CC BY
88
продукционный процесс и структура деревьев, древесин и древостоев
Таким образом, мы разработали эффективную методику клонального микроразмножения ясеня обыкновенного из вегетативного материала, полученного со взрослых деревьев, которая позволяет получить в течение года от одного исходного экспланта до 100 и более тысяч укорененных растений. Эта методика может быть использована как для быстрого размножения ценных генотипов, так и для проведения других работ, требующих культуры ткани in vitro, в частности, генетической трансформации.
Библиографический список
1. Лебедев, В.Г. Микроразмножение и регенерация адвентивных побегов ясеня обыкновенного (Fraxinus excelsior L.) в культуре in vitro / В.Г. Лебедев, И.И. Концевая, В.Е. Падутов и др. // Проблемы лесоведения и лесоводства: сб. науч. тр. ИЛ НАН Беларуси Институт леса НАН Беларуси.
- 2008. - Вып. 68. - С. 239-244.
2. Шестибратов, К.А. Лесная биотехнология: методы, технологии, перспективы / К.А. Шестибратов, В.Г. Лебедев, А.И. Мирошников // Биотехнология.
- 2008. - № 5. - С. 3-22.
3. Bosela M. J., Michler C. H. Media effects on black walnut (Juglans nigra) shoot growth in vitro: Evaluation of multiple nutrient formulations and cytokinin types // In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, 2008. - V. 44. - P. 316-329.
4. Du N., Pijut P.M. Regeneration of plants from Fraxinus pennsylvanica hypocotyls and cotyledons // Scientia Horticulturae, 2008. - V. 118. - P. 74-79.
5. Hammatt N., Ridout M.S. Micropropagation of common ash (Fraxinus excelsior) // Plant Cell Tiss. Org. Cult., 1992. - V13. - P. 67-74.
6. Huetteman C.A., Preece J.E. Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture // Plant Cell Tis. Org. Cult., 1993. - V. 33. - P. 105-119.
7. Kim M.-S., Klopfenstein N.B., Cregg B.M.. In vitro and ex vitro rooting of micropropagated shoots using three green ash (Fraxinus pennsylvanica) clones // New Forests, 1998. - V. 16. - P. 43-57.
8. Kim M.-S., Schumann C.M., Klopfenstein N.B. Effects of thidiazuron and benzyladenine on axillary shoot proliferation of three green ash (Fraxinus pennsylvanica Marsh.) clones // Plant Cell Tiss. Org. Cult., 1997. - V 48. - P. 45-52.
9. Navarrete N.E., Van Sambeek J.W., Preece J.E., Gaffeny G.R. Improved micropropagation of white ash (Fraxinus americana L.) // Proc. Seventh Central Hardwood Conf. Carbondale, USA 5-8 March 1989. P. 146-149.
10. Perez-Paron M.A., Gonz,lez-Benito M.E., Perez C. Micropropagation of Fraxinus angustifolia from mature and juvenile plant material // Plant Cell Tiss. Org. Cult., 1994. - V 37. - P. 297-302.
11. Silviera C.A., CottigniesA. Period ofharvest, sprouting ability of cuttings, and in vitro plant regeneration in Fraxinus excelsior // Can. J. Bot., 1993. - V. 72. -P. 261-267.
12. Tonon G., Capuana M., Di Marco A. Plant regeneration of Fraxinus angustifolia Vahl by in vitro shoot organogenesis // Scientia Horticulturae, 2001. - V 87. - P. 291-301.
13. Van Sambeek J.W., Preece J.E. In vitro propagation of Fraxinus species // Protocols for micropropagation of woody trees and fruits. 2007. Dordrecht, The Netherlands. P. 179-192.
УСТОЙЧИВОСТЬ ВСХОДОВ PINUS SYLVESTRIS И PICEA ABIES К СОЛЕВОМУ СТРЕССУ
Ю.В. ИВАНОВ, н. с. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, канд. биол. наук,
А.В. КАРТАШОВ, м. н. с. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН,
Ю.В. САВОЧКИН, асп., м. н. с. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН
[email protected]; [email protected]; [email protected] Древесные растения в связи с высокой продолжительностью онтогенеза являются наиболее уязвимыми компонентами фитоценоза. В свою очередь, среди древесно-кустарниковой растительности представители отдела хвойные (Pinophyta) характеризуются наименьшей устойчивостью к антропогенному и техногенному воздействиям.
Среди факторов, негативно влияющих на рост и продуктивность растений, особое
Усиление антропогенной деятельности и увеличение техногенной нагрузки на экосистемы приводит к существенной модификации фитоценозов, проявляющейся как в частичной потере определенных видов растений, так и полной замене на виды, не свойственные данным условиям. Наиболее значимым является изменение состава древесно-кустарниковой растительности, способное на долгие годы изменить направление развития фитоценоза.
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 3/2010
119
продукционный процесс и структура деревьев, древесин и древостоев
место занимает засоление почв. Исторически почвы с повышенным содержанием засаливающих агентов формировались в особых геохимических провинциях, в условиях аридного климата и прибрежных зонах Мирового океана. Четкая географическая приуроченность данных почв и определила специфику состава произрастающей на них растительности, ярким примером которой являются мангровые леса. Среди эндемичных видов растений, произрастающих на территории Австралии, насчитывается по меньшей мере 49 видов, устойчивых к действию засоления, из них 8 видов, выдерживающих концентрации 150-440 мМ NaCl в корнеобитаемом слое почвы [4].
Интенсивная антропогенная деятельность (оросительное земледелие и применение минеральных удобрений в сельском хозяйстве) привела к стремительному увеличению площадей, подверженных засолению. Повышение солености почв отмечается вдоль автомагистралей, на площадях, занятых под нефте- газо-и горнодобывающими производствами.
Засоление как мощный абиотический фактор среды вызывает не только снижение продуктивности, но и приводит к деградации естественных биогеоценозов. Уже более полувека одним из прямых путей поступления засаливающих агентов в окружающую среду является применение противогололедных средств, состоящих в основном из смесей галита (NaCl), сильвина (KCl), ангидрита (CaSO4) и глауберита (NaSO4CaSO4). Эти соединения в составе талых вод и воздушных аэрозолей способны распространяться на большие расстояния от полотна автомагистрали, вызывая засоление почв и повреждение растительности, особенно в придорожных лесных полосах.
Усиление действия засоления на лесные фитоценозы обуславливает необходимость изучения физиологического действия повышенных концентраций засаливающих агентов на рост и продуктивность древесных растений. В отличие от травянистых растений подобного рода исследования чрезвычайно фрагментарны и малочисленны [6, 8].
Анализ литературных сведений показал, что основными объектами исследования действия засоления на различные физиологи-
ческие параметры были представители рода Pinus (сосна приморская (Pirns pinaster Ait), сосна лучистая (Pinus radiata D.Don), сосна скрученная (Pinus contorta Dougl. ex Loud) и сосна ладанная (Pinus taeda L.)). Установлено, что все эти виды являются умеренно устойчивыми к действию засоления [9]. Однако данные виды растений для большей части лесопокрытой площади России не свойственны.
в связи с этим нами начаты исследования воздействия засоления на формирование всходов сосны обыкновенной (Pinus sylvestris
L.) и ели европейской (Picea abies (L.) Karst) с целью прогнозирования их состояния в будущем и оценки возможности лесовозобновления на землях, подвергающихся засолению.
Было исследовано влияние различных концентраций хлорида натрия (NaCl) на всхожесть семян и функционирование защитных систем всходов на стадии образования первичной хвои.
В качестве биохимических маркеров степени воздействия нами изучалась активность основных компонентов антиоксидантной защиты (супероксидисмутаза (СОД), каталаза, гваяколзависимые пероксидазы (ПО)), содержание низкомолекулярных антиоксидантов (пролин), содержание ионов (Na+, K+, Cl-), содержание малонового диальдегида (МДА) и перекиси водорода (H2O2).
На данном этапе работ исследованы концентрации NaCl: 10 мМ (соответствует содержанию 0,06 % легкорастворимых солей в почвенном растворе), 50 (0,29 %), 100 (0,58 %), 200 (1,17 %) и 300 мМ (l,8 %). По принятой в почвоведении классификации, к засоленным относят почвы с содержанием легкорастворимых солей более 0,25 %. Почвы с содержанием легкорастворимых солей более 1 % относят к солончакам.
В работе использованы семена ели европейской 2 класса качества (чистота партии семян - 92,5 %, всхожесть - 77 %) и семена сосны обыкновенной 2 класса качества (чистота - 97,5 %, всхожесть - 78 %) (ГОСТ 14161-86 «Семена хвойных древесных пород. Посевные качества»). Семена проращивали в условиях водной культуры с различным содержанием хлорида натрия. По достижении возраста 6-ти недель всходы фиксировали жидким азотом и
120
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 3/2010
продукционный процесс и структура деревьев, древесин и древостоев
хранили в замороженном состоянии (- 70° С) до проведения экспериментов.
Воздействие 10 и 50 мМ NaCl не вызывало снижения всхожести семян сосны обыкновенной и ели европейской. Напротив, в обоих случаях наблюдался незначительный (1-5 %) эффект стимуляции прорастания. Ингибирование прорастания наблюдалось при более сильном засолении. Так, при действии 100 мМ NaCl оно составляло 4-7 % от контроля, при 200 мМ - 55-58 % и при 300 мМ - 96-99 %. Поэтому дальнейшие исследования влияния засоления на всходы проводились при концентрациях хлорида натрия не более 100 мМ.
Действие всех исследованных концентраций приводило к ингибированию роста и развития корневой системы. Высокие концентрации NaCl (более 100 мМ) вызывали значительные нарушения в развитии всходов. Наблюдалось практически полное ингибирование роста корневой системы, ненормальное развитие семядолей и первичной хвои. Действие засоления приводило к снижению биомассы растений. В отличие от экспериментов Loustau на сосне приморской [9], нами отмечались изменения в соотношении биомасс корни/хвоя у обоих исследуемых видов в сторону доминирования надземной части.
При концентрациях 50 мМ NaCl и более отмечалось значительное потемнение корней растений. Вероятно, это связано с интенсивными процессами лигнификации. В пользу данного предположения свидетельствуют работы, в которых показано торможение развития кончиков корней сосны приморской при действии засоления и увеличение процента лигнифицированных корней [9].
Одним из первичных последствий воздействия хлорида натрия является нарушение ионного баланса, проявляющееся в накоплении ионов Na и/или Cl. В наших экспериментах воздействие NaCl в концентрации 10 мМ не вызывало изменения содержания ионов хлора, тогда как повышение концентрации более 50 мМ приводило к их аккумуляции (в 1,49 и 1,66 раз соответственно для ели и сосны). С другой стороны, накопление Na+ наблюдалось во всех вариантах опыта и носило более интенсивный характер. В вариантах опыта 10 мМ (в 1,91/2,08 раз, соответственно ель/
сосна), 50 мМ (3,57/4,15) и 100 мМ (5,12/5,70 раза по сравнению с контролем). При этом у растений не наблюдалось потери ионов калия, что может объясняться высоким потенциалом к накоплению неорганических ионов или функционированием специфических механизмов, поддерживающих гомеостаз калия.
Французскими исследователями было установлено, что длительное воздействие засоления (67 дней) приводит к значительному увеличению содержания ионов натрия (в 6-19 раз) в хвое сеянцев сосны приморской [9]. В то же время, в работе Sands and Clarke (1977) показано, что сосна приморская более успешно избегает засоления, нежели противостоит накоплению ионов натрия и хлора в хвое. Резкое увеличение солености корнеобитаемого слоя приводит к столь же значительному росту содержания ионов натрия и хлора в хвое растений и в итоге приводит к гибели растений [11].
В работе Bois[7] отмечается, что, несмотря на наблюдающуюся аккумуляцию ионов натрия, повышение солености почвенного раствора до 50 и 100 мМ NaCl приводит к развитию фотохимического стресса во всходах. однако при данных концентрациях токсический эффект засоления мог быть значительно снижен благодаря вакуализации избыточного содержания ионов и созданию высоких концентраций органических осмолитов в тканях.
Прогрессирующее засоление корнеобитаемого слоя сопровождается симптомами, очень сходными с действием засухи. Происходит постепенное снижение интенсивности транспирации, водного потенциала, осмотического потенциала хвои, двукратное и более снижение поступления минеральных анионов и катионов [4, 9]. В этих условиях восстановление нормального функционирования клеток и тканей возможно при изменении осмотического потенциала самого растения, компенсирующего высокую концентрацию засаливающих агентов во внешней среде. Распространенным путем восстановления осмотического баланса в растениях становится синтез совместимых осмолитов, одним из которых является пролин.
В наших экспериментах незначительное увеличение содержания пролина отмечалось лишь при концентрации 100 мМ (в
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 3/2010
121
продукционный процесс и структура деревьев, древесин и древостоев
1,23/1,34 раза по сравнению с контролем, ель/ сосна соответственно). Как нами установлено ранее, подобное воздействие вызывает у травянистых растений (Thellungiella halophila Mey., Arabidopsis thaliana L., Plantago major
L., Geum urbanum L., Thalictrum aquilegifolium L., Artemisia lerchiana L.) более существенное увеличение содержания пролина [1-3]. Однако, учитывая степень аккумуляции ионов натрия и хлора, можно предположить, что токсической концентрации в тканях всходов сосны обыкновенной и ели европейской они не достигли и, следовательно, не вызвали сильного осмотического шока, являющегося сигналом для аккумуляции пролина. В работах канадских исследователей, проведенных на сосне Банкса (Pirns banksiana L.) и ели канадской (Picea glauca (Moench) Voss), при увеличении концентрации NaCl в питательной среде показано увеличение содержания пролина и общих сахаров в побегах. Наибольшее содержание пролина и общих сахаров выявлено при концентрации 200 мМ NaCl. В то же время содержание осмолитов в корнях оставалось неизменным или изменялось незначительно [7].
общим негативным вторичным последствием действия на растения большинства стрессоров, в том числе засоления, является развитие окислительного стресса, при котором происходит комплексное нарушение важнейших процессов - дыхания и фотосинтеза. Причиной этого становится повреждение мембранных структур клетки, а также многих ферментов, обеспечивающих протекание многих окислительно-восстановительных реакций. Итогом развития окислительного стресса является высвобождение значительного количества свободных радикалов и активных форм кислорода, оказывающих токсическое действие на остальные компоненты клетки.
основным признаком формирующегося окислительного стресса является усиление перекисного окисления липидов мембран, накопление перекиси водорода (H2O2), супероксид-анион радикала (О-) и других активных форм кислорода, повреждающих клеточные структуры. В ответ на это изменение окислительно-восстановительного баланса клетки растений происходит индукция антиоксидантных защитных систем.
В наших исследованиях в условиях засоления не отмечено повышения содержания H2O2 и малонового диальдегида (продукта перекисного окисления липидов мембран). Это может объясняться значительным снижением процессов метаболизма во всходах еще на ранних этапах воздействия засоления, что выражалось в замедлении развития корневой системы и в низких темпах прироста биомассы. Такое избегание организмом нежелательных последствий действия стресса может рассматриваться как кратковременное и малоэффективное приспособление к неблагоприятным условиям.
Антиоксидантные защитные системы в растениях представлены ферментами, нейтрализующими активные формы кислорода (супероксид-анион радикал, перекись водорода и др.), а также низкомолекулярными антиоксидантами. В условиях засоления не происходило существенного изменения активности супероксиддисмутазы, фермента первой линии защиты клетки от супероксид-анион радикала. Методами нативного гель-электрофореза были обнаружены три изоформы СОД в хвое, а также было показано отсутствие изменения в их соотношении при действии засоления. Ранее проведенные исследования позволяют предположить, что были обнаружены Mn, Fe, Cu/Zn изоформы СОД [1, 3]. Одним из объяснений отсутствия заметной индукции супероксиддисмута-зы при засолении можно считать описанное выше замедление роста и развития всходов хвойных, что вызывало снижение интенсивности метаболизма и темпов накопления активных форм кислорода.
В активности других антиоксидантных ферментов, разрушающих H2O2 (каталаза, пероксидазы), отмечаются лишь незначительные изменения. Активность каталазы снижается по сравнению с контролем во всех исследованных случаях. Сходная картина наблюдается и в активности свободной пе-роксидазы. Лишь у ковалентно связанной пероксидазы отмечено наиболее значительное увеличение активности, что может свидетельствовать об интенсивно протекающих процессах лигнификации клеточных стенок. Косвенно это также подтверждается потем-
122
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 3/2010
