CC BY
2432
62 I
ноябрь 2003
ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
ПРАКТИКУМ ПО GMP
Павел НОСЫРЕВ, Марина НОСЫРЕВА, Татьяна РАССКАЗОВА, Наталья КОРНЕЕВА,
ОАО «Ай Си Эн Лексредства»
Валидация аналитических метоДик:
ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА (ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ)
В системе обеспечения качества фармацевтической продукции важную роль играет аналитический контроль сырья, полупродуктов и продуктов. Аналитические методы начинают применяться на стадии разработки и испытания препаратов, технологий производства и продолжают использоваться при серийном выпуске фармацевтической продукции.
РЕКОМЕНДАЦИИ | ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПАРАМЕТРОВ
Следует подробнее остановиться на рекомендациях по определению различных параметров и примерах минимальных критериев для этих параметров. Мы приводим здесь краткий обзор этой информации в той последовательности параметров, которая обычно принимается авторами.
♦ Специфичность/селективность
Термины «селективность» и «специфичность» часто используются взаимозаменяемо [10]. Имеются разногласия между определением специфичности IUPAC/WELAC и ICH. IUPAC (Международный союз фундаментальной и прикладной химии) и WELAC (Западноевропейская лабораторная конференция аккредитации) относят термин «специфичный» (specific) к методу, который обеспечивает сигнал (отклик) только для одного аналита, в то время как термин «избирательный» (selective) относится к методу, который обеспечивает отклики для ряда химических объектов. Так как существует мало методов, которые определяют только один аналит, термин «селективность» обычно более предпочтителен. Тем не менее в документах ICH, USP [3, 4] и проекте российской ОФС по вали-дации методик [14] употребляется термин «специфичность», а не «селективность», и в дальнейшем мы также будем использовать «фармакопейную» терминологию. Нормативные документы определяют специфичность аналитического метода как его способность измерить точно аналит в присутствии мешающих веществ, которые могут ожидаться в матрице образца.
* Продолжение. Начало в «Ремедиуме» №10 2003 г.
Для хроматографических методов, например, рекомендуется сравнивать параметры пика аналита в модельных смесях, содержащих все возможные примесные соединения и компоненты плацебо, с аналогичными параметрами образца чистого аналита. После анализа таких смесей проводится оценка чистоты пика аналита и разрешения с ближайшим пиком. Пример критерия специфичности для хрома-тографических методов — разрешение не менее 1,5 с любым соседним пиком. Если этого невозможно достичь, необходимо показать, что неразрешенные компоненты на максимальном ожидаемом уровне не повлияют на результат количественного определения аналита более чем на 0,5% [2].
♦ Точность, сходимость и воспроизводимость
Точность метода обычно определяется как степень согласованности результатов множественных анализов одного образца. Измеренное среднеквадратичное отклонение для параллельных анализов подразделяют на три категории: сходимость (повторяемость), промежуточная точность и воспроизводимость [2, 5, 8]. Сходимость получают, когда анализ выполнен в одной лаборатории одним оператором на одном оборудовании за относительно короткий промежуток времени (в проекте ОФС [14] это называют почему-то воспроизводимостью). По крайней мере должно быть проведено 5 или 6 определений для трех различных матриц при двух или трех различных концентрациях и рассчитано относительное среднеквадратичное отклонение [8]. Другие авторы предлагают вначале испытать инструментальную воспроизводимость, затем определяется внутрилабора-торная воспроизводимость — повторяющийся анализ в одной лаборатории в
один день аликвоты однородной пробы с полным повторением процедуры приготовления пробы и выполнения измерений. Авторы оставляют на усмотрение исполнителей определение необходимого количества повторных приготовлений проб и повторных измерений для каждой пробы [2].
Критерий приемки для повторяемости существенно зависит от типа анализа. Для объектов сложного состава точность зависит от матрицы, концентрации аналита и методики анализа. Стандартное отклонение фг) может изменяться между 2% и 20%. Приводятся значения критериев инструментальной воспроизводимости sг = 1%, внутрилабораторной воспроизводимости sг = 2% для количественного определения основного компонента, для примесей на пределе определения — 5% и 10% соответственно [2]. АОАС приводит данные оценки сходимости как функции концентрации аналита (см. таблицу) [8]. Промежуточная точность определяется сравнением результатов выполнения метода в пределах одной лаборатории в течение нескольких недель. Она отражает несоответствия в результатах, полученных различными операторами, от различных приборов, с различными стандартами и реактивами, с колонками различных партий или их комбинациями [8].
Воспроизводимость представляет точность, полученную между лабораториями [4, 5]. Цель состоит в том, чтобы проверить, обеспечит ли метод те же самые результаты в различных лабораториях. Валидация воспроизводимости важна, если метод будет использоваться в различных лабораториях. Типичные переменные, влияющие на воспроизводимость метода [8]:
« различия в температуре и влажности окружающей среды;
« различные опыт и аккуратность операторов;
« различия в характеристиках оборудования и расходных материалов;
ноябрь 200з| РШШШМ
ПРОМЫШЛЕННОСТЬ ВАЛИДАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК: ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА (ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ )
4 различные качество и срок годности реактивов и других материалов.
♦ Правильность и извлечение
Правильность аналитического метода — степень, с которой соглашаются (сходятся) результаты испытаний и истинные значения. Истинное значение для оценки правильности может быть получено несколькими путями.
Во-первых, можно сравнить результаты метода с результатами валидированного эталонного метода (обычно редко применяется). Во-вторых, правильность может быть оценена анализом модельных образцов с известными концентрациями, приготовленными полностью из стандартных веществ или методом добавок [3, 4, 5, 8]. Возможность альтернативы здесь очень важна, например, в проекте российской ОФС [14] определение правильности методик анализа примесей предусмотрено только методом добавок, что резко ограничивает возможности экспериментатора.
После экстракции аналита из матрицы, его концентрация в извлечении обычно определяется сравнением сигнала экстракта с сигналом сравнительного материала, растворенного в чистом растворителе. Поскольку при этом оценка правильности измеряет также и эффективность подготовки пробы (извлечения), при проведении испытаний необходимо смоделировать фактическую подготовку пробы настолько близко насколько это возможно. Показано [10], что ожидаемое извлечение зависит от матрицы образца, процедуры обработки образца и от концентрации аналита.
Как пример приводятся следующие значения допустимой относительной погрешности при определении правильности методов [2]: для количественного определения — ±2% в диапазоне 80—100% номинальной концентрации аналита, для примесей с нормируемым содержанием — 0,1—2,5% — до ±10%.
♦ Линейность и калибровочная кривая
Линейность аналитического метода — показатель того, что результаты испытаний являются непосредственно или посредством четких математических преобразований пропорциональными концентрации аналита в образцах в пределах данного диапазона [3, 4]. Согласно большинству источников линейность определяется повторением от трех до шести инъекций пяти или большего количества
| ТАБЛИЦА Зависимость 1
повторяемости и извлечения
от концентрации аналита [8, 10]
Уровень концентрации аналита Сходимость (зг, %) Среднее извлечение (%)
1 1,3 98-102
10-1 2,8 98-102
10-2 2,7 97-103
10-3 3,7 95-105
10-4 5,3 90-107
10-5 7,3 80-110
10-6 11 80-110
10-7 15 80-110
10-8 21 60-115
10-9 30 40-120
стандартов, концентрации которых перекрывают 80—120% от ожидаемого концентрационного диапазона (некоторые авторы предлагают диапазон 50?150%) [2, 3, 4, 5, 8].
Для оценки линейности метода применяют ряд критериев. Во-первых, отклик должен быть пропорционален концентрации аналита. При этом рассчитывается уравнение регрессии и дополнительные статистические показатели. Уравнение линейной регрессии, примененное к результатам, должно иметь отрезок, отсекаемый на координатной оси, близкий к нулю. В противном случае должно быть доказано, что это не влияет на правильность метода. Коэффициент корреляции линейной регрессии должен быть близок к 1 (более 0,999 обычно считается приемлемым для установления линейности метода [8]).
Часто линейность оценивается графически в добавление к математической оценке или как альтернатива ей. Поскольку отклонения от линейности иногда трудно обнаружить, могут использоваться две дополнительные графические процедуры. Первый график должен изобразить взаимосвязь отклонения от линии регрессии и концентрации. Для линейных интервалов отклонения должны быть одинаково распределены между положительными и отрицательными значениями. Другой подход — построение зависимости относительных откликов от концентрации. Полученная линия должна быть горизонтальна по полному линейному диапазону
(отклонение от горизонтальной линии не более чем на 5%) [8].
Другие авторы устанавливают следующие значения допустимых критериев для различных методов [2]:
Ф для количественного определения коэффициент корреляции — не менее 0,99, пересечение с осью Y — не более 2% отклика номинальной концентрации, относительный отклик во всем диапазоне не отличается от относительного отклика при номинальной концентрации более чем на 2,5%;
« для определения примесей соответствующие числовые критерии — коэффициент корреляции 0,98, пересечение с осью Y — не более 10% отклика концентрации примеси 2,5%, разброс относительного отклика — не более 5%.
♦ Диапазон
Диапазон аналитического метода — интервал между верхними и нижними уровнями (включая эти уровни), для которых продемонстрировано, что они определяются с правильностью, точностью и линейностью, при использовании метода, как предписано. Диапазон обычно выражается в тех же самых единицах, что и результаты испытаний, полученные аналитическим методом (например, процент, доли на миллион). Пример критериев для установления диапазона: линейность и правильность соответствуют общим критериям для данных параметров, воспроизводимость для определения основного компонента не превышает 3%, для определения примесей — не выше 10% [2].
♦ Предел обнаружения и определения
Предел обнаружения — точка, в которой измеренная величина больше, чем неопределенность, связанная с ней [8]. Это самая низкая концентрация аналита в образце, которая может быть обнаружена, но не обязательно определена количественно. В хроматографии предел чувствительности — введенное количество, которое дает пик с высотой, по крайней мере, вдвое или втрое выше базового уровня шума. Предел определения — минимальное введенное количество, которое обеспечивает точные измерения (обычно от 10 до 20 раз выше, чем базовый шум). Если была определена требуемая сходимость метода в пределе определения, может использоваться подход ЕиМСНЕМ [16]. Ряд образцов с уменьшающимся количеством ана-лита анализируют и строят график зависимости относительного стандартного
РШШШМ |ноябрь 2003
ВАЛИДАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК: ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА (ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ ) ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
отклонения сходимости от количества аналита. Количество, которое соответствует предварительно определенной требуемой сходимости, равно пределу определения. Другой подход — установление предела определения по внутрилабора-торной воспроизводимости (рекомендуется sr = 20%) [2].
В то же время, согласно фармакопейной документации [1, 3, 4], установленный предел обнаружения и определения должен быть подтвержден анализом модельных смесей, содержащих аналит на пределе и близко к нему (очевидно, критерий «правильность»). В проекте ОФС [14] предполагается определять пределы методики по калибровочной кривой, что, на наш взгляд, не совсем корректно, т.к. при калибровке не учитывается влияние плацебо. Также ничего не говорится о проверке установленных пределов на модельных смесях.
♦ Устойчивость (надежность, прочность)
В испытаниях прочности исследуют влияние операционных параметров на результаты анализа. Для определения прочности метода ряд хроматографических параметров (например, скорость потока, температура колонки, объем ввода пробы, длина волны детектирования или состав подвижной фазы) изменяют в пределах реального диапазона и определяют количественное влияние этих переменных. Такие данные позволяют решить, должен ли метод быть ревалидирован, когда один или большее количество параметров изменены (например, для компенсации изменения колонки во времени) [2, 8]. В документах ICH рекомендуется проводить оценку прочности методов в фазе разработки, но не требуется включать как часть регистрационного приложения [4, 5]. В проекте ОФС [14] этот показатель опущен.
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОРГАНИЗАЦИИ ПРОЦЕССА ВАЛИДАЦИИ МЕТОДИКИ
На наш взгляд, очень интересны рекомендации по организации процесса валида-ции методики в целом [8]. Авторы подробно описывают этапы процесса и дают практические советы: 1. Разработать протокол валидации или рабочий процесс для валидации, в котором определить приложение, цель и область метода, эксплуатационные параметры и критерий приемки, валидационные эксперименты;
2. Определить необходимые рабочие характеристики оборудования, квалифицировать материалы, например, стандарты и реактивы;
3. Исполнить эксперименты предвалида-ции, корректировать параметры метода или критерии приемки в случае необходимости;
4. Исполнить полные внутренние и внешние эксперименты валидации;
5. Разработать СОП (стандартную операционную процедуру) для рутинного выполнения метода, определить критерии для ревалидации;
6. Определить тип и частоту испытаний пригодности метода;
7. Документировать эксперименты и результаты валидации в отчете. Протокол (план) валидации рекомендуется оформлять в форме подробной пошаговой инструкции [8]. На первом этапе определяется область метода и критерии его валидации. Рабочие характеристики метода следует выбирать с учетом предназначения методики [2, 8]. Если нет или недостаточно информации относительно рабочих характеристик методики, рекомендуется доказать пригодность в начальных экспериментах. Таким образом, развитие метода и валидация — итеративный процесс [2].
В официальной литературе нет рекомендаций по последовательности экспериментов валидации, и оптимальная последовательность может зависеть от метода непосредственно. Как один из вариантов может быть признана полезной следующая последовательность [9]:
1. Селективность стандартов (оптимизация разделения и детектирования на стандартных смесях);
2. Точность (сходимость, воспроизводимость);
3. Линейность, предел определения, предел обнаружения, диапазон;
4. Селективность с реальными образцами;
5. Правильность на различных концентрациях;
6. Прочность (межлабораторные изучения).
Другой вариант [2] предполагает следующую последовательность операций подготовки и выполнения валидационных исследований:
1. Постановка минимума требований для приемки метода (здесь же необходимо определить область применения методики, разработать план валидации с поша-
говым планированием валидационных экспериментов);
2. Определение специфичности (селективности) метода;
3. Исследование линейности;
4. Установление правильности метода;
5. Определение диапазона метода;
6. Изучение воспроизводимости (Этап I, инструментальная и внутрилабораторная воспроизводимость);
7. Установление предела обнаружения и предела количественного определения (для методик определения примесей);
8. Изучение стабильности методики;
9. Исследование воспроизводимости (Этап II, промежуточная и межлабораторная воспроизводимость);
10. Изучение устойчивости метода.
В отчет о валидации методики обычно рекомендуется включать следующее [8]: « цель и контекст метода (область применения, процедура);
« тип анализируемых веществ и матрицы;
4 детальную информацию о реактивах, эталонах и приготовлении контрольных (стандартных) образцов; + процедуры для проверок качества стандартов и используемых реактивов; « соображения безопасности; « параметры метода; « критические параметры, установленные при испытании прочности; « перечень оборудования и его функциональных и эксплуатационных характеристик, например (для хроматографии), размеры ячейки, шум базовой линии, диапазон температур колонки; « детальные условия проведения экспериментов, включая подготовку пробы; « процедуры вычислений и статистической обработки результатов; « процедуры для контроля качества в процессе эксплуатации методики (например, испытания пригодности системы); « графическую информацию, например хроматограммы, спектры и калибровочные кривые;
4 пределы эксплуатационных данных для принятия метода;
Ф ожидаемую неопределенность результатов измерения; « критерии для ревалидации; « специалистов, которые разрабатывали и первоначально валидировали метод; Ф резюме и заключения. ^
Список использованной литературы Вы можете запросить в редакции.
