CC BY
26
ЗАЩИТА РАСТЕНИЙ
УДК 632.4
УСТОЙЧИВОСТЬ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЕРЕБРИСТОЙ ПАРШИ КАРТОФЕЛЯ (HELMINTHOSPORIUM SOLANI) К ТИАБЕНДАЗОЛУ
!Т.И. Хуснетдинова, к.б.н., !И.А. Кутузова, !И.С. Проничева, !Л.Ю. Кокаева, !М.А. Побединская, к.б.н., 2Е.М. Чудинова, к.б.н., !С.Н. Еланский, д.б.н.
1МГУ им. М.В. Ломоносова, e-mail: [email protected], [email protected] 2Институт белка РАН, e-mail: [email protected]
Изучена устойчивость 19 штаммов Helminthosporium solani к фунгициду тиабендазол из класса бензимидазолов, который входит в качестве действующего вещества в широко используемые в России препараты: протравитель семенных клубней Имикар и пирогенные шашки Вист. В работе представлены результаты тестирования устойчивости H. solani к тиабендазолу в лабораторных условиях в чашках Петри на питательной среде.
Исследования показали, что тиабендазол эффективно подавлял рост большинства штаммов H. solani (ЕС¡о < 6,5 mg/l). Мицелий чувствительных штаммов не переходил на содержащую фунгицид в концентрации более 10 mg/l питательную среду даже после 40 суток культивирования. Были обнаружены штаммы с очень высокой устойчивостью (EC50 > 1000 mg/l). Устойчивость российских штаммов H. solani обусловлена теми же мутациями, что и у европейских и американских штаммов. Для выявления устойчивых к тиабендазолу штаммов можно использовать тест-системы, разработанные зарубежными исследователями и показавшие хорошие результаты при практическом применении.
Ключевые слова: серебристая парша, Helminthosporium solani, поражения клубней картофеля, тиабендазол, устойчивость к фунгицидам
RESISTANCE OF HELMINTHOSPORIUM SOLANI STRAINS TO THIABENDAZOL
lPhD. T.I. Khusnetdinova, *I.A. Kutuzova, !I.S. Pronicheva, !L.Yu. Kokaeva, 1PhD. M.A. Pobedinskaya, 2PhD. E.M. Chudinova, Dr. Sci. S.N. Elansky
1Lomonosov Moscow State University, e-mail: [email protected], [email protected] 2Institute of Protein Research Russian Academy of Sciences, e-mail: [email protected]
In the paper 19 strains of Helminthosporium solani was studied for resistance to a fungicide thiabendazol (benzimidazole class). Thiabendazol is an active compound of pesticides widely applied in Russia, such as preparation Imikar for seed potato treatment and pyrogenic sticks «Vist» for use in potato storages. Data on testing of thiabendazol resistance under laboratory conditions (Petri plate method) are shown.
According to research data, thiabendazol effectively suppressed the growth of most H. solani strains (EC50 < 6.5 mg/l). Mycelium of sensitive strains didn't start growing on media with a fungicide concentration more than 10 mg/l even after 40 days of cultivation. The strains with a very high resistance (EC50 > 1000 mg/l) were detected. Therefore, the resistance of Russian H. solani strains is due to the same mutations as in European and American strains. For a detection of strains resistant to thiabendazol it is possible to use test-systems designated by foreign researchers and proved to be effective in application.
Keywords: silver scurf, Helminthosporium solani, benzimidazole fungicides, thiabendazole, resistance to fungicides.
Исследование выполнено при поддержке Российского Научного Фонда (проект № 14-50-00029).
Гриб аскомицет Helminthosporium solani Dur. et Mont - возбудитель серебристой парши картофеля. Болезнь поражает только клубни в период их вегетации и при хранении [1]. В результате на клубнях появляются серебристые пятна неправильной фор-
мы, причиной которых служит расслоение кожуры и попадание внутрь нее воздуха. Особенно хорошо заметны пятна на краснокожурных сортах, т.к. в местах поражения происходит потеря пигмента. Болезнь легко спутать с «черной пятнистостью»,
вызываемой грибом Colletotrichum coccodes, но при поражении H. solani нет черных точек склероциев. Отслоившаяся часть кожуры может слущиваться, что приводит к увеличению потери клубнем влаги во время хранения, и, соответственно, потере потребительских качеств. Развитие серебристой парши особенно опасно на семенных клубнях. При сильном поражении клубня почки отмирают, и всходы не образуются, что приводит к изреживанию посадок.
Одна из важнейших проблем в защите картофеля от серебристой парши - отсутствие сортов с высокой устойчивостью к этому заболеванию. Основным методом борьбы с серебристой паршой служит обработка клубней фунгицидными препаратами, а также поддержание температурно-влажностных режимов во время хранения. Одним из самых распространенных препаратов для защиты клубней от серебристой парши до сих пор остается тиабендазол [2]. В результате массового появления устойчивых штаммов в Европе и в Северной Америке произошла потеря эффективности его применения [3-5]. Ситуация с устойчивыми штаммами в России до сих пор неизвестна, анализа устойчивости штаммов H. solani не проводили, хотя применение тиабендазола в виде пирогенных шашек Вист остается самым популярным способом обработки семенного картофеля.
Цель работы - сравнение штаммов H. solani, выделенных из пораженных клубней картофеля из разных регионов России и из импортированного в Россию из Германии и Голландии семенного картофеля, по устойчивости к фунгициду тиабендазол и изучение структуры гена ß-тубулина, мутация в котором приводит к появлению устойчивости. Для подтверждения видовой принадлежности исследуемых штаммов проводили изучение морфологических признаков и секвенирование участка ядерных рибосомных генов и межгенных спейсеров.
Материалы и методы. В хранилище пробы клубней отбирали из разных мест насыпи или из разных контейнеров (ящиков). Каждый образец подписывали и помещали в отдельный чистый бумажный пакет и доставляли в лабораторию. После доставки в лабораторию клубни тщательно отмывали под струей воды; с них стерильным скальпелем срезали ломтики и помещали кожурой вверх во влажные камеры, в качестве которых использовали стерильные чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой. С каждого клубня выделяли по 1 изоляту H. solani.
Для выделения чистых культур кусочек пораженной ткани на предметном стекле из влажной камеры помещали под бинокулярный микроскоп и остро заточенной стерильной препаровальной иглой, предварительно охлажденной в агаризованной среде, снимали конидии гриба или отделяли кусочек гифы и помещали их в центр чашки Петри с
агаризованной средой. В качестве питательной среды для роста грибов использовали сусло-агар. В среду предварительно добавляли антибиотик пенициллин (бензилпенициллина № соль, 1000 ед/мл) для предотвращения роста бактерий. После появления колонии гриба на питательной агаризован-ной среде с края колонии под бинокулярным микроскопом брали кусочек гифы или конидии и переносили их на чистую чашку Петри с агаризованной средой. Хранили коллекцию штаммов на скошенной агаризованной среде (сусло-агар) при +50С
Оценку устойчивости к тиабендазолу проводили в чашках Петри на агаризованной (сусло-агар) среде с добавлением фунгицида в концентрациях 0,1, 1, 10, 100 и 1000 мкг/мл по действующему веществу и на среде без фунгицида (контроль). Исследуемый изолят высевали в центр чашки Петри. Когда диаметр контроля достигал 60-80% от диаметра чашки Петри, проводили замер двух взаимно перпендикулярных радиусов всех исследуемых колоний. После измерения проводили усреднение по 2-м радиусам. Эксперименты проводили в трех по-вторностях, результаты которых также усредняли. Для каждого изолята с помощью математической обработки определяли показатели EC50 (концентрация фунгицида, необходимая для замедления скорости радиального прироста колонии в 2 раза относительно бесфунгицидного контроля). Для тестов использовали препарат Имикар, КС, производства ООО «Агрорус-Альянс», содержащий в своем составе 280 г/л имидаклоприда и 80 г/л тиабендазола. Ранее нами было показано, что имидаклоприд не токсичен для Н. ьоЫт, в связи с чем во всех тестах учитывали только содержание тиабендазола. Также изоляты были протестированы на устойчивость к незарегистрированному в России препарату Тес1о (тиабендазол 41,8%). Результаты тестирования устойчивости штаммов к обоим препаратам (в пересчете на чистый тиабендазол) совпали.
Мицелий грибов наращивали в жидкой гороховой среде, после 5-7 суток инкубации при комнатной температуре мицелий извлекали из жидкой среды, отмывали в дистиллированной воде, высушивали, растирали в жидком азоте и лизировали в СТАВ буфере. ДНК очищали с использованием хлороформа и хранили в деионизованной воде при -20°С
Амплификацию ДНК проводили в 25 мкл раствора, содержащего около 50 нг ДНК, по 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), по 0,2 мкМ каждого праймера, 2,5 ед Taq-полимеразы (Евроген, Россия) в буфере, предоставленном производителем Taq-полимеразы [6, 7]. В качестве негативного контроля вместо ДНК использовали 1 мкл деионизованной воды. Амплификацию проводили на термоциклере Biometra Программа ПЦР включала денатурацию ДНК в течение 3 мин. при 94°^ далее 30 циклов:
94°C в течение 30 сек., 58°C (30 сек.), 72°C (45 сек.); после прохождения всех циклов 72°C в течение 5 мин. После амплификации ПЦР-продукт разделяли электрофоретически в 1% агарозном геле с добавленным в него бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в 0,5* Trisborate EDTA (TBE) при 100В и постоянной мощности в течение приблизительно 1 часа. Визуализировали и фотографировали результаты элек-трофоретического разделения с использованием UVP ImageStore 7500 UV Transilluminator (UVP Inc., Upland, CA). Для секвенирования из геля вырезали ампликоны и очищали их на колонках с использованием набора Цитокин (ООО «Цитокин», Россия).
Ампликоны, полученные с помощью ПЦР, секве-нировали с использованием набора реактивов BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA.) на автоматическом се-квенаторе Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Каждый фрагмент секвенировали 2 раза с прямого и обратного праймеров (табл. 1). Полученные последовательности нуклеотидов использовали для поиска соответствия в GenBank с использованием программы BLASTn (version 2.0, National Center for Biotechnology Information, United States National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
Результаты и обсуждение. Все проанализиро-
ванные участки ДНК оказались абсолютно одинаковыми. Они полностью (на 100%) совпали с имеющимися в базе Genbank сиквенсами КС106739 [8, 9], идентифицированными в обеих работах как принадлежащие штаммам вида Не1тт1ко8ротшт ьоЫт. Результаты молекулярного анализа совпали с данными культурально-морфологических тестов, также показавших принадлежность исследуемых штаммов виду Н. ьоЫт.
Тиабендазол эффективно подавлял рост большинства протестированных штаммов (ЕС50 < 6,5 mg/l). Рост чувствительных изолятов полностью подавлялся сравнительно невысокими концентрациями тиабендазола, их мицелий не переходил на содержащую фунгицид в концентрации 10 и более питательную среду даже после 40 суток культивирования. В то же время среди российских и нидерландских штаммов были обнаружены изо-ляты с очень высокой устойчивостью к тиабенда-золу. На устойчивые штаммы препарат практически не действовал. Показатели ЕС50 для чувствительных и устойчивых штаммов отличались более, чем в 1000 раз (таблица).
Тиабендазол - бензимидазольный фунгицид, который связывается с грибным белком Р-тубулином и ингибирует деятельность микротрубочек. При му-
Структура гена ß-тубулина штаммов H. solani, различающихся по устойчивости
к тиабендазолу. Кодоны с мутацией подчеркнуты
Штамм Место и год сбора пораженного клубня, Устойчивость к тиа- Сиквенсы кодонов 197-200
сорт картофеля бендазолу, EC50, mg/l гена ß-тубулина
Штаммы выделены из клубней, выращенных в России из отечественного семенного материала
RB7 Брянская обл., 2013, Розара 5,4 GACGAGACCTTC
RB11 Брянская обл., 2013, Винета 6,5 GACGAGACCTTC
RMCh2* Московская обл., 2014, Невский >1000 GACGAGACCTAC
RMCh24** Московская обл., 2014, Невский >1000 GACCAGACCTTC
RM4d Московская обл., 2013, Жуковский ранний 0,5 GACGAGACCTTC
RKSt39 Костромская обл., 2013, Удача 5,9
RKSt68 Костромская обл., 2013, Удача 5,7 GACGAGACCTTC
RCh1 Чувашия, 2014, Удача - GACGAGACCTTC
RCh8 Чувашия, 2014, Удача 1,7 GACGAGACCTTC
Штаммы выделены из клубней, выращенных в России из импортированного семенного материала
RKSu2/2 Костромская обл., 2014, Альвара 0,7 GACGAGACCTTC
RKSu7 Костромская обл., 2014, Дельфине 0,7 -
RKSu10** Костромская обл., 2015, Сафия - GACCAGACCTTC
Штаммы выделены из импортированного семенного ка ртофеля
H16** Нидерланды, 2013, Астерикс >1000 GACCAGACCTTC
G3 Германия, 2013, Альвара 1,0 GACGAGACCTTC
G11 Германия, 2013, Дельфине 0,5 GACGAGACCTTC
G12 Германия, 2013, Эстрелла - GACGAGACCTTC
G18 Германия, 2013, Сафия 0,5 GACGAGACCTTC
G20 Германия, 2013, Сафия 5,8 GACGAGACCTTC
G21 Германия, 2013, Сафия 5,3 GACGAGACCTTC
Примечание: * - штамм RMCh2 имеет мутацию в 200 кодоне, выражающуюся в замене Phe (TTC) на Tyr (TAC); ** - штаммы RMCh24, RKSu10, H16 имеют мутацию в 198 кодоне, выражающуюся в замене Glu (GAG) на
Gln(CAG) при трансляции;
*** - не тестировали.
тациях в гене Р-тубулина (как правило, это одно-нуклеотидные замены в кодонах 198 или реже в 200) штамм становится высокоустойчивым к фунгицидам бензимидазольной группы. Устойчивые изоляты отмечены среди разных видов грибов в разных странах мира [10, 11]. В нашей работе структура гена Р-тубулина определена у 16 различающихся по устойчивости к тиабендазолу российских и европейских штаммов. Все исследованные последовательности, принадлежащие чувствительным штаммам, оказались одинаковыми и полностью совпали с последовательностью Genbank Y10670 [7], характерной для чувствительных к тиа-бендазолу штаммов. Высокоустойчивые штаммы RMCh24 (выделен в Московской области из клубня картофеля сорта Невский, выросшего из местного семенного материала) и H16 (выделен из клубня картофеля сорта Астерикс, импортированного из Нидерландов) содержали однонуклеотидную замену в позиции, соответствующей 198 кодону, что приводило к замене Glu (GAG) на Gln (CAG) при трансляции. Среди штаммов, выделенных в Костромской области из картофеля сорта Сафия, семенной материал которого был привезен из Германии, также был выявлен один штамм (RKSu10) с мутацией в 198 кодоне. На устойчивость к тиабендазолу этот изолят не проверяли. В той же партии клубней, что и RMCh24, был обнаружен устойчивый к тиабендазолу штамм RMCh2. Штамм RMCh2 не имел мутации в 198 кодоне, но имел мутацию в 200 кодоне, выражавшуюся в замене Phe
(TTC) на Tyr (TAC). Эта мутация устойчивости также описана в литературе [7, 11] как вызывающая устойчивость к бензимидазолам.
Результаты работы показывают, что в России, как и в других странах, встречаются устойчивые к тиабендазолу штаммы. В России тиабендазол является самым популярным препаратом для защиты клубней во время хранения. Для эффективной защиты клубней с помощью тиабендазола необходим мониторинг встречаемости устойчивых штаммов в популяциях H. solani из разных регионов и в семенном картофеле, в том числе импортированном. Однако анализ устойчивости штаммов H. solani к фунгицидам сложен из-за очень малой скорости роста этого гриба. Даже на среде без добавления фунгицида колония достигает пригодного для учета диаметра в 40-50 мм на 20-25 сутки, а у некоторых штаммов и позже. В таких условиях методы молекулярной диагностики устойчивости с помощью ПЦР являются очень удобными.
Таким образом, для молекулярной диагностики устойчивости к тиабендазолу можно использовать хорошо зарекомендовавший себя метод McKay и Cooke [7], а также тест-системы, разработанные другими исследователями. Тесты на основе ПЦР могут выявить устойчивый штамм в пораженном материале в течение нескольких часов без выделения чистой культуры гриба, что позволит оперативно разработать стратегию защиты клубней от серебристой парши и подобрать эффективные фунгициды.
Литература
1. Secor G.A., Gudmestad N.C. Managing fungal diseases of potato // Canadian Journal of Plant Pathology, 1999, V. 21. - P. 213-221.
2. Hide G.A., Hall S.M., Boorer K.J. Resistance to thiabendazole in isolates of Helminthosporium solani, the cause of silver scurf disease of potatoes // Plant Pathology, 1988, V. 37. - P. 377-380.
3. Merida C.L., Loria R. First report of resistance of Helminthosporium solani to thiabendazole in the United States // Canadian Plant Disease Survey, 1990, V. 74. - P. 614.
4. Kawchuk L.M., Holley J.D., Lynch D.R., Clear R.M. Resistance to thiabendazole and thiophanate-methyl in Canadian isolates of Fusarium sambucinum and Helminthosporium solani // Am. Potato J., 1994, V. 71. - P. 185-192.
5. Platt H.W. Résistance to thiabendazole in Fusarium species and Helminthosporium solani in potato tubers treated commercially in eastern Canada // Phytoprotection, 1997, V. 78. - P. 1-10.
6. White T.J., Bruns T., Lee S. Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylo-genetics // PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic press., 1990. - P. 315-322.
7. McKay G.J., Cooke L.R. A PCRbased method to characterise and identify benzimidazole resistance in Helminthosporium solani // FEMS Microbiol. Lett., 1997, V. 152. - P. 371-378.
8. Al-Mughrabi K.I., Vikram A., Peters R.D., Howard R.J., Grant L., Barasubiye T., Lynch K., Poirier R., Drake K.A., Macdonald I.K., Lisowski S.L. and Jayasuriya K.E. Efficacy of Pseudomonas syringae in the management of potato tuber diseases in storage // Biol. Control, 2013, V. 64 (3). - P. 315-322.
9. Olivier C., Loria R. Detection of Helminthosporium solani from soil and plant tissue with species-specific PCR primers // FEMS Microbiol. Lett., 1998, V. 168 (2). P. - 235-241.
10. Davidse L.C., Flach W. Interaction of thiabendazole with fungal tubulin // Biochimica et Biophysica Acta, 1978, V. 543. - P. 82-90.
11. Koenraadt H., Somerville S.C., Jones A.L. Characterization of mutations in the beta-tubulin gene of benomil resistant field strains of Venturia inaequalis and other plant-pathogenic fungi // Phytopathology, 1992, V. 82. - P. 1348-1354.
