CC BY
450
декабрь 2003
T^l
ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
ПРАКТИКУМ ПО GMP
Павел НОСЫРЕВ, Марина НОСЫРЕВА, Татьяна РАССКАЗОВА, Наталья КОРНЕЕВА,
ОАО «Ай-Си-Эн Лексредства»
Валидация аналитических методик:
ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА (ЧАСТЬ II. ПРАКТИКА)
В системе обеспечения качества фармацевтической продукции важную роль играет аналитический контроль сырья, полупродуктов и продуктов. Аналитические методы начинают применяться на стадии разработки и испытания препаратов, технологий производства и продолжают использоваться при серийном выпуске фармацевтической продукции.
РАЗРАБОТКА НОРМАТИВНОЙ ДОКУМЕНТАЦИИ
Большинство авторов практических рекомендаций по валидации методик сходятся во мнении, что необходимость валидации нужно осознать. Только сознательно и в полном объеме выполняемая работа по ва-лидации методик дает желаемый результат. Тщательное выполнение валидации кажется утомительным, дорогостоящим и длительным занятием. Но многие исследователи уже убедились на практике, что количество времени и ресурсов, требуемых для решения проблем, возникающих впоследствии из-за недостаточно полно проведенной валидации, превышает все возможные затраты на организацию исчерпывающей валидации методики [2, 8]. За три года практической работы по вали-дации методик мы в полной мере оценили важность процедуры и документации в данной работе. Первым этапом, как уже говорилось выше, является разработка нормативной документации (стандартной процедуры), детально описывающей проведение процесса валидации. В нашем варианте данная процедура включает следующие разделы:
1. Общие положения: цель, предмет, для кого предназначена;
2. Ответственность различных категорий персонала, участвующих в процессе;
3. Основные требования по безопасности;
4. Описание процедуры (наиболее объемный раздел);
5. Порядок регистрации данных;
6. Порядок пересмотра данной процедуры. Раздел 4 стандартной процедуры в данной редакции представляет собой методологическую часть, остальные разделы посвяще-
* Продолжение. Начало в «Ремедиуме» <10-11 2003 г.
ны организационным вопросам. Содержание методологического раздела можно условно представить в виде трех частей: определительная (описание параметров валидации и категорирование методик), процедурная (содержание и процедура составления протокола и отчета о валида-ции) и регламентирующая (рекомендуемые значения критериев для валидацион-ных параметров).
При определении валидационных параметров мы использовали общепринятые принципы и терминологию, изложенные выше. Для категорирования методик по типам (в зависимости от точности аналитического определения) и, соответственно, дифференцированного подхода к их валидации мы использовали принцип, изложенный в документах ICH и USP [1, 3, 4]. Методики условно разделяли на 3 категории:
Ф группа I — количественное определение основных компонентов субстанций, активных ингредиентов (включая консерванты) в ГЛС;
« группа II — определение примесей, родственных веществ, вспомогательных компонентов и пр.;
« группа III — растворение, однородность дозирования в ГЛС.
Составление протокола валидации методик — важнейшая часть процедуры. На этом этапе планируется весь объем эксперимента, предусматриваются условия, определяются значения критериев валида-ции методик. Примерное содержание протокола:
« вводно-информационная часть (цель, предмет, ответственность, перечень используемой литературы, исполнители, информация о валидируемых методиках); + методическая часть (условия пробопод-готовки, проведения измерений, расчеты
и статистическая обработка данных, определение аналитических параметров, исследуемых при проведении валидации); Ф заключительная оценочная часть (критерии оценки, выводы, заключение, рева-лидация).
При составлении протокола мы подробно излагали материал в каждом разделе, при этом в отчете неизбежно возникали повторения. Но данный подход удобен тем, что каждый отдельный протокол и отчет о валидации методики содержит практически всю информацию, необходимую для оценки правильности процедуры валидации и обоснованности выводов (заключения).
Отчет о валидации в нашем варианте практически полностью повторяет протокол (т.к. необходимо и в отчете описать все условия проведения процедуры), кроме этого добавляется расчетная часть и результаты валидации в виде выводов и заключения.
Такой подход к регистрации данных на первом этапе освоения методологии вали-дации аналитических методик кажется нам наиболее целесообразным. В дальнейшем, с накоплением практического опыта, возможно сокращение объема, но не в ущерб объективности. Изложение методологии валидационно-го эксперимента логичнее начинать с критериев оценки. Но так как валидация методик проводится по нескольким параметрам, чтобы избежать повторения, мы будем рассматривать эти параметры сразу с точки зрения и выбора критериев и методологии определения. Последовательность перечисления параметров соответствует последовательности их определения в процессе валидации методик.
Правильность аналитических методик в основном мы определяли анализом модельных смесей с точно известным содержанием аналита. Испытания проводились на 7^9 модельных смесях с известным содержанием аналита в нормальном ожидаемом диапазоне.
РШШииМ (декабрь 2003
ВАЛИДАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК: ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА (ЧАСТЬ II. ПРАКТИКА) ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
таблица 1| Средние значения показателей параметров валидации ВЭЖХ методик при различных концентрациях аналита
Параметр валидации Показатель Количество аналита, мкг
<0,1 0,1-0,5 0,5-1,0 1,0-6,0
Воспроизводимость Относительное стандартное отклонение ^г, %) 2,87 1,80 1,63 1,35
Сходимость Относительное стандартное отклонение ^г, %) 1,37 1,40 1,05 1,01
Правильность Относительная погрешность (ег, %) 2,04 2,03 1,67 1,54
Селективность Относительная погрешность (ег, %) 2,02 1,84 1,43 0,91
таблица 2
| Значения показателей параметров валидации методик различных групп
Параметр валидации Показатель Аналитическая группа
I II III
Воспроизводимость Относительное стандартное отклонение (бг , %) 0,6^3,0 1,5^9,0 0,6^3,0
Сходимость Относительное стандартное отклонение (бг , %) 0,4^2,0 0,8^6,0 0,4^2,0
Правильность Относительная погрешность (ег , %) 0,4^4,6 0,8^6,5 1,0^5,5
Специфичность Относительная погрешность (ег , %) 0,2^6,5 0,9^7,0 0,2^6,5
Линейность Коэффициент корреляции (г) 0,998^0,9999 0,985^0,999 0,998^0,9999
Относительное стандартное отклонение определения Y , %) 0,01^3,8 0,7^4,0 0,01^3,8
Устойчивость Относительная погрешность (ег , %) 0,6^4,6 1,7^4,2 2^4
Оценку правильности методики проводили по относительной погрешности. При этом, поскольку в различных объектах содержания аналитов различались, применяли гибкую схему критериев. Так, для методик группы I (количественное определение основных компонентов субстанций, активных ингредиентов в ГЛС) в зависимости от дозировки числовые критерии максимальной и средней погрешностей изменялись (для дозировки менее 50 мг — 8 и 4% соответственно, для дозировки 50^300 мг — 6 и 3%, для дозировки более 300 мг — 4 и 2%). Изменяемость критерия в зависимости от дозировки обусловлена соответствующим изменением допустимого диапазона отклонения дозы [17]. Для методик групп II и III (определение растворения, однородности дозирования, примесей) принимали универсальное значение критерия — средняя относительная погрешность не более 10%.
В качестве дополнительного критерия правильности применяли статистическую оценку значимости среднего значения относительной погрешности для всех модельных образцов.
При изменении концентрации аналита как для ВЭЖХ, так и для СФ методик погрешность также изменяется. Отличаются средние показатели правильности и для методик различных групп.
Очевидно, что правильность методики в основном определяется двумя факторами: ее специфичностью и степенью извлечения аналита из препарата [10]. Недостатки методики и в первом случае, и во втором будут проявляться в виде достаточно стабильной систематической погрешности, причем в случае недостаточного извлечения будет наблюдаться занижение результатов определения, а в случае плохой специфичности (мешающее влияние компонентов плацебо) — чаще всего наблюдается завышение результатов определения. Специфичность аналитических методик определяли по той же схеме, что и правильность, но в этом случае модельные смеси составляли с последовательным введением компонентов плацебо (для выявления возможного влияния каждого компонента). Так как модельные смеси различались, для оценки специфичности рассматривались результаты теста каждой модели. Принцип выбора критериев аналогичен таковому в тесте на правильность. Результаты испытания специфичности 25 методик ВЭЖХ (различное количество аналита) приведены в таблице 1 (максимальные значения отклонений из всех модельных смесей). В таблице 2 приведены данные по специфичности для методик различных групп.
Приобретая постепенно опыт по валида-ции методик, мы одновременно изменяли
свое отношение к значимости тех или иных параметров. И если вначале мы начинали валидационный эксперимент с определения линейности, сходимости и воспроизводимости, то в последнем варианте стандартной процедуры по валидации методик на первом этапе предусмотрено определение специфичности и правильности, т.к. именно по этим двум параметрам за все время работ мы получали наибольшее количество отрицательных результатов. В идеальном варианте данные параметры (специфичность и правильность) должны определяться в начальной стадии разработки любой методики. Линейность и интервал линейности определяли по 9^11 стандартным образцам с различными концентрациями ана-лита от 50 до 150% нормального ожидаемого, причем стандарты не содержали компонентов плацебо. Проводили регрессионный анализ данных методом наименьших квадратов. Степень линейности методики оценивали по коэффициенту корреляции, стандартной ошибке определения Y и относительному отклонению каждой точки от регрессионной прямой. Последний параметр также использовали для оценки интервала линейности методики. Критерии оценки линейности методик также устанавливали по «гибкой» схеме. Пределы обнаружения и количественного определения для методик группы II
декабрь 2003| РШШШМ
ПРОМЫШЛЕННОСТЬ ВАЛИДАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК: ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА (ЧАСТЬ II. ПРАКТИКА)
мы устанавливали в соответствии с рекомендациями [1, 3, 4] методом оценки «уровня шумов» с последующей проверкой на модельных смесях. Данный способ хорошо применим к инструментальным методам анализа, для неинструментальных (ТСХ с визуальной оценкой) сразу проводили анализы серии модельных смесей с различным содержанием аналита. Оценку уровня шумов проводили, применяя аналитическую процедуру к модельной смеси, содержащей все компоненты плацебо и не содержащей аналита, повторяя ее 10 раз. Затем оценивали средний уровень шумов (стандартное отклонение фонового сигнала). Для предварительной оценки предела определения брали десятикратное значение шума, для предела обнаружения — трехкратное. Окончательная оценка пределов проводилась определением правильности на модельных смесях, причем критерий соответствия устанавливали такой же, как и во всем интервале метода (погрешность не более 10%). Данный подход, на наш взгляд, более оправдан, чем определение по воспроизводимости [16] или сходимости [2].
Поскольку в различных препаратах нормируемые содержания примесей, как и процедуры методик, существенно различаются, невозможно выработать критерии по абсолютным значениям чувствительности методик. Мы пользовались относительным критерием: предел определения не должен превышать 20% от нормируемого уровня содержания примеси в препарате, предел обнаружения — не более 25%. Уже на этапе предварительной оценки предела определения по уровню шумов наблюдались существенные различия для методик различных типов. Практика показывает, что высокий уровень предела определения в большинстве случаев напрямую связан с неудовлетворительной специфичностью методик, что вполне логично, т.к. определяемые концентрации примесей в реальных объектах существенно ниже содержания других компонентов. Это еще раз подтверждает необходимость в первую очередь оценивать специфичность методик и лишний раз показывает преимущество хроматографических методов для данного конкретного применения (определение примесей). Точность методик определяли на одном из последних этапов валидации. Вначале определяли сходимость, затем — воспроизводимость. В первом случае анализ гомогенной пробы выполнялся 10 раз
в одной лаборатории на одном приборе одним аналитиком, во втором — тот же образец анализировали в разных лабораториях разные специалисты на разных приборах и в разное время (всего от 9 до 15 вариантов). Как объект анализа использовали реальные образцы лекарственных препаратов (за исключением методик определения примесей, где в реальные образцы искусственно вводили известное количество примеси в пределах интервала методики). Оценку проводили по относительному стандартному отклонению результатов анализов одного образца. Как и в случаях правильности, специфичности и линейности, применяли гибкую шкалу критериев. Для методик группы I допустимые значения sr принимали от 1,5 до 3% в зависимости от дозировки ЛС, для методик группы II — не более 10%, для методик группы III — не более 5%. Такие уровни кажутся нам наиболее обоснованными и хорошо согласуются с рекомендациями, приведенными в различных источниках [2, 3, 5]. Как и ожидалось, при определении точности аналитических методик наблюдается обратная зависимость относительного стандартного отклонения результата анализа от концентрации аналита. В зависимости от назначения методики также наблюдаются различия в результатах испытаний.
Испытания методик на точность дают еще один очень полезный практический результат: найденное стандартное отклонение методики легко преобразуется в доверительный интервал результата анализа. Последний используется для расчета так называемых «границ гарантированного качества». То есть определяется значение анализируемого показателя, которое дает определенную вероятность (например, 99%), что истинное значение находится в рамках, установленных НД. Таким образом, решается проблема «вечного камня преткновения» лабораторий ОКК и производства: выпускать или не выпускать продукцию на нижнем или верхнем пределе НД. Теперь можно обоснованно предъявлять требования: показатель должен быть выше нижнего предела (или ниже верхнего) на величину доверительного интервала (та самая ожидаемая неопределенность результатов измерений, о которой говорилось в первой части).
Устойчивость методик мы определяли проведением тестов правильности на модельных смесях с изменениями условий
проведения анализов либо проведением анализов реальных объектов в измененных условиях с последующим сравнением результатов с аналогичными, полученными в нормальных условиях. В обоих случаях результаты испытаний выражались в виде относительной погрешности. Критерии, как и в предыдущих случаях, устанавливали в зависимости от групп методик: 2,5^5,0% для методик группы I и 10% для групп II и III. Если в результате испытаний обнаруживали зависимость результатов анализа от изменения определенных условий, это не означало непригодность методики, а только обусловливало в дальнейшем особые предосторожности. За исключением отдельных случаев по отдельным параметрам (существенные изменения рН, температуры и т.п.) большинство исследованных нами методик показывало достаточно высокую устойчивость к небольшим отклонениям параметров. Очевидно, что данный показатель больше определяется индивидуальными особенностями методики и мало зависит от таких факторов, как количество аналита в матрице или определяемый показатель. На наиболее многочисленной группе исследованных нами методик (группа I) мы наблюдали для ВЭЖХ методик относительную погрешность до 4%, для спектрофото-метрических — до 5%. Подводя итог пока еще относительно короткому, но достаточно плодотворному пути нашей практической деятельности по освоению процесса валидации методик, можно отметить ряд положительных эффектов как в решении данной проблемы, так и в работе аналитических лабораторий в целом. Во-первых, отработана процедура, и мы приступили к этапу разумного сокращения объема эксперимента и документации. Во-вторых, мы обрели уверенность в методиках, что положительно сказалось как на работе отдела контроля качества, так и на производстве. Кроме того, валидационный эксперимент действительно оказался хорошей школой для персонала лабораторий, что отчетливо наблюдается уже на самом процессе валида-ции: если 2 года назад в самом начале ва-лидация одной методики занимала от 2 до 3 месяцев, то сегодня мы валидируем до 3 методик в месяц (не считая эксперимента предвалидации, выполняемого при разработке методик). Ж
Список использованной в статье литературы можно получить в редакции.
