CC BY
18
_________________________________________________________________________________________
_____2. Распределение углерода по структурным фрагментам в полученных препаратах_________
Спектральные области, м. д.
5-48 48-108 108-145 145-165 165-187 187-220
Препарат СНп СаїкО Саг Саг-0,М ССОО-Н,Я СС=О
ГК-1 17 24 27 9 17 6
ГК-2 13 24 27 10 16 10
13
Рис. 1. С-ЯМР спектры препаратов ГК типичного чернозема, очищенных разными методами
В целом спектры весьма схожи. Для обоих характерно наличие интенсивных сигналов в области карбоксильных групп (187-165 м.д.), ароматического углерода (165-108 м.д.), причем хорошо различаются сигналы для замещенного и незамещенного бензольного кольца. В обоих спектрах достаточно слабо выражены сигналы гетероатомов (О, М - замещенного углерода, в частности, углеводных и аминных фрагментов в области 10848 м.д. В качестве отличия в спектрах, можно выделить относительно большую интенсивность сигнала в спектре ГК-1 в области незамещенного алифатического углерода (48-5 м.д.) и несколько меньшую интенсивность сигнала углерода кетонных и хинноных групп в области 187-220
м.д. в сравнении с ГК-2. Отмеченные особенности спектров хорошо видны при их интегрировании для количественной оценки содержания структурных фрагментов в углеродном скелете рассматриваемых ГК (таблица 2).
Установленные численные значения структурных показателей типичны для ГК, выделенных из черноземов (Перминова, 2000). Структура обоих препаратов чрезвычайно схожа. Содержания замещенных и незамещенных ароматических структур, карбоксильных групп и замещенных алкильных групп в обоих препаратах практически одинаковы. Разница в 4 % между содержанием карбонильных групп также вероятно незначима, так как для их спектральной области характерна наиболее высокая погрешность метода. Единственным отличием в структуре ГК, выделенных согласно методике принятой в России, от ГК, полученных по рекомендациям Щ88, было несколько больше (на 4 %) содержание алифатических групп в ГК-1. Поэтому, учитывая стохастический характер строения гуминовых веществ, можно заключить, что структуры обоих препаратов практически одинаковы, и методика очистки не влияет на структуру получаемых препаратов ГК. Таким образом, на примере типичного чернозема показано, что при использовании метода очистки ГК, рекомендованного ШББ, выход препаратов существенно (почти в 7 раз) выше, в сравнении с Российским методом, при этом структура получаемых препаратов практически одинакова. При препаративном выделении ГК с точки зрения производительности труда при очистке препаратов лучше придерживаться рекомендаций IHSS. Однако препараты, полученные по обеим методикам, вполне сопоставимы друг с другом при сравнительных исследованиях.
ВАРЬИРОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ ГУМИНОВОГО ПРЕПАРАТА
Р.Н. Гартвик, А.В. Гартвик
Санкт-Петербургский государственный университет
Положительное действие гуминовых веществ (ГВ) на различных этапах развития растений убедительно показано во множестве работ, но препараты, полученные на гуминовой основе, широкое сельскохозяйственное применение так и не получили. Причину этого исследователи видят в сложности строения молекул ГВ. Большое количество функциональных групп обусловливает чрезвычайную ширину и сложность спектра их одновременного действия, и как следствие - его непредсказуемость.
В последние годы химиками-гумусниками предпринимаются попытки сужения спектра действия гумино-
вой молекулы за счет отсечения ее части, но расчленение осуществляется лишь на уровне «каркас-периферия» посредством гидролиза (Перминова, Грещева, 2000; Перминова, Салеем, 2004).
В настоящей работе мы оценили применимость другого, пусть несколько менее научного, но значительно более практичного подхода к проблеме целенаправленного использования ГВ. Не пытаясь поначалу разобраться в механизмах их действия на растение, мы лишь проследили, как результат этого действия изменяется при варьировании параметров получения и применения пре-
парата. Путем поочередной корректной фиксации значений указанных параметров мы выявили условия, при которых препарат обладает наивысшей физиологической активностью по отношению к определенным растениям.
Основное влияние на физиологическую активность гуминового препарат оказывают следующие параметры его получения и применения. На стадии подготовки сырья это - сам вид сырья и средний размер получаемых частиц. На стадии выделения ГВ - длительность, давление и температура экстракции, а также сам реагент, его концентрация и способ перемешивания в нем сырья. На стадии подготовки препарата к применению - время, прошедшее с момента экстракции, температура хранения в течение этого времени, концентрация раствора. На стадии получения результата - выбранная сельскохозяйственная культура, состав и состояние почвы и далее (в зависимости от способа обработки растений): при предпосевной обработке семян - длительность и способ замачивания, освещенность, а также параметры просушки семян перед посадкой (длительность, температура, освещенность и т. д.), при внесении препарата в почву или опрыскивании по листу - температура и влажность среды (почвы и воздуха, соответственно), доза внесения и освещенность препарата.
Достоверно исследовать влияние каждого из перечисленных параметров на физиологическую активность конечного продукта - задача чрезвычайно трудоемкая. Но число варьируемых параметров может быть уменьшено, если принять во внимание следующее.
1. Рассматривать приемлемость предлагаемого подхода есть смысл тогда, когда в наличии имеется конкретная технологическая схема производства препарата и схема его применения, в которых, как правило, многие параметры фиксированы. С одной стороны, это ограничивает действенность («ширину охвата») подхода, но, с другой стороны, упрощает саму его реализацию. Итак, фиксированные при производстве и использовании препарата факторы к рассматриваемому подходу отношения не имеют.
2. Все факторы, действие которых приводит исключительно к ухудшению свойств препарата, также выпадают за рамки подхода. Влияние их должно быть изучено, но нет никакого смысла варьировать их значения в совокупности с другими величинами на начальном этапе исследования: достаточно поочередно изучить их влияние на свойства результата исследования, то есть, на свойства наиболее физиологически активного препарата.
3. Накопленные литературные данные позволяют существенно сокращать количество даже тех препаратов получения и применения препарата, которые действительно заслуживают внимания.
Сырье для конкретного производства - параметр фиксированный: как правило, технологическая схема ориентирована на единственный источник сырья. То есть, в число варьируемых параметров данный параметр не входит. Мы остановили свой выбор на верховом торфе.
Средний размер частиц - фиксирован и зависит от измельчающей техники. Мы также его не варьировали, ограничившись просеиванием торфа через сито с диаметром отверстий 1 мм.
Длительность экстракции ГВ из сырья. Этот параметр - варьировался. Границы подлежащего к исследованию диапазона выбирали с учетом значений, реально имеющих обычно место на производстве (от 2 до 24 часов).
Давление экстракции. В условиях конкретного производства это - фиксированный параметр. Мы, кончено же, выбрали значение 1 атм.
Температура экстракции - варьировалась. Диапазон варьирования был определен, по сути, еще при фиксации давления экстракции: от 20 до 90°С (ближе к 100 °С начинаются кавитационные процессы, а выше 100 °С -кипение либо рост давления).
В качестве реагента была выбрана щелочь №ОИ, производство которой в промышленных масштабах хорошо налажено. Кроме того, №ОИ часто используют в реальных технологических схемах при экстракции гуминовых веществ (Реутов, Репка, Кравченко, Куксин, 1980).
Концентрация реагента. В работе [4] Т.А. Плотникова (1971) исследовала ГВ, полученные ею из разных источников (и в том числе - из верхового торфа) посредством №ОИ различных концентраций. Она убедительно показала, что лучшей для извлечения ГВ является деци-нормальная концентрация №ОИ. То есть, данный параметр - фиксирован для избранной пары «сырье/реагент».
Способ перемешивания сырья в реагенте. Параметр фиксирован в рамках конкретного производства. Сразу после того, как навеску заливали раствором щелочи, производили разовое перемешивание до состояния полной его смоченности.
Время, прошедшее с момента экстракции. С ростом этого параметра ФА только понижается. Поэтому мы, во-первых, не стали его варьировать, а во-вторых - зафиксировали на практически достижимом минимуме: в опытах участвовали только свежеполученные вытяжки (< 4 сут.).
Температура хранения после экстракции. С увеличением этого параметра качества вытяжки только ухудшаются, поэтому мы его не варьировали. Вытяжки хранили (в течение 1-4 сут.) при комнатной температуре.
Концентрация растворения вытяжки в воде. Параметр варьировался, границы изменения подбирали с учетом литературных сведений: 10-6 - 10-1.
В качестве культуры (фактор фиксирован в условиях конкретного хозяйства, в рамки подхода не входит) был выбран овес.
Что касается почвы, то и это в условиях конкретного хозяйства - параметр фиксированный, в рамки подхода не входит. В связи с этим исследования, во-первых, испытания физиологической активности проводили лабораторным методом исследования, без использования почвы, а во-вторых, в качестве способа обработки было выбрано замачивание семян в растворах испытуемых препаратов.
Способ замачивания. В конкретном хозяйстве данный фактор фиксирован, то есть выбывает за рамки подхода. Мы остановили выбор на полном погружении семян в испытуемые растворы, поскольку такой способ обеспечивает наиболее «дружное» прорастание семян.
Длительность замачивания - варьировалась. Границы диапазона варьирования назначены в соответствии со способом замачивания: от 8 до 24 часов. Как правило, в случае широко рекламируемых гуминовых препаратов
рекомендуемое время замачивания составляет от 12 до 24 часов.
Освещенность - электромагнитное излучение ухудшает свойства вытяжек, поэтому параметр не варьировался. Мы зафиксировали его на минимуме: хранение вытяжек и замачивание семян осуществляли в темноте в непрозрачной посуде.
Время настаивания /, ч
Рис. 1. Общее содержание ГВ в зависимости от длительности экстракции I при разных температурах Т (от светлого к темному): 90°С, 60°С, 20°С. Значение п = 0.1 н.
140
120
100
80
Î 140 § 120 ^ 100 J 80
140
120
100
80
90 oC
Ш
і
I 60 oC
■:ь
20 oC
JÜ
fe
0
0
0
0
0
0
0
0
0
о
о
Ппреп-, % к Собщ
Рисунок 2. ФА свежеприготовленных образцов, полученных при n = 0.1 н, t = 5 ч, ізамач = 16 ч и различных Т.
Параметры просушки семян - как и фактор освещенности, только ухудшают действенность препарата со временем, то есть, выходят за рамки подхода. Мы зафиксировали их на минимальном значении - семена раскладывали в чашки Петри без просушки.
Таким образом, в настоящей работе варьировались всего четыре параметра: помимо двух факторов экстракции (температуры T и длительности t), это - концентрация разведения препарата ппреп и длительность замачивания t3aMa4 семян в растворе препарата.
В работе использован торф пушицево-сфагновый со степенью разложения 21 %. Содержание органического вещества - 97,7 ± 0,1 %, содержание углерода - 45 ± 1 % содержание золы - 2,32 ± 0,09 %. pHH2o ~ 3,65, pHKCi ~ 2,45. Валовое содержание азота - 0,424 ± 0,006 %, фосфора и калия, соответственно - 0,074 ± 0,002 % и 0,030 ± 0,001 % в пересчете на оксиды, содержание подвижных форм Mg, Ca и Fe, соответственно - 0,60 ± 0,02 %, 0,24 ± 0,01 % и 0,092 ± 0,002 % в пересчете на оксиды.
Для получения щелочных вытяжек брали одинаковые навески (2 г) торфа, предварительно пропущенного через сито с диаметром отверстий 1 мм. Навески заливали 200 мл раствора щелочи (NaOH, n = 0.1 н) и перемешивали с ним до состояния полной смоченности. Полученные суспензии ставили в термостат, нагретый до заданной температуры Т, все на одну полку. Через определенные интервалы времени из термостата изымали по 4 колбы (4 повторности). Всякий раз по изъятии колб суспензии фильтровали. Полученные прозрачные фильтраты подвергали дальнейшему изучению.
Исследование ФА. В полученных щелочных вытяжках (далее также - препаратах) методом Тюрина определялись содержание гуминовых веществ Собщ. Затем препараты разводили в дистиллированной воде до концентрации ппреп, измеряемой в % к Собщ. Физиологическую активность растворов препаратов оценивали по действию их на семена овса вида sativa сорта Borrus v. Aurea из коллекции ВИР (номер по каталогу - К-11840, место сбора - Германия). Семена замачивали в испытуемых растворах на время t3aMa4, а затем раскладывали на увлажненную фильтровальную бумагу в чашки Петри, по 25 штук в чашку в 4-хкратной повторности (100 семян на вариант). Проращивание семян проходило при постоянной температуре 24°С в биологическом термостате. Регулярно чашки разных вариантов и повторностей меняли местами с целью создания максимально равных условий. Проросшие семена овса подсчитывали через каждые 3 часа до тех пор, пока в каждом из вариантов опыта не прорастало более 50% семян. После этого во всех вариантах отбирали одинаковое количество семян (по 50 штук на вариант), проросших первыми. Измерялись длины их корней, результаты усредняли и относили к контролю.
В опытах по определению оптимального значения t3aMa4 семена замачивали в растворе препарата партиями по 100 штук (4 повторности по 25 штук) через определенные промежутки времени. Когда длительность нахождения первой партии в растворе составляла 24 часа, все партии одновременно раскладывали по чашкам Петри. После чего опыты продолжали в согласии с описанием, приведенным в предыдущем абзаце.
Полученные результаты. На начальном этапе работы из пяти независимых параметров, влияние которых
а
н
к
о
«
180-1
160-
140-
120-
100
80
48
12
t
16 , ч
90 °С 60 °С
20 24
а
н
К
о
и
130-
120-
110-
100
90 °С 70 °С 49 °С
5
10 15
20
Рисунок 3. Связь ФА исследуемых растворов (п = 0.1 н, t = 5 ч, ^реп < 4 сут., Ппреп = 0.001 (% по Собщ)) с длительностью замачивания в них семян овса.
Время настаивания t, ч
Рисунок 4. Зависимость длины корней от продолжительности экстракции при разных значениях Т (п = 0.1 н, tпреп < 4 сут., п
преп
= 0.001 (% по Собщ), Ъамач = 12 ч).
замич
на ФА растворов нам предстояло изучить, мы оставили в рассмотрении лишь два, Т и ппреп, временно зафиксировав t и tзамач на средних значениях. При этом для tзамaч мы выбрали именно среднее (арифметическое) значение в исследуемом диапазоне: 4амач = 16 ч. А параметру t значение присваивалось следующим образом.
На рисунке 1 приведены измеренные значения Собщ, соответствующие различным параметрам экстракции. Как видно, Собщ от 1°§(0, в первом приближении, зависит линейно. Поэтому весь диапазон исследования t мы разбили на равные участки именно в логарифмическом масштабе. Экспериментальные значения t составили: 2, 5, 11 и 24. Наиболее близко к среднему арифметическому в диапазоне t лежит значение 11 ч. Средним по Собщ, согласно рисунку 1, следует признать значение 2 ч. Поэтому изначально мы зафиксировали t на промежуточном значении: t = 5 ч. Такое число, с одной стороны, не было крайним в избранном диапазоне t, а с другой стороны, оставляло надежду, что найденная при t = 5 ч оптимальная концентрация ппреп останется оптимальной и при других t во всем диапазоне.
Результаты варьирования двух оставшихся незафиксированными параметров Т и ппреп сведены на рисунке 2. Для увеличения достоверности мы провели не по одному, а по три опыта при температурах экстракции 90°С и 60°С, и два опыта при температуре 20°С, то есть, на рисунке 2 сведены результаты восьми опытов. Как видно из рисунка, на полученных зависимостях следует выделять два пика физиологической активности препаратов: мощность (высота и ширина) первого из них, соответствующего ппреп = 0.001 (% к Собщ), увеличивается с ростом Т, а параметры второго, соответствующего ппреп = 0.03 (% к Собщ), от Т практически не зависят. Мы относим первый пик на счет действия ГВ, появляющихся в вытяжке в результате дополнительной гумификации торфа под действием №ОИ при высоких Т.
Исходя из того, что первый концентрационный пик ФА при Т = 90°С - доминирующий, мы далее зафиксировали параметр ппреп на значении 0.001 (% к Собщ), оставив второй концентрационный пик ФА без внимания. За-
фиксировав ппреп, мы приступили ппреп к варьированию трех оставшихся параметров: длительностей t и 4^,,, а также температуры Т.
На рисунке 3 отображено влияние на длину корней 1корн длительности замачивания 4амач семян в растворах препаратов. Из рисунка видно, что держать семена в растворах препаратов наиболее рационально в течении 12 часов. При больших tзaмaч ФА растворов медленно падает. Однако результаты, полученные при изначально фиксированной длительности замачивания 16 ч можно считать надежными: значения 1корн, соответствующие 12 ч и 16 ч, достаточно близки. Окончательно зафиксировав параметр 4амач на значении 12 ч, мы перешли к варьированию оставшихся параметров: Т и t.
На рисунке 4 представлены результаты получения растворов при некоторых значениях Т (90, 70 и 49 (°С)) и t (2, 5, 11 и 24 (ч)). С ростом Т действительно наблюдается увеличение ФА исследуемых объектов. То есть, наилучшей следует считать температуру, максимальную в диапазоне исследований: Т = 90°С, но, кроме того, из рисунка видно, что при высоких температурах (70 и 90 (°С)) зависимость ¡корн(?) - куполообразна. При Т = 90°С вершина купола соответствует t = 5 ч.
Таким образом, варьируя параметры получения и применения препарата, мы нашли условия приготовления наиболее физиологически активного раствора.
Рассмотренный подход позволяет получать физиологически активные препараты, которые могут служить основой для изготовления качественных биостимуляторов роста растений с узкой направленностью действия. В рамках данного подхода накопление базы оптимальных режимов позволило бы со временем сокращать трудозатраты по разработке технических условий получения очередного нового препарата, ориентированного на конкретную культуру. Даже в случае, когда разработка оптимального режима не является задачей, само планирование текущих исследований в обозначенном русле принесло бы существенную пользу делу целенаправленного применения ГВ в сельском хозяйстве.
