CC BY
15
УДК 636.32/38.082
Ключевые слова: полиовуляция, яичники, козы, желтое тело, ооциты Key words: poliovulation, ovaries, goats, corpus luteum, oocytes
Аксенова П. В., Айбазов М. М., Коваленко Д. В.
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ОТВЕТА ЯИЧНИКОВ ПРИ ИНДУКЦИИ ПОЛИОВУЛЯЦИИ У КОЗ
VARIABILITY OF OVARIAN RESPONSE DURING INDUCTION OF POLIOVULATION IN GOATS
ГНУ «Ставропольский научно-исследовательский институт животноводства и кормопроизводства» Адрес: 355017, г. Ставрополь, переулок Зоотехнический, 15
Stavropol Research Institute of Livestock Breeding and Feed Production Address: 355017, Russia, Stavropol, Zootechnichesky lane, 15
Аксенова Полина Владимировна, к. б. н., ст. науч. сотрудник лаборатории воспроизводства
Aksenova Polina V., Ph.D, Senior Research Scientist of the Laboratory of Reproduction Айбазов Магомет Муссаевич, д. с.-х. н., проф., зав. лабораторией воспроизводства Aibazov Magomet М., Doctor of Agricultural Science, Professor, Chief of the Laboratory of Reproduction Коваленко Дмитрий Вадимович, к. б. н., науч. сотрудник лаборатории воспроизводства Kovalenko Dmitrii V, Ph.D, Research Scientist of the Laboratory of Reproduction
Аннотация. В статье приводятся результаты индукции полиовуляции у молочных коз применением оригинальной схемы гормональной обработки, включающей использование ушных имплантов «Крестар» с последующей стимуляцией фолликулогенеза «Фоллигоном» и «Овагеном». Делается вывод о приемлемости данной схемы для получения клеток на определенной стадии развития и подчеркивается высокая вариабельность ответа яичников на экзогенное гормональное вмешательство.
Summary. The article presents the results of induction of poliovulation in dairy goats using the original scheme of hormonal treatment including the use of ear implants "Krestar" followed by the stimulation of folliculogenesis by "Folligon" and "Ovagen". The conclusion is drawn that the scheme is acceptable for obtaining oocytes at certain stages of development. High variability of the ovarian response to exogenous hormonal intervention is marked.
Введение
Технология трансплантации эмбрионов складывается из ряда последовательных операций, каждая из которых является самостоятельной законченной методикой. Первая из них - это подбор доноров и индукция у них полиовуляции.
Теоретические принципы вызывания множественной овуляции были разработаны в 1934 г. М. М. Завадовским [7], который применял этот способ с целью повышения плодовитости овец. Исследования получили продолжение в работах А. И. Лопырина [4], Ю. Д. Клинского [3]. В первых исследованиях для стимулирования роста фолликулов и контроля за овуляцией у овец были использованы гонадотропные препараты, полученные из мочи беременных женщин (хорионический гонадотропин, пролан) [9]. Дальнейшие исследования в этой области были направлены на изучение эффективных воздействий различных гипофизарных
и плацентарных гормонов, определение дозы, способа и места введения препаратов и их сочетаний, обеспечивающих возможность контроля уровня полиовуляции, в том числе и для технологии трансплантации эмбрионов.
При индукции полиовуляции главной проблемой исследователи считают вариабельность ответа яичника на обработку [7]. Индивидуальная изменчивость в реакции яичников доноров отмечена даже при применении стандартных схем и доз гонадо-тропных препаратов. Более того, ни одна из проверенных и рекомендованных схем гормональной обработки не обеспечивает стабильного яичникового ответа.
Так, в экспериментах на овцах Т. Sugie, T. Soma, J. Tsunoda, K. Muzouchi [10] с целью вызывания суперовуляции обрабатывали животных 1200 ед. СЖК (сыворотка жеребых кобыл) и ХГ (хорион гонадотропин) в дозе 800 ед. У 93 % овец обнаружено от 1 до
36 овуляций (в среднем 7,9 на 1 донора). В среднем было извлечено 4,2 яйцеклетки на 1 донора, 101 из которых были оплодотворенными, однако 50 % клеток оказались непригодными для пересадки.
В сообщении В. И. Донской [1], в случной сезон при обработке овец СЖК в дозе 1 200 м.е. и ХГ в дозе 800 ед. в среднем на одного донора овулировало 2 фолликула. Увеличение дозы СЖК до 1400-1700 ед. незначительно повысило уровень овуляции. При такой же дозе СЖК и дополнительном введении 1 000 ед. ХГ число овуляций в среднем составило 3,2, а при введении ПГФ2-альфа (простагландин Ф2-альфа) и ХГ - 3,4. При такой дозе СЖК 2 000-2 200 ед. в яичниках обработанных овец овулировало в среднем 18,2 фолликула с колебаниями от 7 до 25. Дальнейшее повышение дозы хотя и давало в некоторых случаях увеличение индекса полиовуляции, но сопровождалось кистозны-ми изменениями в яичниках, увеличением числа атретических фолликулов и животных с «тихой охотой».
По данным Л. К. Эрнста и Н. И. Сергеева [5], введение овцам на 11 день эстрально-го цикла СЖК в дозе 1 000-1 200 ед. и через 48 часов 250 мкг ПГФ2-альфа обеспечивало в среднем 10 овуляций на каждого обработанного донора (при лимите от 3 до 36). Число нормальных эмбрионов составило 8,4 в среднем на одного положительного донора.
Таким образом, полученные данные по вызыванию полиовуляции свидетельствуют о том, что реакция яичников на введение экзогенных гормонов непредсказуема и отличается большой вариабельностью в отношении числа овуляций и выхода нормальных эмбрионов.
Следовательно, задача создания оптимальной схемы полиовуляции, дающей высокий процент ответов у доноров и достаточное количество полноценных эмбрионов, остается незавершенной и требует дальнейшего совершенствования.
Методика эксперимента
В эксперименте находилось 7 коз, у которых индуцировали полиовуляцию по оригинальной схеме: для синхронизации полового
цикла в качестве пролонгаторов лютеиновой фазы использовали ушные импланты «Кре-стар» (действующее вещество норгестамет); для ее прерывания и стимуляции овогенеза - «Фоллигон» в дозе 500 ед. и «Оваген» в общей дозе 6,4 мл. Синхронность овулиро-вания созревших фолликулов обеспечивали применением «Хорулона».
Наличие и продолжительность половой охоты определяли рефлексологическим методом (выборка с помощью козлов-пробников каждые 1-2 ч.). После выявления охоты коз двукратно осеменяли свежеполученной спермой высокого качества.
Уровень и качество полиовуляции определяли по результатам лапаротомии и осмотра яичников (наличие желтых тел) и вымывания клеток. К пригодным относили оплодотворенные ооциты, поделившиеся при дальнейшем инкубировании in vitro.
Для определения гормонального фона от коз через определенные промежутки времени получали кровь, в которой затем исследовали концентрацию половых гормонов методом иммунно-ферментного анализа.
Результаты эксперимента
По результатам выборки все обработанные животные пришли в охоту. Половая охота проходила при наличии и полноценном проявлении всех ее феноменов (положительная локомоторная реакция на самца, течка, рефлекс неподвижности). Продолжительность охоты значительно варьировала (табл. 1) и в среднем составила 28,7 ч.
При лапаротомии и вымывании эмбрионов выяснили, что нормальный ответ яичников на обработку был у 6 коз (№№ 7870, 7959, 7858, 7371, 7854, 7358), при этом количество овуляций варьировало от 11 до 24 у различных животных (табл. 2). В среднем реакция полиовуляции была 16 желтых тел. / гол., при выходе полноценных ооцитов 90,4 %.
В яичниках козы № 7976 отмечались изменения, характерные для гиперстимуляции. Они были увеличены (в среднем 5,7-5,2 см), неправильной формы. Имелось множество желтых тел и неовулировавших созревших фолликулов. Вымытые ооциты при микроскопии оказались неоплодотворенными,
Таблица 1.
Сроки наступления и продолжительность индуцированной охоты у коз
Параметры № животного М±т
7870 7959 7858 7371 7854 7358 7976
Время от извлечения импланта до начала охоты, ч. 15 12 18 14 14 14 12 14,14±0,77
Продолжительность охоты, ч. 31 28 28 16 36 28 22 28,71±3,06
Таблица 2.
Реакция полиовуляции у коз
Параметры № животного
7870 7959 7858 7371 7854 7358 7976 7870
Реакция полиовуляции, желтых тел (п.я./л.я.) 16/9 7/4 4/11 5/6 11/10 5/8 42/48 16/9
Вымыто клеток, всего 23 8 13 11 21 7 40 23
Из них пригодных для микроинъекций (клеток/%) 23/100 4/50 12/92,3 11/100 21/100 7/100 0/0 23/100
недозрелыми, окруженными многослойным кумулюсом, часть клеток имела неправильную форму и неравномерное распределение жира, во время инкубации клетки погибли.
Уровень и динамика половых гормонов у коз во время фармакологической обработки представлены на рисунках 1-3.
Динамика прогестерона и эстрадиола в сыворотке крови у 6 нормально отреагировавших коз в целом изменялась в соответствии с последовательностью введения экзогенных гормонов и соответствовала изменениям в организме, связанным с индукцией искусственного эстрального цикла (рис. 1, 2). Большая разница в уровне гормонов у коз в начале обработки объясняется различными стадиями полового цикла, так как животных обрабатывали фронтально, без учета фазы цикла. Как видно на графиках, к 5-му дню обработки циклы у животных синхронизировались. Концентрация тестостерона варьировала в пределах 0,140,22 ннмоль/л.
В то же время оказалось затруднительным выявить прямую корреляционную связь между интенсивностью ответа при индукции полиовуляции и уровнем половых гормонов.
Так, например, у козы № 7870, давшей максимальное количество овуляций - 25 ж. т. (желтых тел) - уровень прогестерона был даже несколько ниже, чем у других животных, уровни эстрадиола и тестостерона не различались, а при этом от козы № 7358 с высокой концентрацией прогестерона и эстрадиола в течение всего эксперимента получили только 13 овуляций.
Обсуждение результатов
Таким образом, на основании полученных результатов можно констатировать, что примененная нами схема дала хорошие результаты полиовуляции с высокой степенью синхронизации овуляций, о чем свидетельствует процент одновозрастных клеток.
Однако наше исследование подтверждает и выводы вышеприведенных ученых о том, что даже при одинаковой гормональной обработке животных одной породы, сходных по фенотипу, при одном уровне кормления и содержания и прочих равных условиях имеют место разные ответы на индукцию полиовуляции.
Считаем, что в обсуждении следует также отметить частный случай гиперстимуляции
яичников и получения ранних недоразвитых ооцитов у козы № 7976.
Причины дегенеративных изменений зародышей могут быть разными. По мнению J. Gordon [8], повышенный уровень прогестерона как следствие образования большого количества желтых тел в яичниках влияет на структуру эмбрионов и ведет к их дегенерации. Однако в наших исследованиях, несмотря на множество желтых тел, концентрация прогестерона у козы № 7976 находилась в пределах нормы и его динамика не отличалась от таковой у коз с нормальной полиовуляцией (рис. 1).
Другие исследователи считают, что основной причиной дегенерации эмбрионов является наличие в яичниках большого количества неовулировавших фолликулов, а следовательно и повышенного уровня эстрогенов [6]. В нашем случае, действительно, имело место большое количество овулировавших и неовулировавших фолликулов и уровень эстрадиола во время обработки превышал нормальный в 5-10 раз (рис. 2). То есть можно предположить, что повышенное содержание эстрадиола при преовуляторном развитии ооцитов вызывает задержку оогенеза.
Вероятно также, что анормальный рост концентрации эстрадиола и гиперстимуляция яичников произошли в связи с повышенным содержанием тестостерона (рис. 3), который, как известно, ароматизируется в эстрогены в гранулезных клетках яичников и в определенной степени участвует в регуляции гипофизом выработки половых гормонов, а также играет определенную роль в регрессии фолликулов. Концентрация тестостерона в начале обработки превышала средний уровень в 4 раза, еще существенно возросла при введении фолликулостимули-рующих препаратов и к концу половой охоты была выше среднего уровня уже в 12,5 раз. Возможно, что введение экзогенных гона-дотропинов на фоне высокого тестостерона спровоцировало его дальнейшее повышение и вызвало в результате гормональный сбой.
Интересно, что данная коза повторно пришла в охоту уже через 5 дней после операции, в дальнейшем наблюдали еще два
Рис. 1. Динамика концентрации прогестерона при индукции полиовуляции у коз.
Рис. 2. Динамика концентрации эстрадиола при индукции полиовуляции у коз.
Рис. 3. Динамика концентрации тестостерона при индукции полиовуляции у коз.
естественных половых цикла (в анэстраль-ный сезон), последний завершился оплодотворением и нормально развивающейся беременностью.
Список литературы
1. Донская, В. И. Сравнительная оценка различных способов стимуляции полиовуляции у овец./
B. И. Донская, М. М. Кунижев // Разведение овец и коз. Шерстоведение: Сб. науч. Тр. /ВНИИОК - Ставрополь, 1983. - С. 87-90.
2. Завадовский, М. М. Нельзя ли вызывая искусственную овуляцию у овец достигнуть многоплодия? / М. М. Завадовский, Л. П. Падучева // Труды по динамике развития. - 1935. - Т. IX. - С. 139-151.
3. Клинский, Ю. Д. Использование простаглан-динов для регуляции воспроизводительной функции овец / Д. Ю. Клинский, А. Н. Алексеенко // Животноводство. - 1980. - № 4. - С. 54-57.
4. Лопырин, А. И. Действие различных проге-стагенных препаратов при стимуляции синхронизации охоты у овец / А. И. Лопырин, В. И. Донская, Л. П. Рак, П. В. Сурков // Овцеводство,1969.- № 8. -
C. 27-30.
5. Эрнст, Л. К. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных / Л. К. Эрнст, Н. И. Сергеев. - М. : Агропромиздат, 1989. - С. 127-129.
6. Booth, W. D. Plasma oestrogen and progesterone in relation to super ovulation and egg recovery in the sheep / W. D. Booth, R. Newcomb, H. Strange e.a. // Vet. Rec. -1975. - V 97. - N 19. - P. 366-369.
7. Erickson, G. F. The physiology of folliculogenesis: the role of novel growth factors / G. F. Erickson, S. Shimasaki // Fertil Steril. - 2001. -76 (5). - 943-949.
8. Gordon J. The use of progesterone and serum gonadotropin (PMS) in the control of fertility in sheep. II. Studies in the extra seasonal production of lambs / J. Gordon // J. Agr. Sci. - 1985. - V. 50 - N 2.
9. Rowson, L. E. A. Methods of inducing multiple ovulation in sheep / L. E. A. Rowson // J. Endocrinol. -1957. - N 7. - P. 260-270.
10. Sugie, T. Superovulation of sheep using follicle stimulating hormone and prostaglandin F / T. Sugie, T. Soma, J. Tsunoda, K. Muzouchi // Theriogenology. -1980. - V 11. - N l. - P. 104.
как оформить подписку на журнал?
А. Через подписные каталоги
Каталог подписное агентство Индекс
Пресса России Агентство «Книга-Сервис» 29447
Газеты. Журналы Агентство «Роспечать» 33184
Почта России Межрегиональное агентство подписки 11354
ПРЕСС^йт СЗА «Прессинформ» 29447
= Б. Через редакцию журнала
| Банковские реквизиты для оплаты подписки по безналичному расчету
| для юридических лиц:
| НОУ ДО «Институт Ветеринарной Биологии»
| ИНН 7802196720 КПП 780201001
| Р/с 40702810400000000022 в ЗАО АКБ «Горбанк», г. Санкт-Петербург
| К/с 30101810200000000814 БИК 044030814
| В поле «Назначение платежа» указать:
| «Предоплата за подписку на журнал «Актуальные вопросы
= ветеринарной биологии» на 2012 г. согласно инф. письму б/н
| от 16.04.12 г. НДС не облагается. Адрес доставки: ...»
= Стоимость редакционной подписки на 2012 год (четыре номера): 1200 рублей.
учредитель и издатель: НОУ ДО «Институт Ветеринарной Биологии». Адрес: Санкт-Петербург, ул. Ораниенбаумская, 3Б. Т./ф. (812) 232-55-92, т. 927-55-92. E-mail: virclin@mail.ru; www.invetbio.spb.ru
