CC BY
4
Научная статья/Research Article УДК 663.15
DOI: 10.36718/1819-4036-2023-2-247-254
Софья Владимировна Овсянкина1, Сергей Витальевич Хижняк2, Полина Александровна Аболенцева3, Яна Викторовна Смольникова4, Елена Николаевна Олейникова5^
12,3,4,5Красноярский государственный аграрный университет, Красноярск, Россия
УСТОЙЧИВОСТЬ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ АМИЛАЗЫ ALTERNARIA TENUISSIMA И GEOMYCES PANNORUM К ЛИОФИЛИЗАЦИИ
Цель исследования - проверка возможности лиофилизации штаммов Alternaría tenuissima и Geomyces pannorum, выделенных авторами в качестве потенциальных продуцентов амилазы, для пищевой промышленности. Конидии изучаемых штаммов суспендировали в защитных средах и лиофилизировали с помощью лиофилизатора Bio-Rus-4SFD. Использовали три защитные среды: стандартный желатин-сахарозный агар (сахароза 10 %, желатин 1,5 %, агар 0,01 %), рекомендованный Всероссийской коллекцией микроорганизмов; желатин-сахарозный агар с добавлением 1 % аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта; пептон-сахарозо-глицериновая смесь, разработанная авторами (вода дистиллированная 90 мл, глицерин 10 мл, сахароза 10 г, пептон 3,2 г). Контролем служили конидии, суспендированные в дистиллированной воде без лио-протекторов. Жизнеспособность лиофилизированных конидий оценивали по их способности к прорастанию на агаризованной культуральной среде. Выживаемость конидий G. pannorum при лиофилизации во всех вариантах, за исключением контроля, была статистически значимо (p<0,001) выше, чем выживаемость конидий A. tenuissima. Жизнеспособность лиофилизирован-ных конидий A. tenuissima не зависела от использования защитных сред и составила в контрольном варианте 75,9 %, в варианте с желатин-сахарозным агаром 76,4 %, в варианте с пептон-сахарозо-глицериновой смесью 77,1 %. Жизнеспособность лиофилизированных конидий G. pannorum без использования защитных сред составила 82,0 %, в варианте с желатин -сахарозным агаром 95,3 %, в варианте с пептон-сахарозо-глицериновой смесью 88,1 %. Добавление в защитную среду аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта привело к статистически значимому (p<0,001) снижению доли выживших при лиофилизации конидий A. tenuissima до 7,2 %, а доли выживших конидий G. pannorum до 44,4 %.
Ключевые слова: амилаза, Alternaría tenuissima, Geomyces pannorum, лиофилизация, защитные среды
Для цитирования: Устойчивость потенциальных продуцентов амилазы Alternaría tenuissima и Geomyces pannorum к лиофилизации / С.В. Овсянкина [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2023. № 2. С. 247254. DOI: 10.36718/1819-4036-2023-2-247-254.
Благодарности: работа выполнена при финансовой поддержке Министерства сельского хозяйства Российской Федерации в рамках темы «Конструирование защитных сред высушивания и разработка режимов лиофилизации пробиотических и почвенных микроорганизмов».
© Овсянкина С.В., Хижняк С.В., Аболенцева П.А., Смольникова Я.В., Олейникова Е.Н., 2023 Вестник КрасГАУ. 2023. № 2. С. 247-254. Bulliten KrasSAU. 2023;(2):247-254.
Sofia Vladimirovna Ovsyankina1, Sergey Vitalievich Khizhnyak2,
Polina Alexandrovna Abolentseva3, Yana Viktorovna Smolnikova4, Elena Nikolaevna Oleinikova5
12,3,45Krasnoyarsk State Agrarian University, Krasnoyarsk, Russia
RESISTANCE OF POTENTIAL AMYLASE PRODUCERS ALTERNARIA TENUISSIMA AND GEOMYCES PANNORUM TO LYOPHILIZATION
The purpose of the study is to test the possibility of lyophilization of Alternaría tenuissima and Geomyces pannorum strains isolated by the authors as potential amylase producers for the food industry. The conidia of the studied strains were suspended in protective media and lyophilized using a Bio-Rus-4SFD lyophilizer. Three protective media were used: standard gelatin-sucrose agar (sucrose 10 %, gelatin 1.5 %, agar 0.01 %) recommended by the All-Russian Collection of Microorganisms; gelatin-sucrose agar with the addition of 1 % ascorbic acid as an antioxidant; peptone-sucrose-glycerol mixture developed by the authors (distilled water 90 ml, glycerol 10 ml, sucrose 10 g, peptone 3.2 g). Conidia suspended in distilled water without lyoprotectors served as controls. The viability of lyophilized conidia was assessed by their ability to germinate on an agar culture medium. The survival rate of G. pannorum conidia during lyophilization in all variants, except for the control, was statistically significantly (p<0.001) higher than the survival rate of A. tenuissima conidia. The viability of lyophilized A. tenuissima conidia did not depend on the use of protective media and amounted to 75.9 % in the control variant, 76.4 % in the variant with gelatin-sucrose agar, and 77.1 % in the variant with peptone-sucrose-glycerol mixture. The viability of lyophilized G. pannorum conidia without the use of protective media was 82.0 %, in the variant with gelatin-sucrose agar 95.3 %, in the variant with peptone-sucrose-glycerol mixture 88.1 %. The addition of ascorbic acid as an antioxidant to the protective medium led to a statistically significant (p<0.001) decrease in the proportion of A. tenuissima conidia surviving during lyophilization to 7.2 %, and the proportion of G. pannorum conidia surviving to 44.4 %.
Keywords: amylase, Alternaría tenuissima, Geomyces pannorum, lyophilization, protective media
For citation: Resistance of potential amylase producers Alternaría tenuissima and Geomyces pannorum to lyophilization / S.V. Ovsyankina [et al.] // Bulliten KrasSAU. 2023;(2): 247-254. (In Russ.). DOI: 10.36718/1819-4036-2023-2-247-254.
Acknowledgments: the work has been financially supported by the Ministry of Agriculture of the Russian Federation within the framework of the topic "Designing protective environments for drying and developing modes of lyophilization of probiotic and soil microorganisms".
Введение. Одними из наиболее востребованных ферментов микробного происхождения, применяемых в пищевой и перерабатывающей промышленности, а также в сельском хозяйстве, являются амилазы, на долю которых приходится около 25 % мирового рынка ферментов. Микробные амилазы применяют для конверсии крахмала в олигосахариды и в глюкозу в бродильных и крахмало-паточных производствах, для отбеливания сырья в бумажном и текстильном производствах, в качестве биодобавок к моющим средствам, а также в качестве добавок в крах-
малсодержащие корма в птицеводстве и животноводстве для повышения их усвояемости [1-3].
Несмотря на обилие амилолитических штаммов, применяемых в промышленности, постоянно идет поиск новых, в т. ч. нетрадиционных продуцентов микробных амилаз. В качестве одного из перспективных продуцентов амилолитических ферментов рассматриваются грибы р. Alternaria [4-6]. Другим перспективным продуцентом, позволяющим осуществлять процесс при пониженной температуре, являются выделенные из пещер низкотемпературные амилолитические штаммы Geomyces pannorum [7, 8].
Использование штаммов в биотехнологических процессах невозможно без сохранения их исходных вариантов в микробиологических коллекциях. Общепризнанным, наиболее надежным способом такого сохранения считается их сублимационное высушивание из замороженного состояния (лиофилизация) [9, 10]. Главной проблемой при лиофилизации является возможная гибель микробных клеток в процессе замораживания и высушивания. Для решения этой проблемы используют разнообразные эмпирически подбираемые защитные среды, повышающие долю выживших при лиофилизации клеток [11].
Цель исследований - изучение возможности лиофилизации выделенных авторами в ходе предыдущих исследований амилолитических штаммов Alternaria tenuissima К22 и Geomyces pannorum ВКМ F-4777D.
Задачи: проверка возможности сохранения жизнеспособности штаммов при лиофилизации без использования защитных сред, с использованием стандартных защитных сред; выбор за-
щитной среды, обеспечивающей максимальное сохранение жизнеспособности исследуемых штаммов при лиофилизации.
Объекты и методы. Объектами исследования служили выделенные авторами штаммы Alternaria tenuissima К22 и Geomyces pannorum ВКМ F-4777D. Штамм Altemaria tenuissima К22 выделен из инфицированного зерна яровой пшеницы, штамм G. pannorum ВКМ F-4777D выделен из грунта карстовой пещеры Караульная-2 и запатентован в качестве низкотемпературного продуцента амилазы [12]. Оба штамма характеризуются высокой амилолитической активностью (рис. 1).
Конидии изучаемых штаммов суспендировали в одной из защитных сред, после чего лиофилизировали в лиофильной сушилке Bio-Rus-4SFD в следующем режиме: замораживание при -36 °C в течение 5 ч; основная сушка при -40 °C в течение 15 ч при давлении 60 Па; вторичная сушка с шагом от 5 °C до 15 °C при давлении 80 Па в течение 5 ч [13, 14].
Рис. 1. Амилолитическая активность изучаемых штаммов: 1 - A. tenuissima К22; 2 - G. pannorum
ВКМ F-4777D
В качестве защитных сред использовали са-харозо-желатиновый агар (среду Файбича) [15, 16], среду Файбича с 1 % аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта [17] и разработанную авторами пептон-сахарозо-глицериновую среду следующего состава: пептон ферментативный сухой - 3,2 г; сахароза - 10 г; глицерин - 10 мл;
вода дистиллированная - 90 мл. Контролем служили конидии, суспендированные в дистиллированной воде без добавления лиопротекторов.
Жизнеспособность конидий после лиофили-зации определяли прямым методом по их способности к прорастанию на агаризованной питательной среде (рис. 2).
Долю выживших конидий определяли как отношение числа конидий, сформировавших про-ростковые гифы, к общему числу конидий. Среднее число конидий, просмотренных в каж-
дом варианте на предмет наличия проростко-вых гиф, составило 168 шт. для А. tenuissima К22 и 282 шт. для в. раппогит ВКМ F-4777D.
Рис. 2. Примеры непроросших (1) и проросших (2) конидий изучаемых штаммов: верхние фотографии - А. tenuissima К22; нижние фотографии - в. раппогит ВКМ F-4777D
Статистическую значимость различий между контрольным вариантом и вариантами с защитными средами по доле проросших конидий проверяли точным тестом Фишера для таблиц 2 х 2 с использованием GraphPad QuickCalcs в качестве программного обеспечения.
Результаты и их обсуждение. Выживаемость конидий А. tenuissima К22 в контроле (без использования защитной среды) составила 75,9 %. Использование защитной среды Файби-ча и пептон-сахарозо-глицериновой среды не привело к статистически значимому изменению доли выживших конидий, которая составила 76,4 % для среды Файбича и 77,1 % для пептон-сахарозо-глицериновой среды. Введение аскорбиновой кислоты в среду Файбича привело к
статистически значимому ф < 0,001) снижению доли выживших конидий до 7,2 % (рис. 3).
Выживаемость конидий в. раппогит ВКМ F-4777D в контроле (без использования защитной среды) составила 82,0 %. Использование защитной среды Файбича привело к статистически значимому ф < 0,001) увеличению доли выживших конидий до 95,3 %. Пептон-сахарозо-глицериновая среда также статистически значимо ф < 0,05) увеличила долю выживших конидий до 88,1 %. Как и в случае с А. tenuissima К22, введение аскорбиновой кислоты в среду Файбича привело к статистически значимому ф < 0,001) снижению доли выживших конидий в. раппогит ВКМ F-4777D (до 44,4 %) (рис. 4).
Контроль без лиопротекторов
I Проросшие Непроросшие
СредаФайбича
23,6%
I Проросшие ■ Непроросшие
Среда Файбича с аскорбиновой кислотой
7,2%
I Проросшие ■ Непроросшие
Пептон-сахарозо-глицериновая среда
22,9°%
I Проросшие ■ Непроросшие
Рис. 3. Прорастание лиофилизированных конидий А. tenuissima К22 в разных вариантах эксперимента
Контроль без лиопротекторов Среда Файбича
4,7%
18,0% к
82,0% 95,3%
■ Проросшие ■ Непроросшие ■ Проросшие ■ Непроросшие
Среда Файбича с аскорбиновой Пептон-сахарозо-глицериновая среда
кислотой
11,9%
44,4%
55,6%
88,1%
■ Проросшие ■ Непроросшие ■ Проросшие ■ Непроросшие
Рис. 4. Прорастание лиофилизированных конидий G. раппогит ВКМ F-4777D в разных вариантах эксперимента
В целом по эксперименту выживаемость конидий в. раппогит при лиофилизации во всех вариантах, за исключением контроля, была ста-
тистически значимо ф < 0,001) выше, чем выживаемость конидий А. tenuissima (табл.).
Различия между прорастанием конидий А. tenuissima К22 и G. pannorum ВКМ F-4777D
в разных вариантах эксперимента
Вариант защитной среды Различие Статистическая значимость различий
раз процентных пунктов p двустороннее p одностороннее
Контроль без лиопротекторов 1,08 6,1 0,1320 0,0691
Среда Файбича 1,25 18,9 < 0,0001 < 0,0001
Среда Файбича с аскорбиновой кислотой 6,16 37,2 < 0,0001 < 0,0001
Пептон-сахарозо-глицериновая среда 1,14 11,0 0,0005 0,0003
Таким образом, А. tenuissima К22 и в. Раппогит ВКМ F-4777D при лиофилизации продемонстрировали хорошую выживаемость конидий, которая даже без использования защитных сред сохраняется на уровне, вполне достаточном для практического использования лиофилизирован-ных культур при хранении этих штаммов.
Заключение
1. Оба изученных штамма демонстрируют высокую (75,9 % у А. tenuissima К22 и 82,0 % у в. раппогит ВКМ F-4777D) жизнеспособность конидий после лиофилизации без использования защитных сред.
2. Защитные среды не оказывают статистически значимого влияния на выживаемость конидий А. tenuissima К22 и статистически значимо повышают выживаемость конидий в. Раппогит ВКМ F-4777D (в 1,16 раза при использовании среды Файбича и в 1,07 раза при использовании пептон-сахарозо-глицериновой среды).
3. Введение в среду Файбича аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта ведет к значительному снижению доли выживших при лиофилизации конидий (в 10,61 раза у А. tenuissima К22 и в 2,15 раза у в. раппогит ВКМ F-4777D).
4. На основе полученных результатов можно рекомендовать проведение лиофилизации конидий А. tenuissima К22 без использования защитных сред, а лиофилизацию конидий в. Раппогит ВКМ F-4777D - с использованием защитной среды Файбича либо без использования защитных сред.
Список источников
1. De Souza P.M. Application of microbial a-amy-lase in industry - A review // Brazilian Journal of Microbiology. 2010. № 4. P. 850-861.
2. Effects of dietary amylase and sucrose on productivity of cows fed low-starch diets / C.F. Vargas-Rodriguez [et al.] // J. Dairy Sci. 2014. 97(7). P. 4464-4470.
3. Cowieson A.J., Vieira S.L., Stefanello C. Exogenous microbial amylase in the diets of poultry: what do we know? // J. Appl. Poult. Res. 2019. 28 (3). P. 556-565.
4. Shafique S., Bajwa R., Shafique S. Alpha-amylase production by toxigenic fungi // Natural Product Research. 2010. 24(15). P. 14491456.
5. Abd A.A., Mostafa, F. Production and Characterization of Fungal a-Amylase from Marine Alternata Utilizing Lignocellulosic Wastes and Its Application // Res. J. Pharm., Biol. Chem. Sci. 2015. 6. P. 813-825.
6. Production of Glucoamylase from Novel Strain of Alternaria Alternata under Solid State Fermentation / D.E. Nayab [et al.] // BioMed Research International. 2022. P. 9. DOI: 10.1155/ 2022/2943790.
7. Хижняк С.В., Пампуха В.Т. Микробные сообщества карстовых пещер как потенциальный источник продуцентов низкотемпературных амилаз // Вестник Омского государственного аграрного университета. 2016. № 1 (21). С. 104-110.
8. Влияние температуры на скорость роста амилолитических штаммов Geomyces pannorum / С.В. Хижняк [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2018. № 1 (136). С. 214-221.
9. Adams J. The principles of freeze-drying // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 15-38. DOI: 10.1007/978-1 -59745-362-2_2.
10. Stacey J.N., Day J. Long-term ex-situ conservation of biological resources and the role of biological resource centers // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 1-14. DOI: 10.1007/ 978-1 -59745-362-2_1.
11. Гоачева И.В., Осин А.В. Механизмы повреждений бактерий при лиофилизации и протек-тивное действие защитных сред // Проблемы особо опасных инфекций. 2016. № 3. С. 5-12. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-3-5-12.
12. Пат. RU 2736223 C1. Психротолерантный штамм мицелиального гриба Geomyces pannorum ВКМ F-4777D - продуцент а-амилазы / С.В. Хижняк [и др.]; патентообладатель Красноярский ГАУ. № 2018137887. Заявл. 26.10.2018, опубл. 12.11.2020, Бюл. № 32.
13. Impact of the fermentation parameters pH and temperature on stress resilience of Lactobacillus reuteri DSM 17938 / A. Hernandez [et al.] // AMB Expr. 2019. Vol. 9. № 66. DOI: 10.1186/ s13568-019-0789-2.
14. Optimization of protective agents for the freeze-drying of Paenibacillus polymyxa Kp10 as a potential biofungicide / H.S. Nasran [et al.] // Molecules. 2020. № Vol. 25. № 11. DOI: 10.3390/molecules25112618.
15. Файбич М.М. Стабилизация вакцинных препаратов в процессе высушивания и хранения // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1968. № 2. С. 59-66.
16. Стандартная операционная процедура по лиофилизации культур ВКМ с использованием разных режимов первичной и вторичной сушки / сост. С.М. Озерская, Е.О. Пучков, Н.Е. Иванушкина. Пущино, 2011.
17. Охапкина В.Ю. Методы поддержания микробных культур. Ч. 2. Лиофилизация // Теоретическая и прикладная экология. 2009. № 4. С. 21-32.
References
1. De Souza P.M. Application of microbial a-amy-lase in industry - A review // Brazilian Journal of Microbiology. 2010. № 4. P. 850-861.
2. Effects of dietary amylase and sucrose on productivity of cows fed low-starch diets / C.F. Vargas-Rodriguez [et al.] // J. Dairy Sci. 2014. 97(7). P. 4464-4470.
3. Cowieson A.J., Vieira S.L., Stefanello C. Exogenous microbial amylase in the diets of poultry: what do we know? // J. Appl. Poult. Res. 2019. 28 (3). P. 556-565.
4. Shafique S., Bajwa R., Shafique S. Alpha-amylase production by toxigenic fungi // Natural Product Research. 2010. 24(15). P. 14491456.
6. Abd A.A., Mostafa, F. Production and Characterization of Fungal a-Amylase from Marine Alternata Utilizing Lignocellulosic Wastes and Its Application // Res. J. Pharm., Biol. Chem. Sci. 2015. 6. P. 813-825.
6. Production of Glucoamylase from Novel Strain of Alternaria Alternata under Solid State Fermentation / D.E. Nayab [et al.] // BioMed Research International. 2022. P. 9. DOI: 10.1155/ 2022/2943790.
7. Hizhnyak S.V., Pampuha V.T. Mikrobnye soobschestva karstovyh pescher kak poten-cial'nyj istochnik producentov nizkotempe-raturnyh amilaz // Vestnik Omskogo gosudar-stvennogo agrarnogo universiteta. 2016. № 1 (21). S. 104-110.
8. Vliyanie temperatury na skorost' rosta amilo-liticheskih shtammov Geomyces pannorum / S.V. Hizhnyak[i dr.] // Vestnik KrasGAU. 2018. № 1 (136). S. 214-221.
9. Adams J. The principles of freeze-drying // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 15-38. DOI: 10.1007/978-1 -59745-362-2_2.
10. Stacey J.N., Day J. Long-term ex-situ conservation of biological resources and the role of biological resource centers // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 368. P. 1-14. DOI: 10.1007/ 978-1 -59745-362-2_1.
11. Gracheva I.V., Osin A.V. Mehanizmy povrezh-denij bakterij pri liofilizacii i protektivnoe dejstvie zaschitnyh sred // Problemy osobo opasnyh
infekcij. 2016. № 3. S. 5-12. DOI: 10.21055/ 0370-1069-2016-3-5-12.
12. Pat. RU 2736223 C1. Psihrotolerantnyj shtamm micelial'nogo griba Geomyces pannorum VKM F-4777D - producent a-amilazy / S.V. Hizhnyak [i dr.]; patentoobladatel' Krasnoyarskij GAU. № 2018137887. Zayavl. 26.10.2018, opubl. 12.11.2020, Byul. № 32.
13. Impact of the fermentation parameters pH and temperature on stress resilience of Lactobacillus reuteri DSM 17938 / A. Hernandez [et al.] // AMB Expr. 2019. Vol. 9. № 66. DOI: 10.1186/ s13568-019-0789-2.
14. Optimization of protective agents for the freeze-drying of Paenibacillus polymyxa Kp10 as a potential biofungicide / H.S. Nasran
[et al.] // Molecules. 2020. № Vol. 25. № 11. DOI: 10.3390/molecules25112618.
15. Fajbich M.M. Stabilizaciya vakcinnyh pre-paratov v processe vysushivaniya i hraneniya // Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immune-logii. 1968. № 2. S. 59-66.
16. Standartnaya operacionnaya procedura po liofilizacii kul'tur VKM s ispol'zovaniem raznyh rezhimov pervichnoj i vtorichnoj sushki / sost. S.M. Ozerskaya, E.O. Puchkov, N.E. Ivanush-kina. Puschino, 2011.
17. Ohapkina V.Yu. Metody podderzhaniya mik-robnyh kul'tur. Ch. 2. Liofilizaciya // Teoreti-cheskaya i prikladnaya 'ekologiya. 2009. № 4. S. 21-32.
Статья принята к публикации 20.12.2022 / The article accepted for publication 20.12.2022. Информация об авторах:
Софья Владимировна Овсянкина1, заведующая межкафедральной научно-инновационной лабораторией сельскохозяйственной и экологической биотехнологии ИАЭТ, кандидат биологических наук Сергей Витальевич Хижняк2, профессор кафедры экологии и природопользования, доктор биологических наук, доцент
Полина Александровна Аболенцева3, научный сотрудник лаборатории селекции и оригинального семеноводства
Яна Викторовна Смольникова4, доцент кафедры технологии консервирования и пищевой биотехнологии, кандидат технических наук
Елена Николаевна Олейникова5, главный специалист управления науки и инновациями Information about the authors:
Sofia Vladimirovna Ovsyankina1, Head of the Interdepartmental Scientific and Innovation Laboratory of Agricultural and Environmental Biotechnology of the IAET, Candidate of Biological Sciences Sergey Vitalievich Khizhnyak2, Professor at the Department of Ecology and Nature Management, Doctor of Biological Sciences, Associate Professor
Polina Alexandrovna Abolentseva3, Researcher, Laboratory of Breeding and Original Seed Production Yana Viktorovna Smolnikova4, Associate Professor at the Department of Canning Technology and Food Biotechnology, Candidate of Technical Sciences
Elena Nikolaevna Oleinikova5, Chief Specialist at Science and Innovation Department
