтверждается, как правило, в экспериментах на лабораторных животных. Результаты целого ряда научных исследований наглядно демонстрируют последствия воздействия ЛПС на течение гестационного процесса, приводящие к эмбриональной резорбции, задержке внутриутробного развития плода, антенатальной гибели плода, инициации преждевременной родовой деятельности, развитию гестоза (преэклампсии), плацентарной дисфункции [9 — 11]. Подобной клинической манифестации предшествует цепь последовательных биологических реакций, направленных на распознавание, связывание и элиминацию ЛПС, таких как взаимодействие с LBP, запуск цитокинового каскада, синтез специфических иммуноглобулинов к core-региону ЛПС и др. [3].
Результаты нашего исследования подтверждают роль эндотоксинемии в развитии плацентарной дисфункции, что доказывается статистически значимым увеличением содержания ЛПС, IgG EndoCAb и умеренным нарастанием LBP в кровотоке, а также изменениями цитокинового баланса при ПН. Установлено, что в основе формирования плацентарных нарушений лежит трофодеструктивное воздействие провоспалительных цитокинов в связи с активацией клеточно-опосредованных иммунных реакций [2]. С другой стороны, в литературе имеют-
ся данные о преобладании аутоиммунных реакций при ПН, обусловленных 1Ъ2 цитокин-опосредованной гиперактивацией периферических и децидуальных В-лимфоцитов [6]. Анализ данных показал наличие разнонаправленных изменений цитокинового статуса при осложненном течении беременности. Выявленное многократное нарастание концентрации Юр при ПН обусловлено тем, что именно указанный провоспалительный цитокин считается основным «посредником» повреждающего действия ЛПС на плаценту [10]. Было установлено повышение уровня TNF-a, способного вызывать нарушение микроциркуляции, приводящее к последующему прогрессивному снижению маточно-плацентарного кровотока и формированию ПН [5]. Наряду с увеличением провоспалительных Юр, TNF-a, 1Ь8 мы регистрировали снижение двух других ведущих ТЫ-цитокинов — 1Ь2 и №N7, что противоречило некоторым данным литературы [8], но согласовалось с другими [6]. Известно, что функционально 1Ь2 и №N7 способны переключать дифференцировку Т-клеток в сторону ТЫ, а №N7 напрямую связан с экспрессией антигенов НЬЛ I и II классов, что чрезвычайно важно для установления нормальных иммунных взаимоотношений в системе мать-плацента-плод [1]. Подавление их синтеза ведет к нарушению дифференцировки лимфоидных клеток с угнетением процессов презентации антигенов, снижению антигенной стимуляции иммунной системы матери, что обусловливает патологическое течение процесса гестации [1] и может привести к развитию ПН. Как известно, 1Ь2 индуцирует экспрессию генов ВСЬ-2, препятствуя развитию апоптоза клеток [2]. Очевидно, что снижение уровня 1Ь2 будет способствовать усилению апоптоза клеток трофобласта. Выявленное в нашем исследовании повышение уровня ре-гуляторного Ю0 в развитии ПН установлено ранее [6], что позволяет предположить его участие патогенезе акушерских осложнений. При этом абсолютно не претерпевала изменений концентрация 1Ь4 и 1Ь6 при развитии ПН.
По мере нарастания степени тяжести плацентарных нарушений изменялись иммунологические антиэндотоксиновые параметры. Так, состояние компенсированной ПН характеризовалось повышением эндотоксиновой нагрузки, что, по-видимому, являлось пусковым моментов в активации антиэндотоксинового иммунного ответа. Начальные изменения морфо-функционального состояния плацентарного комплекса стимулировали интенсивный синтез ЬВР (основного антиэндотоксинового острофазового протеина, способного распознавать и связывать ЛПС [3]), содержание которого достигало максимальных значений при компенсированной форме ПН. Уровень специфических ^О ЕпёоСЛЪ в системном кровотоке нарастал при этом более чем в два раза по сравнению с физиологическим течением беременности. Дальнейшее усугубление патологического процесса сопровождалось интенсификацией выработки ^О ЕпёоСЛЪ и одновременным снижением свободного ЛПС, что, вероятно, обусловлено усиленным связыванием его специфическими иммуноглобулинами. Уровень ЬВР при субкомпенсиро-ванном течении ПН оставался на прежнем уровне. Переход в состояние декомпенсации ПН характеризовался срывом механизмов иммунологической защиты, возможно, за счет истощения резервов антиэндотоксинового иммунитета, что проявлялось значительным повышением уровня эндотоксинемии с резким падением содержания ^О ЕпёоСЛЪ, а также тенденцией к снижению ЬВР. Последнее может трактоваться как неблагоприятный прогностический признак в течении ПН.
Таким образом, результаты наших исследований указывают на ведущую роль инфекции в формировании плацентарной дисфункции, а также на участие ЛПС грамотрицательных бактерий в патогенезе рассматриваемого акушерского осложнения. При этом важное клиническое значение при определении тяжести течения ПН имеет оценка уровня эндотоксинемии, анализ активности антиэндотоксино-вого иммунного ответа и ЛПС-опосредованных изменений цитокинового гомео-стаза.
Работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 — 2013 гг. в рамках реализации мероприятия № 1.2.1. Государственный контракт ГКП385 от 30.07.2009.
ЛИТЕРАТУРА
1. Астраух Н.В., Сотникова Н.Ю., Крошкина Н.В. Особенности процессов активации и продукции регуляторных цитокинов на локальном уровне при гестозе. Медицинская иммунология. 2001, 2: 249-250.
2. Левкович М. А. Современные представления о роли цитокинов в генезе физиологического и патологического течения беременности. Рос. вест. акушера-гинеколога. 2008, 8 (3): 37-40.
3. Лиходед В.Г., Бондаренко В.М. Антиэндотоксиновый иммунитет в регуляции численности эшерихиозной микрофлоры кишечника. М., Медицина, 2007.
4. Мавзютов А.Р., Бондаренко К.Р., Бондаренко В.М Бактериальный вагиноз: этиопато-генетические аспекты. Журн. микробиол. 2007, 6: 93-100.
5. Останин А.А., Кустов С.М., Тыринова Т.В. и др. Показатели иммунитета беременных в раннем прогнозе развития фетоплацентарной недостаточности. Акушерство и гинекология. 2010, 1: 33-38.
6. Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю. Иммунология беременности. Акушерство и гинекология. 2007, 5: 42-45.
7. Тютюнник В.Л. Тактика ведения беременных при плацентарной недостаточности инфекционного генеза. Русский медицинский журнал. 2006, 14 (18): 1307-1310.
8. Чистякова Г.Н., Газиева И.А., Ремизова И. И. и др. Оценка цитокинового профиля при физиологической и патологически протекающей беременности. Цитокины и воспаление. 2007, 6 (1): 3-8.
9. Bizargity P., Del Rio R., Phillippe M. et al. Resistance to lipopolysaccharide-induced preterm delivery mediated by regulatory T cell function in mice. Biol. Reprod. 2009, 80 (5): 874-881.
10. Girard S., Tremblay L., Lepage M. et al. IL-1 receptor antagonist protects against placental and neurodevelopmental defects induced by maternal inflammation. J. Immunol. 2010, 1; 184 (7): 3997-4005.
11. Pennington K.A., Schlitt J.M., Jackson D.L. et al. Preeclampsia: multiple approaches for a multifactorial disease. Dis. Model. Mech. 2012, 5: 9-18.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Бондаренко К.Р., 450000, Уфа, ул. Ленина, 3, р.т. (3472)22-41-73
