CC BY
187
УДК 615.32:582.912.44:612.015.14].001.8
Г. Я. Мечикова (к.фарм.н., доц.)1, Н. В. Матющенко (к.фарм.н., доц.)1,
О. В. Смирнова (дир.)2
Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в побегах Vaccinium myrtillus L.
1 Дальневосточный государственный медицинский университет Минздрава России, кафедра фармакогнозии и ботаники 680000, г. Хабаровск, ул. Муравьева-Амурского, 35; тел. (4212) 326426, e-mail: galina.m.ya@mail.ru 2ФГБУ «Информационно-методический центр по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения» Росздравнадзора (Хабаровский филиал) 680000, г. Хабаровск, ул. Краснореченская, 111 б
G. Ya. Mechikova1, N. V. Matyushchenko1, O. V. Smirnova2
Validation of method for quantity estimation of total flavonoids in shoots of Vaccinium myrtillus L.
1The Far Eastern State Medical University 35, Muravyeva-Amurskogo Str, 680000, Khabarovsk, Russia; ph. (4212) 326426,
e-mail: galina.m.ya@mail.ru 2Information and Methodological Center for Expertise, Stocktaking and Analysis of Circulation of Medical Products 111 B, Krasnorechenskaya Str., 680000, Khabarovsk, Russia
Проведена валидационная оценка методики спектрофотометрического определения содержания суммы флавоноидов в побегах черники обыкновенной. Методика охарактеризована по следующим показателям валидации: специфичность, правильность, линейность и прецизионность. Статистическая обработка полученных результатов показала, что все исследуемые ва-лидационные параметры находятся в пределах критериев приемлемости. Результаты валида-ции позволяют включить методику в проект фармакопейной статьи для ГФ 12 издания, регламентирующей качество побегов черники обыкновенной.
Ключевые слова: валидация; дифференциальная спектрофотометрия; линейность; правильность; прецизионность; побеги черники обыкновенной; специфичность; флавоноиды.
В действующем нормативном документе на побеги Уаеетшш шутИИт Ь. стандартизация сырья проводится по содержанию дубильных веществ. Между тем, исследование химического состава этого растения, а также литературные данные показали, что приоритетной группой биологически активного комплекса растения являются флавоноиды, в частности, производные кверцетина 1'2. Обзор данных литературы позволяет говорить о том, что эти вещества играют наиболее важную роль в реа-
The spectrophotometric method for estimation of total flavonoids in shoots of Vaccinium myrtillus L. has been validated. The method was validated to ensure specificity, accuracy, linearity and precision. Statistical calculations proved the validation parameters to be within the boundaries of acceptance criteria. The results of validation allow to include the method as a part of pharmacopoeia article on the quality of shoots of Vaccinium myrtillus L. in State Pharmacopoeia, issue 12.
Key words: accuracy; flavonoids; differential spectrophotometry; linearity; precision; shoots of Vaccinium myrtillus L.; specificity; validation.
Дата поступления 23.04.13
лизации многих терапевтических эффектов, в том числе и гипогликемического 3, поэтому оценку качества черники обыкновенной побегов, на наш взгляд, целесообразно проводить и по содержанию флавоноидов.
Ранее для определения этой группы веществ был разработан метод дифференциальной спектрофотометрии, основанный на реакции комплексообразования флавоноидов с хлоридом алюминия 4. В качестве стандартного вещества был предложен рутин.
Проведенные позднее исследования позволили идентифицировать и уточнить основ-
ные компоненты флавоноидной композиции побегов черники обыкновенной. Установлено, что одним из доминирующих веществ является гиперозид, что позволяет обоснованно предложить его в качестве стандартного образца для решения вопросов определения подлинности и доброкачественности сырья обсуждаемого вида. В связи с этим были внесены изменения в методику количественного определения суммы флавоноидов в побегах черники обыкновенной, касающиеся, прежде всего, используемого стандарта. Как следствие, внесенные корректировки привели к необходимости проведения повторной валидации.
Цель настоящей работы — валидационная оценка методики определения доброкачественности побегов черники обыкновенной по показателю «количественное определение суммы флавоноидов».
Материалы и методы
Объектом исследования явилась методика количественного определения содержания суммы флавоноидов в побегах черники обыкновенной.
В работе использовали стандартный образец гиперозида (Sigma-Aidrich). Измерение оптических плотностей проводили на спектрофотометрах UV-PharmaSpec 1700 (Shimadzu, Япония) и СФ-26 (Россия), Agilent UV VIS 8453 (США).
Валидацию методики проводили в соответствии с установленными требованиями на образцах сырья черники обыкновенной. В ходе работы рассматривались такие валидаци-онные характеристики, как специфичность, линейность, прецизионность (повторяемость, промежуточная прецизионность, воспроизводимость) и правильность в соответствии с правилами и рекомендациями 5-9. Статистический анализ экспериментальных данных выполняли с применением программы Microsoft Office Excel 2010.
Методика количественного определения. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1.0 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 250 мл и добавляли 150 мл 70% этилового спирта. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин с момента закипания экстрагента, периодически встряхивая колбу для смывания частиц сырья со стенок. Колбу с содержимым ох-
лаждали до комнатной температуры. После охлаждения извлечение фильтровали через бумажный фильтр марки «красная лента», смоченный этиловым 70%-м спиртом, в мерную колбу вместимостью 200 мл. Фильтр помещали в колбу для экстрагирования и экстракцию повторяли еще один раз в течение 30 мин, используя 50 мл этилового 70%-го спирта. Извлечение охлаждали до комнатной температуры и фильтровали в ту же мерную колбу. Объем извлечения доводили до метки этиловым 70%-м спиртом и перемешивали (раствор А).
5 мл раствора А (если пробным определением установлена низкая оптическая плотность, то для анализа берется 10 мл раствора А) помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 5 мл 4% раствора хлорида алюминия в 95%-м этиловом спирте, 0.1 мл уксусной кислоты, доводили объем раствора спиртом до метки и перемешивали. Через 40 мин измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 5 мл (или 10 мл) раствора А, 0.1 мл уксусной кислоты и доведенный 95%-м этиловым спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Параллельно измеряли оптическую плотность стандартного образца гиперозида.
Содержание флавоноидов в процентах (Х) в пересчете на гиперозид и абсолютно сухое сырье и вычисляли по формуле:
Ц •а0 -160000
Х _ _1 0_
Б0 • а1 • V -(100 - Ж)
где 01 — оптическая плотность испытуемого раствора;
-00 — оптическая плотность раствора стандартного образца гиперозида;
а1 — масса сырья, г;
а0 — масса стандартного образца гиперозида, г;
У1 — объем аликвоты извлечения, мл (5 или 10 мл);
Ш — потеря в массе при высушивании сырья, %.
Приготовление раствора гиперозида стандартного образца. Около 0.005 г (точная навеска ) стандартного образца гиперозида (Sigma-Aldгich или аналогичного качества другой фирмы), высушенного при температуре 135 оС в течение 3 ч, помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 20 мл 95%-го этилового спирта и нагревали на водяной бане до полного растворения. Затем раствор охлаж-
дали, доводили его объем до метки тем же спиртом и перемешивали (раствор А). 2 мл раствора Астандарт помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 5 мл 2% раствора хлорида алюминия в 95%-м этиловом спирте, 0.1 мл уксусной кислоты, доводили объем раствора тем же спиртом до метки, перемешивали и оставляли на 40 мин (раствор Бстан-дарт). Оптическую плотность раствора Бстандарт измеряли на спектрофотометре при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, содержащий 2 мл раствора А, 0.1 мл уксусной кислоты и 95% этиловый спирт до 25 мл.
Приготовление 4%-го раствора алюминия хлорида. 4 г 6-водного хлорида алюминия (ГОСТ 3759-75) растворяли в 40 мл 95%-го этилового спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводили объем раствора этим же растворителем до метки. Срок годности раствора 1 месяц при хранении в хорошо укупоренной таре.
Обсуждение результатов
Специфичность методики определяли путем сравнения спектров испытуемого раствора со спектром стандартного образца гиперозида после проведения реакций с хлоридом алюминия. Растворы готовили в соответствии с вышеприведенной методикой. Регистрацию спектров проводили в диапазоне длин волн от 300 до 500 нм. Критерием приемлемости специфичности является совпадение максимумов поглощения дифференциальных спектров ги-перозида и суммы флавоноидов, извлеченных из побегов черники обыкновенной (рис. 1).
о 1 1
0,8 ■
0,6
0,4
0,2
80 400 420 440 460 480 500
X, нм
Рис. 1. Дифференциальные спектры поглощения комплексов раствора гиперозида (1) и флавоноидов экстракта побегов черники обыкновенной (2) с раствором хлорида алюминия
Как видно на рис. 1, характер дифференциальных спектров совпадает, максимумы
находятся при аналитической длине волны 412 нм. Это говорит о том, что сопутствующие вещества, переходящие в раствор при экстрагировании сырья, не искажают результат, и тем самым подтверждается специфичность разработанной методики.
Установление линейной зависимости между содержанием суммы флавоноидов в измеряемой пробе и величиной сигнала (оптической плотности) было проведено на 3 образцах сырья черники. Пробы для измерения готовили путем разведения полученных извлечений из образцов (растворов А) с последующим проведением реакции комплексообразования. Учитывая вариабельность содержания биологически активных веществ в растительных объектах, объемы аликвот для приготовления серий разведений брали в соответствии с принятым (найденным) опорным значением количества флавоноидов в образцах сырья. Диапазон концентраций суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид в измеряемых пробах составлял в среднем от 4.98 до 36.1 мкг/мл, что позволяло получить аналитические сигналы в интервале значений, используемых в спектрофотометри-ческих измерениях. Исследования проводили на 5 уровнях концентраций суммы флавонои-дов в пересчете на гиперозид. Значение аналитического сигнала для каждой концентрации получали путем расчета среднего результата из трех измерений.
Для оценки степени линейности рассчитывали уравнение регрессии и дополнительные статистические показатели. В табл. 1 представлены результаты полученных исследований.
Как альтернатива математической оценке линейности, на рис. 2 приведено графическое изображение регрессионной прямой для образца 1.
Согласно полученным результатам установлено, что в выбранном диапазоне применения методики имеется прямо пропорциональное соотношение между концентрацией флаво-ноидов в измеряемой пробе и аналитическим сигналом. Все линейные зависимости характеризуются высокими коэффициентами корреляции (И>0.999), что считается приемлемым для установления строгой линейности. Полученные данные подтверждаются и графическим представлением регрессионных прямых.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о соблюдении линейности разработанной методики в диапазоне применяемых концентраций.
Прецизионность методики оценивалась исследованиями повторяемости, промежуточ-
2
0
Результаты оценки линейности разработанной методики*
Ряд разведений, мл раствора А/25 мл Расчетное содержание суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид, мкг/мл Аналитический сигнал (оптическая плотность) Статистические характеристики
3.0 8.33 0.253±0.004 Образец 1 у = 0.0279х + 0.0254 К = 0.9994 К = 0.9996 Образец 2 у = 0.0307х - 0.0049 ^ = 0.9992 К = 0.9995 Образец 3 у = 0.0283х + 0.0209 ^ = 0.999 К = 0.9995
5.0 13.14 0.394±0.002
7.0 18.48 0.544±0.002
9.0 24.64 0.720±0.001
11.0 30.54 0.864±0.005
13.0 36.10 1.036±0.008
*Для удобства представления информации в таблице приводятся первичные данные только одного образца побегов черники обыкновенной, а статистические характеристики — для трех исследованных образцов.
1,2 -,
1 -
0,8 -
§ 0,6
и
0,4 -
0,2
у = 0,0279х + 0,0254 К2 = 0,9994
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Расчетное содержание суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид, мкг/мл
Рис. 2. Графическое представление линейности: зависимость между аналитическим сигналом (оптическая плотность ) и расчетным содержанием суммы флавоноидов в пробе
ной прецизионности и воспроизводимости.
Для определения повторяемости (сходимости) разработанной методики использовали 6 испытуемых проб. Пробы готовили из одного образца сырья независимо друг от друга в соответствии с тестируемой методикой. Исследования проводили в течение короткого временного интервала, соблюдая абсолютно синхронные условия — анализ выполнял один и тот же аналитик на одном приборе.
Статистически полученные результаты исследований, представленные в табл. 2, не превышают критериев приемлемости для спек-трофотометрических методов, что свидетельствует о прецизионности разработанной методики в условиях повторяемости.
При проведении исследований промежуточной и межлабораторной прецизионности были учтены все возможные требуемые обстоятельства лабораторий, обусловливающие внут-
ри- и межлабораторную вариабельность: сотрудники, временной дрейф, разные спектрофотометры и реактивы и т. д. Для оценки этих параметров валидации использовали данные сходимости, представленные в табл. 2, и набор данных, полученных при выполнении методики вторым аналитиком в другой день и на другом приборе и данные, полученные в другой лаборатории (табл. 3).
Оценка проводилась путем расчета стандартных статистических характеристик при п >3, Р=95%. В качестве описательных статистических оценок были использованы F-критерий и ^ критерий достоверности гипотезы. Как видно из табл. 3, расчетное значение отношения дисперсий ниже табличного значения F-критерия на 95% уровне значимости и // = п1 — 1; (2 = п2 — 1. Поэтому можно принять гипотезу о равенстве дисперсий. Полученная расчетная величина t меньше критического результата, что говорит с
Результаты оценки повторяемости разработанной методики
Номер опыта 1 2 3 4 5 6
Аналитический сигнал 0.394 0.404 0.413 0.402 0.420 0.403
Содержание флавоноидов в пересчете на гиперозид, % 1.31 1.35 1.39 1.35 1.38 1.36
Статистические характеристики
п X, % Б2 ЯБО* % Б х Р, % А X е %
6 1.36 0.0008 2.06 0.0114 95 2.57 0.0294 2.16
* Относительное стандартное отклонение.
Таблица 3
Результаты оценки промежуточной прецизионности и воспроизводимости разработанной методики
Номер пробы Лаборатория 1 Лаборатория 2
Аналитик 1 Аналитик 2
Содержание суммы флавоноидов, %
1 1.31 1.39 1.33
2 1.35 1.36 1.38
3 1.39 1.32 1.31
4 1.35 1.30 1.34
5 1.38 1.39 1.38
6 1.36 1.35 1.38
Статистические характеристики
внутрилабораторная прецизионность межлабораторная прецизионность
х, % 1.36 1.35 1.35
Б 0.0280 0.0366 0.0308
Б2 0.0008 0.0013 0.0009
ЯБО, % 2.06 2.71 2.28
Доверительный интервал (Р=0.95%), % 1.33-1.40 1.31-1.39 1.32-1.38
Р (5%, 5, 5) = 5.05 1.70 -
1 (5%, 10) = 2.23 0.26 -
Р (5%, 5, 5) = 5.05 1.20 ; 1.41**
1 (5%, 10) = 2.23 0.20*; 0.08**
"Статистические характеристики, полученные для первого аналитика. "*Статистические характеристики, полученные для второго аналитика.
95% вероятностью и / = п1 + п2 — 2 о статистической незначимости различия средних результатов анализа.
Таким образом, полученные результаты исследований для 1 и 2 аналитика и между лабораториями свидетельствует об отсутствии систематических ошибок. Разработанная методика прецизионна в условиях промежуточной прецизионности и воспроизводимости.
Правильность методики устанавливали на трех образцах побегов черники с добавлением известного количества стандартного образца гиперозида трех уровней концентрации. Дизайн эксперимента был поставлен таким образом, что определения включали все стадии методики.
Критерием приемлемости правильности является средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скорректированный на 100%, и его средняя величина должна находиться в пределах 100±5 %. В разработанной методике процент восстановления находился в пределах от 99.02 до 101.88 %, его средняя величина составила 100.22% (табл. 4).
Таким образом, в ходе проведенного исследования подтверждены валидационные характеристики разработанной методики: специфичность, линейность, правильность и прецизионность, что позволяет сделать вывод о ее валидности и включить в фармакопейную статью на побеги черники обыкновенной.
Результаты оценки правильности разработанной методики (результаты опытов с добавками)
Содержание флавоноидов, мг/25 мл Добавлено гиперозида, мг Расчетное содержание флавоноидов, мг/25 мл Полученное содержание флавоноидов*, мг/25 мл Процент восстановления, %
Образец 1 0.331 0.200 0.531 0.541 101.88
0.331 0.300 0.631 0.633 100.38
0.331 0.400 0.731 0.724 99.06
Образец 2 0.225 0.200 0.425 0.422 99.18
0.225 0.300 0.525 0.530 100.86
0.225 0.400 0.625 0.619 99.02
Образец 3 0.434 0.200 0.634 0.641 101.25
0.434 0.300 0.734 0.728 99.22
0.434 0.400 0.834 0.843 101.17
* Среднее значение по результатам трех измерений.
Литература
1. Мечикова Г. Я., Степанова Т. А. // Материалы VIII Международного симпозиума «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты 2-5 октября 2012 г.- М.: ИФР РАН; РУДН, 2012.- С.389.
2. Zushang Su. // Pharmaceutical Crops.- 2012.-№3.- P.7.
3. Matsuda Н. Morikawa T., Yoshikawa M. // Pure Appl. Chem.- 2002.- V.74, №7.- P.1301.
4. Цимбалист Н. А., Мечикова Г. Я., Степанова Т. А. Определение флавоноидов в побегах обыкновенной черники // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сб. науч. тр.- Пятигорск, 2011.- Вып.66.-С.210.
5. Береговых В. В., Пятигорская Н. В., Беляев В. В., Аладышева Ж. И., Мешковский А. П. Валида-ция в производстве лекарственных средств / Под ред. чл.-корр. РАМН, проф. В. В. Береговых.- М.: Издательский дом «Русский врач», 2010.- 286 с.
6. Валидация аналитических методик для производителей лекарств: Типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств, подготовленное Федеральным союзом фармпроизводителей Германии (ВАН) / Перев. Ж. И. Аладышева, О. Р. Спицкий, науч. ред. В. В. Береговых.- М.: Литтера, 2008 г.- 132 с.
7. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Ч.1. Основные положения и определения.- Введ. 23.04.02.- М.: ИПК Изд-во стандартов, 2002.- 32 с.
8. ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Ч 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений.-Введ. 23.04.02.- М.: ИПК Изд-во стандартов, 2002.- 32 с.
9.
References
1. Mechikova G. Ja., Stepanova T. A. // Materialy VIII Mezhdunarodnogo simpoziuma «Fenol'nye soedinenija: fundamental'nye i prikladnye aspekty 2-5 oktjabrja 2012 g.- M.: IFR RAN; RUDN, 2012.- S.389.
2. Zushang Su. // Pharmaceutical Crops.- 2012.-№3.- P.7.
3. Matsuda H. Morikawa T., Yoshikawa M. // Pure Appl. Chem.- 2002.- V.74, №7.- P.1301.
4. Cimbalist N. A., Mechikova G. Ja., Stepanova T. A. Opredelenie flavonoidov v pobegah obyknovennoj cherniki // Razrabotka, issledovanie i marketing novoj farmacevticheskoj produkcii: sb. nauch. tr.- Pjatigorsk.- 2011.-Vyp.66.- S.210.
5. Beregovyh V. V., Pjatigorskaja N. V., Beljaev V. V., Aladysheva Zh. I., Meshkovskij A. P. Validacija v proizvodstve lekarstvennyh sredstv / Pod red. chl.-korr. RAMN, prof. V. V. Beregovyh.- M.: Izdatel'skij dom «Russkij vrach», 2010 g.- 286 s.
6. Validacija analiticheskih metodik dlja proizvoditelej lekarstv: Tipovoe rukovodstvo predprijatija po proizvodstvu lekarstvennyh sredstv, podgotovlennoe Federal'nym sojuzom farmproizvoditelej Germanii (VAN) / Perev. Zh. I. Aladysheva, O. R. Spickij, nauch. red. V. V. Beregovyh.- M.: Littera, 2008 g.- 132 s.
7. GOST R ISO 5725-1-2002 Tochnost' (pravil'nost' i precizionnost') metodov i rezul'tatov izmerenij. Ch.1. Osnovnye polozhenija i opredelenija.-Vved. 23.04.02.- M.: IPK Izd-vo standartov, 2002.- 32 s.
8. GOST R ISO 5725-4-2002 Tochnost' (pravil'nost' i precizionnost') metodov i rezul'tatov izmerenij. Ch 4. Osnovnye metody opredelenija pravil'nosti standartnogo metoda izmerenij.- Vved. 23.04.02.-M.: IPK Izd-vo standartov, 2002.- 32 s.
9. GOST 42-510-98. Pravila organizacii proizvodstva i kontrolja kachestva lekarstvennyh sredstv (GMP).
ГОСТ 42-510-98. Правила организации производства и контроля качества лекарственных средств ^МР).
