CC BY
289
УДК 615.322
Е.В. Петров
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ПОБЕГАХ ЧЕРНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ
Разработана методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в побегах черники обыкновенной, которая, может, быть использована для. стандартизации данного вида лекарственного растительного сырья.
Ключевые слова: побеги черники обыкновенной, флавоноиды, стандартизация лекарственного растительного сырья, дифференциальная спектрофотометрия
DEVELOPMENT OF THE METHOD OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE TOTAL CONTENT OF FLAVONOIDS IN VACCINIUM MYRTILLUS SPROUTS
E.V. Petrov Institute of General and Experimental Biology SB RAS, Ulan-Ude
The method, of quantitative determination of the total content of flavonoids in Vaccinium myrtillus sprouts has been developed. It can be used, for standardization of the given type of medicinal plant raw materials.
Key words: Vaccinium myrtillus sprouts, flavonoids, standardization of medicinal plant raw materials, differential spectrometry
Ранее нами было показано, что флавоноидным соединениям принадлежит ведущая роль в гипо-гликемическом эффекте препаратов из побегов черники обыкновенной [2]. Учитывая, что побеги черники применяются в основном как сырье для противодиабетических средств [3], актуальной задачей является разработка методов стандартизации данного сырья по количественному содержанию флавоноидов.
Для разработки методики количественного определения флавоноидов в побегах черники был использован метод дифференциальной спектро-фотометрии, отличающийся высокой точностью и экспрессностью, и вследствие этого широко применяемый в последнее время для количественного анализа флавоноидов в растительном сырье [1, 4].
Метод базируется на реакции комплексообра-зования флавоноидов с алюминия хлоридом. Происходящий при этом батохромный сдвиг первой полосы поглощения флавоноидов с 330 — 350 нм до 390 — 415 нм позволяет применить в качестве контроля испытуемый раствор без реактива, и тем самым исключить влияние сопутствующих окрашенных веществ. В качестве стандартного вещества использовали рутин (ФС 42-2508-87), максимум дифференциального спектра поглощения которого (415 нм) совпадает с максимумом
дифференциального спектра извлечения из побегов черники.
Для определения оптимального времени ком-плексообразования суммы флавоноидов побегов черники с алюминия хлоридом определяли оптическую плотность полученного комплекса на фоне чистого извлечения через равные промежутки времени. Полученные результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что через 40 мин величина оптической плотности исследуемого комплекса достигает максимального значения. Вследствие этого измерение оптической плотности необходимо проводить через 40 мин после добавления алюминия хлорида к извлечению.
Для выяснения подчиняемости исследуемого комплекса закону Ламберта-Бугера-Бера из него были приготовлены разведения, и установлено, что в диапазоне оптических плотностей 0,2 — 0,7 у.е. наблюдается линейная зависимость между концентрацией растворов и величиной поглощения.
В процессе разработки методики количественного определения изучены и подобраны оптимальные условия экстракции исследуемого сырья, результаты представлены в таблицах 2 и 3.
Как следует из таблиц 2 и 3, оптимальными параметрами получения извлечений из побегов черники обыкновенной являются: экстрагент —
Таблица 1
Оптическая плотность суммы флавоноидов побегов черники на фоне чистого извлечения
через равные промежутки времени
Зависимость величины оптической плотности от времени реакции комплексообразования суммы флавоноидов черники с алюминия хлоридом, время, мин 10 20 30 40 50 60
Оптическая плотность, у.е. 0,18 0,22 0,30 0,32 0,32 0,30
Таблица 2
Влияние условий экстракции на выход флавоноидов в побегах черники обыкновенной
Условия экстракции Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %
Экстрагент Вода 2,23
Этиловый спирт 30 % 2,14
40 % 2,24
50 % 2,38
60 % 2,90
70 % 2,96
80 % 2,85
96 % 2,74
9 i <¡y i 20 1,24
40 1,90
60 2,26
90 2,85
Степень измельчения, мм 0,5 2,99
1,0 2,99
2,0 2,87
3,0 2,45
5,0 2,07
I экстракция II экстракция
Время, мин 15 1,85 0,10
30 2,42 0,14
45 2,54 0,18
60 2,98 0,21
75 2,99 0,21
90 2,98 0,21
Таблица 3
Выход суммы флавоноидов из побегов черники обыкновенной в зависимости от соотношения сырье: экстрагент и кратности экстракции
Соотношение «сырье : экстрагент» Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %
Контакт фаз Сумма
I II III
1 : 30 2,67 0,33 0,11 3,11
1 : 50 2,89 0,27 0,03 3,19
1 : 100 2,99 0,21 - 3,20
70% этиловый спирт, степень измельчения сырья — 0,5 — 1,0 мм, температура экстракции — 90 °С, соотношение сырье : экстрагент — 1 : 100, кратность экстракции — 2, продолжительность I экстракции — 60 мин, II экстракции — 60 мин.
Методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в побегах черники обыкновенной
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 70% этилового спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику, нагревают до кипения на водяной бане и выдерживают в течение 1 часа,
периодически встряхивая. Извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 200 мл. Фильтр помещают в колбу для экстрагирования, прибавляют 100 мл 70% этилового спирта, присоединяют обратный холодильник и проводят вторую экстракцию при кипении в течение 1 часа. Извлечение фильтруют в ту же мерную колбу, объем раствора доводят до метки 70% этиловым спиртом и перемешивают (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 4 мл раствора А и 2 мл 2% раствора алюминия хлорида, доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор Б). Через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора Б в кювете с толщиной слоя
Таблица 4
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в побегах
черники обыкновенной
f x S P t Д x E, %
9 2,94 0,0448 95 2,26 0,10 3,44
Таблица 5
Результаты опытов с добавками рутина в анализируемые образцы
Количество флавоноидов в навеске, мг Добавлено рутина, мг Должно быть флавоноидов и рутина, мг Найдено флавоноидов и рутина, мг Абсолютная ошибка, мг Относительная ошибка, %
27,717 6,791 34,508 35,554 +1,046 3,03
26,746 13,582 40,328 41,272 +0,944 2,34
27,235 20,372 47,607 46,726 -0,881 1,85
Таблица 6
Содержание суммы флавоноидов в различных образцах побегов черники обыкновенной
Образцы сырья Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %
Баргузинский район (июль 2003 г.) 3,11 і 0,14
Прибайкальский район (июль 2004 г.) 2,94 і 0,11
Прибайкальский район (август 2005 г.) 2,86 і 0,10
10 мм при длине волны 415 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 4 мл раствора А, доведенного 70% этиловым спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора комплекса ГСО рутина с алюминия хлоридом.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в % Х вычисляют по формуле:
D x mO x 1OO x 1OO
X —------------------,
DO x mx flOO w)
где D — оптическая плотность испытуемого раствора; D0 — оптическая плотность ГСО рутина; m — масса сырья в г; m0 — масса ГСО рутина в г; w — потеря в массе при высушивании сырья в %.
Для проверки воспроизводимости разработанной методики проведено определение содержания суммы флавоноидов в 10 повторностях. Метрологические характеристики методики представлены в таблице 4.
Относительная ошибка определения суммы фла-воноидов в побегах черники обыкновенной составляет 3,44 %. В связи с этим, по предлагаемой методике достаточно проводить анализ в 3 повторностях.
Для проверки отсутствия систематической ошибки были проведены эксперименты с добавками рутина в анализируемые образцы. Полученные результаты, представленные в таблице 5 свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки.
По разработанной методике определено количественное содержание суммы флавоноидов в
Сведения об авторе
трех образцах сырья, собранных в двух районах Бурятии, результаты представлены в таблице 6.
ВЫВОДЫ
Таким образом, для стандартизации побегов черники обыкновенной предлагается количественное определение суммарного содержания флавоноидов, базирующееся на достаточно точном и нетрудоемком методе дифференциальной спек-трофотометрии. В побегах черники обнаружено относительно высокое количество флавоноидов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Беликов В.В. Экспрессный метод анализа флавоноидов в лекарственном растительном сырье / В.В. Беликов, Т.В. Точкова, Н.Т. Колесник // Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств: Материалы докладов Всесоюзной конференции, Москва, 18 — 21 декабря 1991 г. - М., 1991. - Т. 2. - С. 15-16.
2. Петров Е.В. Биологически активные вещества побегов черники обыкновенной (Vaccinium myrtillus L.) / Е.В. Петров, З.М. Занабадарова, Л.М. Танхаева // Сборник научных трудов ВСГТУ. Серия: Химия биологически активных веществ / ВСГТУ. - Улан-Удэ, 1999. -Вып. 5. - С. 93-97.
3. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Paeoniaceae-Thymelaeceae. - Л.: Наука, 1985. - 336 с.
4. Совершенствование анализа и технологии настоев и отваров, содержащих флавоноиды / О.Г. Аносова, М.В. Колпакова, Н.И. Минникова, Д.М. Мухамеджанова и др. // Фармация. - 1994. -№ 1. - С. 30-33.
Петров Евгений Васильевич - с.н.с. ИОЭБ СО РАН, к.фарм.н., 670047, г. Улан-Удэ, ул. М. Сахьяновой, д. 6, тел. (3012) 433463, Эл. почта: [email protected].
