CC BY
105
БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 632.939
Н.Н. Терещенко, А.Б. Бубина, Л.Н. Сысоева,
Т.И. Бурмистрова, Н.М. Трунова
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ КОМПЛЕКСНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ОКСИГУМАТА ТОРФА И БАКТЕРИАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ PSEUDOMONAS SP. ДЛЯ СОЗДАНИЯ БИОПРЕПАРАТА СИСТЕМНОГО ДЕЙСТВИЯ
Аннотация. Исследование эффективности совместного применения оксигу-мата торфа и бактериальной культуры Pseudomonas sp. шт. В-6798 показало наличие выраженного синергического эффекта по отношению к показателям вегетативного роста пшеницы и огурца, а также фунгистатического воздействия на Bipolaris sorokiniana и снижение уровня зараженности семян пшеницы возбудителями корневых гнилей.
Ключевые слова: торфяные препараты, оксигумат, Pseudomonas sp. В-6798, Bipolaris sorokiniana, бактериальный препарат, ростостимулирующая и фунги-статическая активность.
Одна из наиболее актуальных задач современной аграрной науки - поиск эффективных и экологически безопасных средств защиты растений от болезней. По данным мировой статистики, ежегодно около 40% урожая теряется по причине высокой заболеваемости сельскохозяйственных растений, причем половина болезней вызвана возбудителями корневых гнилей [1]. Среди применяемых в настоящее время фунгицидов наибольший интерес представляют системные препараты на основе химических и биологических средств защиты растений, в частности продукты физико-химической переработки торфа и биопрепараты, созданные на основе моно- или поликультур бактерий рода Pseudomonas, обладающих ярко выраженным ростостимулирующим эффектом и супрессивным действием по отношению к широкому спектру патогенных грибов [2-4]. Согласно данным ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин), биопрепараты способствуют существенному повышению продуктивности практически всех культур: зерновых, технических и овощных. При этом прибавка урожая зерновых составляет в среднем 15-20%, а овощных - не менее 20-30%. Кроме того, применение микробных препаратов положительно влияет и на качество продукции, повышая содержание протеина у зерновых культур, крахмала у картофеля, сахаров и витаминов у овощных [5].
Бактерицидные свойства верхового торфа в настоящее время широко известны: установлено, что различные варианты гуматов, оксигуматов и гидро-гуматов, полученные путем физико-химической обработки торфа, обладают хорошо выраженными ростостимулирующими свойствами и устойчивым фунгистатическим эффектом [6-7]. Основными действующими веществами, определяющими уровень биологической активности таких препаратов, являются, по-видимому, сложные гуминовые комплексы. Установлено, что мо-
дифицированные гуминовые кислоты торфяных препаратов, как правило, значительно более активны, чем гуминовые кислоты исходного торфа [8-9] .
Для защиты растений, на наш взгляд, наиболее перспективным является совместное использование торфяных и бактериальных препаратов, обеспечивающее комплексное, системное воздействие на растение, оказывающее одновременно выраженный ростостимулирующий и фунгистатический эффект.
В соответствии с этим основной целью наших исследований стала проверка эффективности совместного применения оксигумата торфа и бактериальной культуры рода Pseudomonas по отношению к семенам пшеницы и рассаде огурцов в сравнении с раздельной обработкой. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
1) исследовать эффективность комплексного ростостимулирующего влияния оксигумата торфа и бактериальной культуры Pseudomonas sp. на семена зерновых и овощных культур;
2) исследовать эффективность комплексного воздействия оксигумата торфа и бактериальной культуры Pseudomonas sp. на гриб Bipolaris sorokiniana;
3) изучить эффективность воздействия совместной обработки семян пшеницы оксигуматом и бактериальной культурой Pseudomonas sp. на уровень зараженности семян пшеницы грибными инфекциями;
4) изучить влияние наиболее эффективных концентраций оксигумата на жизнеспособность бактерий Pseudomonas sp. для определения возможности создания комплексного биопрепарата системного действия.
Объекты и методы исследований
В экспериментах использовались оксигумат верхового пушицевого торфа и бактериальная культура Pseudomonas sp. штамм В-6798. Торфяной препарат (оксигумат) был разработан и предоставлен для эксперимента лабораторией физико-химических исследований торфа Сибирского НИИ сельского хозяйства и торфа СО Россельхозакадемии. Бактерии Pseudomonas sp. В-6798 были выделены в чистую культуру из активного ила очистных сооружений ТНХК и предоставлены лабораторией биокинетики и биотехнологии НИИ ББ ТГУ [10]. Фунгистатическую активность препаратов исследовали на чистой культуре гриба Bipolaris sorokiniana, выделенного с пораженных семян пшеницы. Ростостимулирующие свойства препаратов изучали на семенах пшеницы сорта Тулунская-12 и огурца сорта Кустовой.
Для определения ростостимулирующего эффекта от комплексного применения торфяного и бактериального препаратов был поставлен биотест на семенах пшеницы и вегетационный опыт с культурой огурца. В биотесте с пшеницей обработанные 0,05%-ным раствором перманганата калия и промытые дистиллированной водой семена пшеницы в течение 5 мин замачивали в следующих растворах:
- жидкая культура бактерий Pseudomonas sp. с титром 106 клеток/мл;
- 0,05%-ный раствор оксигумата по содержанию гуминовых кислот (ОГ(0,05%));
- 0,075%-ный раствор оксигумата (0Г(0,075%);
- 0,05%-ный раствор оксигумата + бактерии Pseudomonas sp. штамм В-67 98 (106 клеток/мл);
- 0,075%-ный раствор оксигумата + бактерии Pseudomonas sp. штамм В-67 98 (106 клеток/мл).
В качестве контроля использовали семена, замоченные в дистиллированной воде. По истечении времени воздействия исследуемых растворов семена пшеницы помещали во влажные камеры, по 25 шт. в каждую. Ростостимулирующее воздействие препаратов определялось по прибавке сухого веса корней и зеленой массы пшеницы на 7-е сут биотеста по отношению к аналогичным показателям в контроле.
В вегетационном опыте с культурой огурца семена перед высевом в грунт предварительно обрабатывали 0,05%-ным раствором перманганата калия, а затем в течение 5 мин замачивали в следующих растворах оксигумата и бактериальной суспензии с разным титром клеток:
- жидкая культура бактерий Pseudomonas sp. (108 клеток/мл);
- жидкая культура бактерий Pseudomonas sp. (106 клеток/мл);
- 0,075 %-ный раствор оксигумата;
- 0,075 %-ный раствор оксигумата + жидкая культура бактерий Pseudomonas sp. (106 клеток/мл).
В качестве контроля использовали замачивание семян в дистиллированной воде.
В соответствии со второй задачей исследования - определением эффективности комплексного фунгистатического воздействия оксигумата торфа и бактериальной культуры Pseudomonas sp. - был поставлен биотест с чистой культурой гриба Bipolaris sorokiniana. Тест проводили в чашках Петри на комплексной питательной среде КГА : МПА = 1 : 1 (картофельно-глюкозный агар : мясопептонный агар) [11]. В питательную среду после раздельной стерилизации добавляли расчетное количество оксигумата, обеспечивающего его 0,05-ную и 0,075%-ную по ГК концентрацию в среде. Застывшую питательную среду из серии рабочих разведений засевали бактериальной культурой Pseudomonas sp. В-6798. На 3-и сутки после появления колоний бактерий в центр чашки Петри помещали агаровый блок гриба Bipolaris sorokiniana. Для биотеста использовали чашки с плотностью бактериальной культуры, соответствующей 20-30 колониям на чашке. О степени фунгистатического влияния препаратов судили по подавлению скорости роста гриба по сравнению с контролем - показателями роста гриба на чистой питательной среде без добавления оксигумата и бактерий Pseudomonas sp.
В соответствии с третьей задачей для изучения влияния совместной обработки семян пшеницы оксигуматом и бактериальной культурой на уровень зараженности семян грибными инфекциями был поставлен биотест, согласно которому семена пшеницы на 5 мин замачивали последовательно в различных концентрациях оксигумата (ОГ (0,01%)), ОГ (0,1%)) и в суспензии бактерий Pseudomonas sp. с титром 106 клеток/мл. Далее семена проращивали во влажной камере при температуре +20.. ,+22°С в течение 7 сут. Семена с признаками грибного поражения микроскопировали для идентификации агента поражения.
Для оценки возможности создания комплексного промышленного биопрепарата, совмещающего полезные свойства оксигумата и бактерий Pseu-
domonas sp., был проведен микробиологический тест, в котором исследовали динамику численности бактерий, культивируемых в течение 2 сут на жидкой питательной среде МПБ (мясопептонный бульон) с добавлением оксигумата. В питательную среду предварительно добавляли расчетное количество торфяного препарата, обеспечивающее 0,075%-ную концентрацию гуминовых кислот. Численность бактерий анализировали методом предельных разведений и высевов на МПА через определенные промежутки времени культивирования.
Результаты исследований
Результаты биотеста на семенах пшеницы показали, что раздельная обработка семян бактериальным препаратом в большей степени повлияла на увеличение зеленой массы пшеницы и обеспечила 8%-ную прибавку по отношению к контролю. Воздействие торфяного препарата оказалось не столь однозначным. Так, например, применение оксигумата в 0,05%-ной концентрации более заметное влияние оказало на зеленую массу, тогда как обработка 0,075%-ным оксигуматом, напротив, в большей степени простимулировала рост корней проростков (табл. 1).
Наиболее эффективной оказалась совместная обработка семян пшеницы торфяным и бактериальным препаратами: максимальные прибавки зеленой массы и корней проростков были получены именно в вариантах с совместной обработкой: оксигумат (0,075%) + бактерии Pseudomonas sp.; оксигумат (0,05%) + бактерии Pseudomonas sp.
Совместная обработка семян пшеницы оксигуматом и бактериальной культурой обеспечила усиление взаимного влияния обоих препаратов, т. е. эффект синергизма, при котором влияние от комплексного применения препаратов оказалось значительно выше таковых каждого препарата в отдельности (табл. 1).
Результаты биотеста с пшеницей позволяют сделать вывод о целесообразности и перспективности совместного применения оксигумата из пушицевого торфа и препарата на основе культуры бактерий Pseudomonas sp. B-6798 для предпосевной обработки пшеницы.
Результаты вегетационного опыта с рассадой огурца также показали высокую эффективность совместной обработки семян торфяным и бактериальным препаратами. Фенологические наблюдения за состоянием рассады показали, что устойчивый и максимальный по опыту положительный эффект от совместной обработки препаратами стал проявляться начиная с 22-х сут опыта на стадии 3-го настоящего листа. На протяжении всего последующего периода наблюдений наиболее заметный эффект совместной обработки семян всегда проявлялся на самом молодом листе (табл. 2).
Приведенные в табл. 3 показатели роста растений огурца свидетельствуют о том, что раздельная обработка семян как оксигуматом, так и бактериальными суспензиями оказала положительное влияние не только на параметры вегетативного роста растений (вес зеленой массы и длина стеблей), но и на формирование завязей. Примечательно, что и оксигумат, и бактериальные суспензии в случае их раздельного применения сколько-либо заметного положительного воздействия на развитие корней (как на длину, так и на массу) не оказали.
Эффективность совместной и раздельной обработки семян пшеницы оксигуматом и бактериальной культурой Pseudomonas sp. В-6798 (106 клеток/мл)
Варианты опыта Зеленая масса Корни
Масса проростков, г Прибавка к контролю, % Масса проростков, г Прибавка к контролю, %
Контроль (Н20) 4,078 ± 0,38 0 4,707 ± 0,22 0
Pseudomonas sp. 4,418 ±0,23 8,33 4,934 ± 0,08 4,82
ОГ (0,075%) 4,251 ±0,43 4,24 5,206 ± 0,29 10,6
ОГ(0,075%) + Pseudomonas sp. 5,479 ± 0,26 34,35 6,112 ±0,34 31,97
ОГ (0,05%) 4,447 ±0,17 9,04 4,783 ± 0,24 1,61
ОГ (0,05%) + Pseudomonas sp. 5,609 ±0,39 37,54 5,561 ±0,35 18,14
Таблица 2
Результаты фенологических наблюдений в вегетационном опыте с огурцом
Срок, сут Вариант опыта Кол-во листьев Прибавка длины листа к контролю, % Прибавка ширины листа к контролю, %
2-й лист 3-й лист 4-й лист 5-й лист 6-й лист 1-й лист 2-й лист 3-й лист 4-й лист 5-й лист
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
22 Контроль (Н20) 4 100 100 100 100
Ps. sp. (106)* 4 101 117 95 152
Ps. sp. (108)** 4 92 98 90 139
ОГ (0,075%)*** 4 76 130 83 151
ОГ (0,075%) + Ps. sp. (106)* 4 120 156 125 182
27 Контроль (H20) 4 100 100 100 100 100 100
Ps. sp. (106)* 4 102 101 99 115
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Ps. sp. (108)** 4 120 52 125 120
ОГ (0,075%) 4 98 67 101 74
ОГ(0,075%) + Ps. sp. (106)* 5 115 125 170 123 179 156
33 Контроль (H20) 5 100 100 100 100 100 100 100 100
Ps. sp. (106)* 6 92 90 87 112 89 90 123 142
Ps. sp. (108)** 5 105 109 94 73 113 115 102 89
ОГ (0,075%) 6 101 92 83 94 114 98 86 122
ОГ(0,075%) + Ps. sp. (106)* 7 113 114 154 144 113 115 62 73
45 Контроль (H20) 6 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Ps. sp. (106)* 7 92 87 83 80 135 72 88 91 142 167
Ps. sp. (108)** 6 86 126 111 163 103 109 117 116 192 130
ОГ (0,075%) 7 64 97 105 126 96 80 109 121 142 130
ОГ(0,075%) + Ps. sp. (106)* 8 103 123 112 167 326 137 125 95 191 484
НСР05*** 1,7 12,4 10,7 8,5 21,1 19,8 22,6 16,9 17,0 20,4 19,5
* Ps. sp. (10 ) - суспензия бактериальной культуры Pseudomonas sp. с титром 10 клеток/мл; ** Ps. sp. (10 ) - суспензия бактериальной культуры Pseudomonas sp. с титром 108 клеток/мл; *** НСР05 - наименьшая существенная разница с контролем при р < 0,5.
Т а б л и ц а 3
Влияние совместной и раздельной обработки семян огурца оксигуматом и бактериальной культурой Pseudomonas sp. B-6798 на рост и развитие рассады огурца, %
Вариант опыта Прибавка кол-ва завязей Прибавка кол-ва листьев Прибавка длины стеблей Прибавка длины корней Прибавка зеленой массы Прибавка массы корней
Pseudomonas sp. (106 клеток/мл) 26,1±1,5 1,6±0,01 0 0 8±1,2 0
Pseudomonas sp. (108 клеток/мл) 0 0 0 0 0 0
ОГ (0,075%) 12,5±0,6 0 10,5±2,7 0 6,6±0,8 0
ОГ (0,075%) +Pseudomonas sp. (106 клеток/мл) 63,6±2,3 49,2±1,3 119,0±3,5 15,02±1,6 154,0±2,7 72,0±3,6
Как и в опытах с пшеницей, наиболее заметное положительное влияние на рассаду огурца оказала совместная обработка семян оксигуматом и бактериальной суспензией Pseudomonas sp. с титром 106 клеток/мл, обеспечив максимальные прибавки всех определяемых показателей. Зеленая масса и вес корней увеличились соответственно на 154 и 72%, количество завязей и листьев - на 63,6 и 49,2%, а длина стебля и корней - на 119 и 15% по отношению к контролю (см. табл. 3). Поскольку суммарный эффект совместной обработки семян огурца торфяным и бактериальным препаратами был выше суммы эффектов их раздельного применения, можно сделать вывод о проявлении синергического эффекта в результате комплексного применения обоих препаратов, что полностью соответствует данным, ранее полученным для пшеницы.
Согласно результатам теста с чистой культурой фитопатогенного гриба Bipolaris sorokiniana бактериальная культура Pseudomonas sp. обеспечила 67%-ное подавление радиального роста гриба по отношению к контролю (табл. 4). Оксигумат, примененный в концентрации 0,075% по ГК, обеспечил также довольно сильное (69%-ное) подавление скорости роста гриба, тогда как оксигумат в 0,05%-ной концентрации оказал значительно менее выраженное влияние на рост гриба Bipolaris sorokiniana. В данном варианте скорость роста гриба была всего на 11% ниже, чем в контроле. При этом максимальное подавление этого показателя было отмечено в варианте с совместным применением 0,075%-го торфяного препарата и культуры Pseudomonas sp., которое превысило контрольные показатели на 76%, что свидетельствует о целесообразности совместного применения оксигумата и бактериальной культуры Pseudomonas sp. B-6798 для подавления корневых гнилей, в частности гельминтоспориоза.
Т а б л и ц а 4
Эффективность комплексного влияния оксигумата и бактериальной культуры Pseudomonas sp. B-6798 (106 клеток/мл) на скорость роста гриба Bipolaris sorokiniana
Вариант Скорость роста гриба, мм/ч Подавление скорости роста гриба, %
Контроль 0,0329±0,015 -
Pseudomonas sp. 0,0107±0,017 67,5
ОГ (0,075%) 0,0100±0,023 69,5
ОГ (0,075%) + Pseudomonas sp. 0,0076±0,027 76,9
ОГ (0,05%) 0,0291±0,011 11,5
ОГ (0,05%) + Pseudomonas sp. 0,0159±0,018 51,7
Результаты биотеста по изучению влияния совместной обработки семян пшеницы торфяным и бактериальным препаратами на уровень зараженности семян грибными инфекциями представлены в табл. 5. Использованные в биотесте семена в целом отличались невысоким уровнем зараженности, который не превышал 8,5%. Возможно, по этой причине обработка семян чистым бактериальным препаратом не оказала выраженного положительного влияния на уровень зараженности по сравнению с контролем. Обработка семян в чистом
0,1%-ном оксигумате обеспечила 40%-ное снижение степени их инфицирования (см. табл. 5).
Т а б л и ц а 5
Эффективность совместного применения оксигумата и бактериальной культуры Pseudomonas sp. B-6798 (106 клеток/мл) для снижения зараженности семян пшеницы, %
Вариант Зараженность семян Фунгистатический эффект
Контроль 8,5 -
Pseudomonas sp. 6,5 +23,0
ОГ (0,1%) 5,1 +40,0
ОГ (0,1%) + Pseudomonas sp. 0 +100
ОГ (0,01%) 16,5 -94,1
ОГ (0,01%))+Pseudomonas sp. 8,3 +2,3
Наилучшие результаты были получены в варианте совместной обработки семян 0,1%-ным оксигуматом и бактериальным препаратом (фунгистатиче-ский эффект 100%).
Обращает на себя внимание тот факт, что в результате обработки семян пшеницы 0,01%-ным оксигуматом уровень зараженности увеличился почти в 2 раза. Возможно, это связано с тем, что при разбавлении оксигумата концентрация веществ, обладающих фунгицидными свойствами, опускается ниже пороговых значений чувствительности гриба, но при этом гриб может использовать некоторые составляющие оксигумата в качестве дополнительного источника питания или физиологически активных веществ, стимулирующих его рост. Обработка семян культурой бактерий Pseudomonas
sp. совместно с 0,01%-ным оксигуматом не оказала заметного влияния на зараженность семян.
Возможность создания комплексного промышленного биопрепарата, совмещающего полезные свойства оксигумата и Pseudomonas sp., оценивали по данным микробиологического теста, в рамках которого исследовали динамику численности бактерий, культивируемых в течение 24 ч на жидкой питательной среде М9 с добавлением оксигумата. Поскольку, согласно полученным ранее экспериментальным данным, наиболее эффективная концентрация оксигумата соответствовала 0,075% по ГК, в питательную среду добавляли расчетное количество торфяного препарата, обеспечивающее 0,075%-ную концентрацию гуминовых кислот. В качестве контроля использовали культивирование бактерий Pseudomonas sp. на среде М9 без оксигумата.
Результаты микробиологического теста, представленные на рис. 1, свидетельствуют о том, что оксигумат в исследованной концентрации обладает выраженным супрессивным воздействием по отношению к бактериям Pseudomonas sp.
Время, ч
Время, ч
Б
Рис. 1. Динамика численности бактерий Pseudomonas sp. B-6798 в жидкой питательной среде М9 с добавлением 0,075%-ного оксигумата (А) по сравнению с контролем (Б)
Рост бактерий на среде, содержащей оксигумат (0,075%), замедлен по сравнению с ростом в его отсутствие. Спустя сутки численность псевдомонад в опытной среде почти в 4 раза ниже, чем в контроле. Следовательно, для создания жидкого комплексного препарата простого добавления оксигумата в питательную среду недостаточно. Необходимо более подробно изучить и оценить эффективность различных режимов культивирования бактерий Pseudomonas sp. В-6798 в присутствии оксигумата. Несмотря на это, не вызывает сомнений эффективность совместной предпосевной обработки семян оксигу-матом и бактериальным препаратом. При опрыскивании вегетирующих растений смешивание препаратов необходимо проводить непосредственно перед обработкой.
Литература
1. Пересыпкин В.Ф. Болезни зерновых культур. М.: Колос, 1979. 278 с.
2. Ермолаева Н.И., Иванова Н.И. и др. Биопрепараты на основе ризосферных псевдомонад // Зашита растений. 1992. № 8. С. 24-25.
3. Ашмарина Л.Ф., Дашкевич В.С., Дашкевич Н.Ю. и др. Испытывается новый биопрепарат // Зашита растений. 2001. № 3. С. 41.
4. Palleroni N.I. Introduction to the Family Pseudomonaceae // The Prokaryotes. Berlin; Heidrlberg; New York: Springer - Verlag, 1981. Vol. 1. P. 655-665.
5. Боронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Соровский журнал. 1998. № 20. С. 25-31.
6. Кухаренко Т.А. Гуминовые кислоты различных твердых горючих ископаемых и возможность их использования в качестве сырья для производства гуминовых удобрений // Гуминовые удобрения: Теория и практика их применения. Харьков: Изд-во ХГУ, 1957. С. 19-29.
7. Наумова Г.В., Сайцина Т.И. Гуминовые препараты торфа и их эффективность при сельскохозяйственном использовании // Химия твердого топлива. 1991. № 1. С. 95-100.
8. Христева Л.А. О природе действия физиологически активных форм гуминовых кислот и других стимуляторов роста растений // Гуминовые удобрения: Теория и практика их применения. Киев: Урожай, 1968. Ч. 3. С. 15-28.
9. Христева Л.А., Реутов В.А. Гуминовые удобрения: Теория и практика их применения. Днепропетровск: Колос, 1973. Ч. 4. 308 с.
10. Патент РФ 21022474. Штамм метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. ВКПМ В-6798, способный использовать формальдегид в качестве единственного источника углерода и энергии в бедной минеральной среде / Е.В. Евдокимов, М.В. Миронов, А.В. Евдокимов, И.Э. Маниенко, Е.В. Корниевская. 8 с.
11. СэгиЙ. Методы почвенной микробиологии. М.: Колос, 1983. 295 с.
