CC BY
20Органический синтез и биотехнология
УДК 5
Evgeniy P. Studentsov, Olga V. Neporoghneva, Anna A. Golovina, Natalya I. Novikova, Viktorya V. Orlovskaja, Stanislav M. Ramsh
ELABORATION OF THE TECHNOLOGY FOR PRERARATION OF SYNTHETIC D-LUCIFERINE AND ITS CORE INTERMEDIATES (review)
St Petersburg State Institute of Technology (Technical University), Moskovsky Pr., 26, St Petersburg, 190013, Russia Bechtereva Institute of Human Brain RAS, st. Akad. Pavlov, 9 St. Petersburg, 197376, Russia e-mail: dens36@mail.ru
Synthetic D-luciferin is used in bioluminescent detection of adenosine-5'-triphosphate in different biological objects. The technological process of preparation of D-luciferin was improved, including synthesis of core benzothiazole intermediates. Its physico-chemical properties were investigated. The process of asymmetric transformation of L-thiazolidine-4-carboxylic acid and 2,2-dimethylthiazolidine-4-carboxylic acid to D- and L-cysteines under the action of D- and L-tartaric acids was studied. D-luciferin was prepared in large amounts and with high yields by condensation of 2-cyano-6-hydroxy-benzothiazole with D-cysteine. The structure of the goal compounds and core intermediates was proved by independent synthesis and confirmed by analytical, spectral (NMR, IR, UV, CD spectra), and chromatographic data.
Keywords: D-luciferin, bioluminescence, adenosine-5'-tri-phosphate, benzothiazoles, preparation technology, race-mization, thiazolidine-4-carboxylic acid, D-cysteine, physico-chemical properties, spectra
.58.54
Е.П. Студенцов1, О.В. Непорожнева2, А.А. Головина3, Н.И. Новикова4, В.В. Орловская5, С.М. Рамш6
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО D-ЛЮЦИФЕРИНА И КЛЮЧЕВЫХ ПОЛУПРОДУКТОВ ЕГО СИНТЕЗА (обзор)
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр., 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия
Институт мозга РАН им. Н.П. Бехтеревой, ул. Акад. Павлова, 9, Санкт-Петербург, 197376, Россия е-mail: dens36@mail.ru
D-Люциферин находит применение при биолюминесцентном определении аденозин-5'-трифосфата в различных биологических объектах. Усовершенствован технологический процесс получения D-люциферина, включая синтез ключевых бензотиазольных полупродуктов. Изучены физико-химические свойства этих полупродуктов. Исследован процесс асимметрической трансформации L-тиазолидин-4-карбоновой кислоты и 2,2-диметилтиазолидин-4-карбоно-вой кислоты в D- и L-цистеины под действием D- и L-винных кислот. Конденсацией 2-циано-6-гидроксибензотиазола с D-цистеином в значительном количестве и с высоким выходом получен D-люциферин. Строение целевых соединений и ключевых полупродуктов доказано независимыми синтезами и подтверждено аналитическими, спектральными (ЯМР-, ИК-, УФ-, КД-спектры) и хроматографическими данными.
Ключевые слова: D-люциферин, биолюминесценция, аденозин-5'-трифосфат, бензотиазолы, технология получения, рацемизация, тиазолидин-4-карбоновые кислоты, D-цистеин, физико-химические свойства, спектры
DOI: 10.15217/issn1998984-9.2016.34.49
D-Люциферин и его биоаналитическое применение
D-Люциферин (Luciferin, free acid, D-2-(6-гидроксибензотиазол-2-ил)-4,5-дигидротиазол-4-карбоновая кислота) является основным субстратом при
биолюминесцентном определении ультраследовых количеств аденозин-5'-трифосфата (АТФ) в клетках и различных биологических объектах. Биолюминесценция связана с фундаментальными процессами жизни, в ее основе лежит окисление субстратов - различных люциферинов энзимом люциферазой при участии специфических кофакторов (Мд-АТФ, НАД) [1-4]. Люцифераза светляков
1 Студенцов Евгений Павлович, канд. хим. наук, вед. науч. сотр., каф. химии и технологии синтетических биологически активных веществ, e-mail: dens36@mail.ru
Evgeniy P. Studetsov, PhD (Chem.), leading researcher, Department of Chemistry and Technologyof Synthetic Biologically Active Substances
2 Непорожнева Ольга Владимировна, мл. науч. сотр., каф. химии и технологии синтетических биологически активных веществ е-mail: scarba@list.ru Olga V. Neporozhneva, Junior researcher, Department of Chemistry and Technologyof Synthetic Biologically Active Substances,
3 Головина Анна Александровна инженер, каф. химии и технологии синтетических биологически активных веществ е-mail: annagula@mail.ru Anna A. Golovina, engineer, Department of Chemistry and Technologyof Synthetic Biologically Active Substances, е -mail: nata5ha@yandex.ru
4 Новикова Наталия Ивановна инженер, каф. химии и технологии синтетических биологически активных веществ е -mail: nata5ha@yandex.ru Natalya I. Novikova, engineer, Department of Chemistry and Technologyof Synthetic Biologically Active Substances, е -mail: nata5ha@yandex.ru
5 Орловская Виктория Владимировна, мл. науч. сотр., лаб. радиохимии Института мозга человека им. Н.П. Бехтеревой РАН, ул. Акад. Павлова, 9, Санкт-Петербург, 197376, Россия, e-mail: vikaorl@list.ru
Viktoriya V. Orlovskaya, junior researcher, lab.of radiochemistry of Bekhtereva Institute of Human Brain RAS, st. Akad. Pavlov, 9, 197376, St. Petersburg, Russia
6 Рамш Станислав Михайлович, д-р хим. наук, профессор, зав. каф. химической технологии органических красителей и фототропных соединений СПбГТИ(ТУ), е-mail: sramsh@technolog.edu.ru
Stanislav M. Ramsh, Dr Sci. (Chem.), Professor, Head of Department of Chemical Technology of organic dyes and phototropic compounds Дата поступления - 30 декабря 2015 года
создает сильное свечение в результате АТФ-зависимого окисления О-люциферина молекуляным кислородом, при этом хемилюминесценция пропорциональна концентрации люциферазы (схема 1) [5].
Схема 1
Люциферазы из разных видов светляков и их мутантные формы генерируют биолюминесценцию с максимум поглощения в области от 548 до 620 нм. Кодирующий люциферазу Luc-ген характерен для бактерий, растений, клеток млекопитающих. Поэтому генная экспрессия люциферазы используется для количественного определения АТФ в присутствии люциферина. Биолюминесцентный метод наиболее специфичен и высокочувствителен. Он позволяет определять АТФ в количестве, равном половине всего АТФ в одной бактериальной клетке (до 10-18 моль АТФ). Это открывает возможность создания биолюминесцентных зондов для изучения различных метаболических процессов в живых организмах. Именно поэтому метод биолюминесцентной АТФ-ме-трии (экспресс-анализ в течение нескольких минут) стал основой, так называемой быстрой микробиологии [3, 4]. Ведущими зарубежными фирмами по производству D-люциферина и реагентов для биолюминесцентной АТФ-метрии являются BioThem (Швеция), Molecular Probes (Нидерланды), Promega Biosciences (США). На российском рынке ООО «Люмтек» при МГУ им. Ломоносова является эксклюзивным производителем экоте-стов на токсическое воздействие ксенобиотиков на окружающую среду [6]. Созданы портативные люминометры System Sure Plus для определения АТФ в режиме online тест-системы для экспресс- контроля микробных загрязнений, для санитарно-эпидемиологического контроля и мониторинга экологической обстановки. В состав АТФ-реагента входят высокой чистоты D-люциферин, рекомбинатная люцифераза и АТФ. Для измерения АТФ достаточно добавить буферный раствор, и биолюминесцентный анализ можно проводить даже в полевых условиях в течение нескольких минут.
В настоящее время биолюминесцентная АТФ-ме-трия широко используется за рубежом и в нашей стране в медицинских исследованиях при оценке жизнеспособности эритроцитов при консервировании крови, обнаружении микробных инфекций в моче и крови, контроле качества вакцин на основе живых бактериальных препаратов, подборе эффективной дозы антибиотиков, пригодности донорных материалов при трансплантации и оценке иммунного статуса, а также при выявлении патологий в органах и тканях человека. АТФ-анализ находит применение в фармацевтической и пищевой промышленности на всех стадиях производства лекарств и пищевых продуктов. Особая роль отводится биотехнологии и генной инженерии при определении активности штаммов продуцентов [1].
Впервые в чистом виде D-люциферин был выделен в 1957 Битлером и Макелроем из 1500 американских светляков. Было получено около 9 мг чистого люцифери-на для рентгеноструктурного анализа и доказательства тонкой молекулярной структуры [7].
Краткое сообщение о химическом синтезе D-люциферина было опубликовано Селигером и со-
авторами в 1961 г. [8]. В 1963 г. Вайт представил полное описание способа получения О-люциферина [9, 10]. Синтетический О-люциферин по физико-химическим характеристикам (включая данные рентгеноструктурного анализа и оптической активности) был тождественен природному О-люциферину [8].
Синтетический О-люциферин и полупродукты его синтеза пользуются большим спросом, несмотря на относительно высокую стоимость: цена 1 г субстанции О-люциферин (99 %) - более 1000 $. Данная работа направлена на создание отечественной технологии получения синтетического О-люциферина из доступного сырья на основе детального изучения альтернативных, большей частью запатентованных, способов получения О-люциферина и его производных [11-19]. В русле общей тенденции на импортозамещение актуальность ее не вызывает сомнений.
Опубликованные методы получения
О-люциферина малопроизводительны, трудоемки, включают использование токсичных реагентов (цианидов металлов, сероводорода), горючих растворителей, а также хроматографических способов очистки промежуточных продуктов, что на практике ограничивает их применение в укрупненном лабораторном (полупромышленном) масштабе. Особые требования предъявляются к качеству О-люциферина, отсутствию в нем примесей ингибиторов люциферазы.
Известные подходы к получению О-люциферина заключаются в основном в синтезе подходящего бензоти-азольного производного с последующей его конденсацией с О-цистеином с образованием дополнительного тиа-зольного кольца (схема 2).
Схема 2
Альтернативные способы получения и физико-химические свойства ключевых бензотиазольных полупродуктов синтеза О-люциферина
Литературные данные. Способы получения ключевых полупродуктов синтеза О-люциферина - 2-циа-но-6-метоксибензотиазола и 2-циано-6-гидроксибензоти-азола - представлены на схеме 3.
Метод 1 был использован в первых химических синтезах Вайтом [10], где 2-циано-6-гидроксибензотиазол получали из п-анизидина (1). При этом п-анизидин сначала конденсировали с диэтилоксалатом (2) с образованием этил^-(4-метоксифенил)оксамата (3), который затем превращали в метокситиооксаниламид (4) действием пентасульфида фосфора в кипящем ксилоле. Образовавшийся тиоамид гидролизовали без выделения до N-(4-метоксифенил)тиооксамовой кислоты (5). Окислительная гетероциклизация 5 щелочным раствором феррициа-нида калия приводила к термически неустойчивой 6-ме-токсибензотиазолкарбоновой кислоте (6), которая легко декарбоксилируется до соответствующего 6-метоксибен-зотиазола [20]. Обработка кислоты (6) при охлаждении в большом количестве абсолютного метанола хлористым водородом или диазометаном в эфире давала метиловый эфир (7), который путем аммонолиза газообразным аммиаком превращали в 6-метоксибензотиазол-2-карбок-самид (8).
Дегидратация амида 8 хлорокисью фосфора давала 2-циано-6-метоксибензотиазол (9). Определенные трудности возникали на следующей стадии деметилиро-вания 9 в 10, так как нитрильная группа в этих соединениях достаточно реакционноспособна, и попытки селектив-
ного удаления метильной группы приводили к побочным реакциям с расщеплением тиазольного цикла. Установлено, что гидрохлорид пиридина является наиболее подходящим реагентом для деметилирования 9, когда были получены с удовлетворительным выходом миллиграммовые количества 2-циано-6-гидроксибензотиазола (10). В последних двух стадиях требовалась хроматографи-ческая очистка 9 и 10. Конденсация очищенного 10 с О-цистеином (11) протекала в водном метаноле с защитой от кислорода воздуха и света и приводила к образованию небольшого количества О-люциферина (12), который по молекулярной и электронной структуре отвечал природному соединению, с суммарным выходом 5,8 % (в расчете на 8 стадий).
По методу 2 (Сето с сотр., 1963 г.) [21] необхо-
димо предварительное получение труднодоступного реагента - (карбамоилтиокарбонилтио)уксусной кислоты (13) взаимодействием трихлорацетамида с большим избытком сероводорода и монохлоруксусной кислотой в щелочной среде. Неустойчивый 13 сразу использовали для получения 4-метокситиооксаниламида (4) путем добавления раствора п-анизидина в водном этаноле. Дальнейший путь синтеза протекает, как описано Вайтом [8]. По заключению самих авторов этот метод малопригоден для получения значительных количеств 13 вследствие использования больших количеств сероводорода, выделения летучих цианидов, проведения деметилирования (9) в запаянных трубках. Это отмечал и Боуви [22] при усовершенствовании метода, несмотря на увеличение выхода О-люциферина (12) до 18 % [21].
Схема 3. Альтернативные методы получения D-люциферина, описанные в литературе.
Примечания:
метод 1 - 8-стадийный из п-анизидина (впервые осуществлен White с сотр. в 1963 г. с общим выходом 5,8%) [10]; метод 2 - 5-стадийный из (карбамоилтиокарбонилтио)уксусной кислоты (Seto с сотр. в 1963 г., 15%) [21];
метод 3 - 4-стадийный из 2-амино-6-метоксибензотиазола (усовершенствованный синтез Bowie с сотр. в 1965г.) [22], 18%; Suzaki [24], 15%. метод 4 - 3-стадийный из 2-амино-6-метоксибензотиазола (Toya с сотр. в 1992 г., 22%) [25].
В 1965 г. способ получения D-люциферина был несколько упрощен Вайтом (метод 3) [23] (схема 3) путем получения 2-хлор-6-метоксибензотиазола (15) диа-зотированием 2-амино-6-метоксибензотиазола (14) в соляной кислоте в присутствии меди. В свою очередь (14) получался взаимодействием п-анизидина с роданидом калия в присутствии брома. Однако, при действии на (15) избытком KCN в диметилсульфоксиде (в 100-кратном количестве, 140 °С, 24 ч) требуемый нитрил (9) из-за трудности его выделения получался с низким выходом (12-15 %) в миллиграммовых количествах после хроматографи-ческой очистки, что чрезвычайно мало с учетом необходимости его последующего деметилирования до (10) и превращения в D-люциферин (12). Некоторое упрощение процедуры синтеза нитрила (9) было достигнуто путем проведения реакции (15) с цианидами щелочных металлов в полиэтиленгликоле (проявляет свойства краунэфи-ров), что позволило сократить реакцию до 5-10 ч при 110 °С и вдвое увеличить выход 9, но описанная методика также пригодна лишь для получения микроколичеств целевого 10, так как продукт выделялся с помощью ТСХ [24].
В методе 4 [25] (схема 3) определены условия реакции, позволяющие получать 9 в одну стадию из 14 по реакции Зандмейера. Учитывая, что амин 14 име-
ет плохую растворимость в разбавленной соляной кислоте, авторы применяли смешанный растворитель (серная кислота - уксусная кислота - муравьиная кислота) и диазотировали амин (14) нитритом натрия при 0 °С (при этом наблюдалось образование побочных продуктов). Раствор диазониевой соли (14) добавляли без очистки к смеси цианидного комплекса (3 эквивалента цианида меди в водном растворе цианида калия), который брали в значительном избытке. Известно, что на состав и выход продукта реакции Зандмейера сильно влияет рН раствора. В данном случае выход нитрила (9) увеличивался при использовании ацетатного или бикарбонатного буфера, а без добавления основания продукт (9) практически не образовывался, несмотря на те же условия реакции. Максимального (41 %) выхода 9 удалось достичь при использовании 12 эквивалентов цианидного комплекса по отношению к исходному 14 и в качестве буфера - бикарбоната натрия. Образующийся нитрил (9) тщательно экстрагировали в аппарате Сокслета большим количеством серного эфира (на 3 г нитрила более 1 л эфира), и далее сырой продукт подвергали хроматографической очистке на колонке с силикагелем с рехроматографировани-ем на окиси алюминия, так как побочно образовывались 6-метоксибензотиазол и ряд других неидентифицирован-
ных примесей. Выход очищенного нитрила (9) в лучшем случае не превышал 32 %. Существенным недостатком этого метода также является ограничение количества (от 100 мг до 9 г) исходного амина (14), так как при увеличении его загрузки выход 9 снижался из-за увеличения количеств побочных продуктов. Расчеты показывают, что для получения 100 г нитрила (9) необходимо около 30 л эфира и 3 кг цианидов калия и меди, а также постановка 30 опытов (максимум по 10 г амина) с хроматографической очисткой.
Таким образом, анализ известных методов получения О-люциферина показал, что их общими «узкими местами» являются синтезы 2-циано-6-метоксибензотиа-зола (9) и 2-циано-6-гидроксибензотиазола (10).
Собственный эксперимент. Мы модифицировали технологию получения О-люциферина путем упрощения и сокращения отдельных стадий в методе Вайта [9] в соответствии со схемой 4, что в итоге повысило выход продукта и решило проблему утилизации отходов производства при масштабировании процесса.
на термически устойчивая натриевая соль тиооксанило-вой кислоты, которая в условиях, описанных Вайтом [9], была превращена в 6-метоксибензотиазол-2-карбоновую кислоту (6) с выходом 75 %. Аммонолиз 7 в метаноле (65 °С, 6 ч) приводил с почти количественным выходом к 8 (см. схему 3).
В обоих случаях была решена проблема дегазации серасодержащих веществ с запахом меркаптана при получении больших количеств тиооксаниламида 4 и 6-ме-токсибензотиазол-2-карбоновой кислоты (6). Установлено, что отходы могут быть продегазированы окислителями, например, добавлением 5-10 % бихромата калия или более дешевого технического феррицианида калия. Для этой цели мы с успехом использовали щелочные растворы феррицианида калия со второй стадии процесса - окислительной циклизации 4 в 6-метоксибензотиа-зол-2-карбоксамид (8), при этом дегазацию осуществляли смешением обоих маточных растворов в соотношении 1 : 2 и выдержкой смеси в течение нескольких дней до исчезновения запаха меркаптана.
При масштабировании процесса потребовалось провести более тщательное изучение окислительной циклизации 4-метокситиооксаниламида (4) в меток-сибензотиазол-2-карбоксамид (8) действием К3ре(С^6] в щелочных растворах по классическому методу Якобсона. Установлено, что кроме 2-карбамоилбензотиазола на этой стадии в качестве побочного продукта образуется ^^-бис(4-метоксифенил)оксамид (см. схему 4) и другие неидентифицированные примеси. Минимизировать образование побочных веществ удалось в результате подбора точного соотношения исходных реагентов и условий реакции. По данным ЯМР 1Н спектроскопии и хроматографии лучшие результаты достигнуты при проведении реакции окислительной циклизации 4 при 0 °С в течение 1-1,5 ч при мольном соотношении тиооксаниламид : гидроксид натрия : феррицианид калия 1 : 40 : 3.8 в разбавленном (7-10 %) водно-щелочном растворе в инертной атмосфере. Выход амида 8 достигал 85 %. При этом он выделялся в чистом виде кристаллизацией непосредственно из реакционной массы. По мере циклизации 4 в амид (8) сигналы ароматических протонов (два дублета) при 6,95 и 7,97 м.д. сливаются в мультиплет при 7,13-8,14 м.д. (таблица 1), сигнал метоксигруппы смещается в более слабое поле, а сигнал NH-протонов исчезает.
Таблица 1. Физико-химические характеристики О-люцефирина и ключевых промежуточных продуктов его синтеза
Схема 4
Наработка значительных количеств 4-метокси-фенилтиооксаниламида (4) была осуществлена путем взаимодействия п-анизидина с хлорацетамидом и серой в присутствии триэтиламина по методу Яровенко и Кра-юшкина с сотр. [26]. Для успешного проведения реакции необходимо предварительно приготовить раствор п-а-низидина, серы и триэтиламина в диметилацетамиде, к которому затем прибавляется хлорацетамид при температуре не выше 60 °С в течение 2 ч. При таком порядке смешения реагентов за одну загрузку в 1 литровом реакторе можно получить до 200 г тиоксаниламида (4). Соединение 4 не требует дальнейшей очистки, так как оно хроматографически однородно и по данным ЯМР 1Н и масс-спектров отвечает приписываемой структуре: ЯМР, ДМСО-De, 5, м. д.: 3,78 (3Н, с, ОСНз), 6,95 (2Н, д, арил), 7,97 (2Н, д, арил), 8,08 (2Н, с, NH2), 11,90 (1Н, уш. с, NH); MS, m/z: 210 (M+).
При щелочном гидролизе 4 следует отметить другой улучшенный нами способ получения 6-метокси-бензотиазол-2-карбоксамида (8) и его полупродуктов (6, 7). При щелочном гидролизе 4 (48 ч, 20 °С) была получе-
Соединение Т. пл., °С ТСХа, Rf, (система) УФ-спектр, ^макс (lg £), метанол ИК-спектр, (KBr), см-1 Масс-спектр (m/z) ЯМР 1Н, ДМСО^6, 5, м. д.
6-Меток-си-бензоти-азол-2-кар- боновая кислота (6) 105108 (разл.) 0,49 (ацетон-гексан 3 : 1) 260 (3,86) 312 (4,06) 1700 1687 (V С=О) 3,79 (3Н, с, ОСН3), 7,21 (1Н, с, Ar), 7,69 (1Н, д, Ar), 7,92 (1Н, A, Ar)
2-Карбок-си-6-меток-си-бензотиа-зол (7) 142143 0,60 (ацетон-гексан 1 : 2) 263 (3,85) 320 (4,20) 1695 1705 (V С=О) 3,89 (3Н, с, ОСН3), 4,00 (3Н, с, СОСН3), 7,19 (1Н, с, Ar), 7,70 (1Н, с, Ar), 8,04 (1Н, д, Ar)
6-Меток-си-бензотиа-зол-2-карбок-самид (8) 258260 0,39 (ацетон-гексан 3 : 1) 258 (3,89) 312 (4,15) 3300, 3200, 1689, 1661 208 (М+) 3,87 (3H, с, OCH3), 7,13 (1Н, д, Ar), 7,62 (1Н, c, Ar), 7,80 (2Н, д, NH2), 8,14 (1Н, с, Ar)
2-Циа-но-6-меток-си-бензотиа-зол (9) 129131 0,65 (ацетон-гексан 1:2) 263 (3,92) 320 (4,26) 2240 (V С=Ы) 1590, 1470, 1430, 1260, 810 190 (М+) 3,91 (3H, с, OCH3), 7,14 (1Н, д, Ar), 7,60 (1Н, c, Ar), 8,00 (1Н, с, Ar)
2-Циано-6-ги-дрокси-бен-зотиазол (И)6 212215 0,41 (ацетон-гексан 1 : 2) 262 (3,87) 322 (4,28) 3230, 2225 (V С=Ы) 176 (М+) 7,17 (1Н, д, Ar), 7,52 (1Н, c, Ar), 8,00 (1Н, с, Ar), 10,42 (1Н, с, ОН)
D-Люцифе-рин (12)бв 198200 (разл.) 0,45 (хлороформ-метанол 5 : 1) 269 (3,87) 329 (4,25) 1710г (V С=О) 280 (М+) 3,70-3,82 (2H, м, CH2), 5,38 (1Н, с, СН), 7,07 (1Н, д, д, Ar), 7,42 (1Н, c, Ar) 7,96 (1Н, д, Ar), 10,34 (1Н, с, ОН)
Примечание: а) Merck Kieselgel 60 UV-254.
б) ВЭЖХ - SiÜ2 (0.1% CF3COOH / CH3CN, УФ-детекция 330 нм); содержание основного вещества, %: 11 - 98.5%, 12 - 99.0%.
в) Вода по Фишеру: 12 - не более 0.5%.
г) ИК-спектр D-люциферина, KBr, см-1: 3347,1710,1613,1568,1501, 1434, 1353, 1319, 1303, 1277, 1256, 1216, 1203, 1038, 884, 662
Установлено, что при сокращении объема воды, т. е. с увеличением концентрации щелочи, окислительная циклизация протекает с низким выходом амида 8. При этом мы впервые обнаружили образование по неустановленному механизму в ходе окислительной циклизации значительных количеств побочного ^^-бис(4-метоксифенил)оксамида, который с трудом отделяется от целевого амида (8). Существенным моментом успешного синтеза 8 является прибавление щелочного раствора 4 к раствору феррицианида калия, поскольку при обратном порядке смешения реагентов выход 8 снижается, а количество ^^-бис(4-метоксифенил)оксамида возрастает. Соотношение 8 и побочного оксамида определяли по спектрам ЯМР 1Н интегрированием пиков метоксигрупп в области 3,75-3,86 м.д. и по появлению сигнала протона NH-группы оксамида при 10,56 м.д. Конденсацией диме-тилоксалата с п-анизидином осуществлен независимый синтез референтного образца ^^-бис(4-метоксифенил) оксамида, ЯМР 1Н спектр которого оказался тождественен спектру побочного продукта и имел следующие значения химических сдвигов протонов, м. д.: 3,76 (6Н, с, 2ОСНз), 6,91 (4Н, д, арил), 7,75 (4Н, д, арил), 10,56 (2Н, уш. с, NH). Масс-спектр побочного продукта также соответствовал его предполагаемому строению: m/z 300 (M+).
Практически этот метод позволяет реализовать альтернативный путь синтеза представ-
ленный на схеме 3.
Оптимизировано также получение нитрила (9) при больших загрузках амида (8): во избежание осмоле-ния реакционной массы процесс ведут путем кратковременного, не более 30 мин, кипячения при 110 °С с 16-кратным молярным избытком хлорокиси фосфора. При этом избыток POCl3 регенерируется отгонкой в вакууме при 15-20 мм и температуре не выше 60-70 °С. Полученный кристаллический продукт после обработки на холоду (во избежание гидролиза) водным раствором карбоната натрия растворяли в хлороформе, раствор сушили сульфатом натрия и подвергали флеш-хроматографии на кислой окиси алюминия. Выход хроматографически чистого нитрила (9) составлял 75 %. Таким образом, суммарный выход нитрила (9) в виде бесцветных кристаллов достигал 50 %, что в 2-2.5 раза превышает выходы в перечисленных выше литературных методиках.
Особые требования при синтезе D-люциферина предъявляются к технологии получения 6-гидроксибензо-тиазола высокой чистоты селективным деметилировани-ем 6-метоксибензотиазола. Нами исследовано применение в этой реакции гидрохлорида пиридина, галогенидов
алюминия и триметилйодсилана, наиболее часто используемых в подобных реакциях [27]. При этом учитывалась реакционная способность цианогруппы и устойчивость тиазольного кольца в присутствии указанных реагентов.
При использовании гидрохлорида пиридина [9] процесс деметилирования 9 необходимо проводить в расплаве большого избытка реагента в узком диапазоне температуры 200-205 °С в течение 2-3 ч в инертной атмосфере с хроматографическим мониторингом процесса во избежание образования побочных веществ и осмоле-ния продукта, особенно при больших загрузках исходных веществ. Технологически мы совместили процессы получения и тщательной сушки гидрохлорида пиридина с реакцией деметилирования нитрила (9) в специальном кварцевом реакторе, снабженном высоким дефлегматором с отводом выделяющегося хлористого метила и устройством для удаления легко возгоняющегося гидрохлорида пиридина. Несмотря на эти нововведения, загрузка исходного вещества 9 не превышала 25 г, так как необходимое количество деметилирующего реагента должно быть в 15-20 раз больше. Кроме того, для выделения 6-гидрокси-2-цианобензотиазола (10) необходимо переносить плав в горячем виде (во избежание затвердевания) в большую открытую емкость, где проводится нейтрализация содой с интенсивным выделением углекислого газа и сильным пенообразованием. Максимальный выход 10 после последовательной обработки бензолом, метиловым спиртом и хроматографической очистки небольшими порциями на колонке с силикагелем составил 60-65 %.
При воспроизведении описанного в литературе деметилировании 9 в 10 2.5^3-мольным избытком триметилйодсилана [12] было подтверждено, что полное отщепление метильной группы при кипячении в безводном хлороформе протекает крайне медленно (более 80 ч), со значительным окрашиванием продуктов реакции и образованием побочных веществ, что требует двукратной кристаллизации продукта из ацетона и хроматографической очистки. Выход очищенного 10 не превышает 52 %.
Для мягкого препаративного деметилирования
9 в 10 технологически более удобным оказалось использование в качестве деметилирующего агента вместо пиридина гидрохлорида бромида алюминия (А1Вгз, 98 %) в соотношении 1-1,5. При нагревании 10 %-ного раствора 9 при 60-80 °С в течение 2-3 ч в сухом дихлорэтане или хлорбензоле (контроль ТСХ, ЯМР 1Н по исчезновению сигнала метоксигруппы 3,60 м.д.). Алюминий бромид легко выделяется из реакционной массы в виде осадка. Последующее отделение примесей солей алюминия от
10 осуществлялось нейтрализацией водным раствором бикарбоната натрия и дополнительной кристаллизацией из водного диоксана. Выход хроматографически и спектрально чистого 10 составил 78-80 %. При этом процесс получения 10 легко масштабируется.
Применение свежевозогнанного хлорида алюминия в аналогичных условиях не имеет преимуществ, так как деметилирование протекает медленнее и с частичным осмолением продуктов; после хроматографической очистки выход 10 не превышает 70 %.
Структура промежуточных соединений (4, 6-10) в синтезе О-люциферина (см. схемы 3 и 4) доказана независимыми синтезами [10, 23], а также подтверждена УФ-, ИК- , масс- и ЯМР 1Н спектрами (таблица 1).
Синтез О-цистеина асимметрической трансформацией тиазолидин-4-карбоновых кислот
Литературные данные. При реализации полной схемы синтеза О-люциферина самостоятельное значение имела сравнительная экспериментальная оценка литературных данных по различным способам получения другого ключевого полупродукта - оптически чистого энантиомера О-цистеина - из относительно более до-
ступных Х-цистеина и О,Х-рацемата цистеина с целью выявления наиболее рационального из этих способов.
Один из первых, но сложных способов превращения Х-цистина в О-цистеин заключался в проведении по-стадийных процессов бензилирования, формилирования Х-цистина с образованием рацемата ^формил^-бензил-цистеина. При последующем разложении бруциновой соли последнего соляной кислотой и кристаллизации продукта был получен оптически чистый стереоизомер S-бензил-О-цистеина. Наконец, на последней стадии осуществлялось восстановление S-бензил-О-цистеина до О-цистеина, который был окислен в О-цистин [28]. При синтезе О-люциферина Вайт применил метод восстановления небольших количеств О-цистина до О-цистеина натрием в жидком аммиаке [23] (см. схему 5).
н
н // неон / Н,0
ь-ш^Лж
• НС1 мн2
пиридин
Схема 6
СООН
1ЧН
Процесс рацемизации оптически активного Х-цистеина (Х-Cys) протекает через образование рацемической 2,2-диметилтиазолидин-4-карбоновой кислоты (О,Х-ДМТ) при кипячении в ацетоне в присутствии уксусной кислоты. Образовавшаяся О,Х-диметилтиазолидин-4-карбоновая кислота легко гидролизуется после добавления воды к реакционной массе с достижением 92 % выхода рацемического О,Х-цистеина (схема 7) [32].
Схема 5
Аналогичные исследования проведены в работе Ширайва с сотр. [29], где разделение О,Х-цистеиновых солей бензолсульфоновой кислоты (ОХ-ВА) и 4-этилбензолсульфоновой кислоты (ОL-4-EB) осуществлялось дробной кристаллизацией смеси из насыщенных водных растворов. Выделение оптически чистых антиподов О- и Х-цистеинов осуществлялось после обработки указанных солей триэтиламином или гидрохлоридом гидроксиламина.
Прекурсорами Х- и О-цистеина могут быть ти-азолидинкарбоновые кислоты, что представляет наибольший интерес. В другой статье Ширайва [30] описано разделение рацемата ОL-тиазолидин-4-карбоновой кислоты (ОL-THC) как такового или в присутствии оптически активных Х-аминокислот дробной кристаллизацией из водных растворов. В результате многочисленных экспериментов удалось найти подходящие условия преимущественной кристаллизации О- или Х-тиазолидинкарбоновой кислоты, с учетом их свободных энергий образования в перенасыщенных растворах (150 %).
В препаративном отношении указанные химические способы получения оптически чистых О и Х-ци-стеинов трудоемки и относительно малоэффективны по сравнению с другими, описанными ниже, способами их получения путем асимметрической трансформации тиазолидин-4-карбоновых кислот и их 2,2-диметил-производных через соли с О- и Х-винными кислотами [31, 32].
Х-Тиазолидин-4-карбоновая кислота (Х-ТНС) получается с высоким выходом по методу Ратнера [33] взаимодействием гидрохлорида Х-цистеина (Х-Cys) с формальдегидом в воде в присутствии пиридина (схема 6).
Схема 7
Собственный эксперимент. Первоначально нами была исследована возможность получения в препаративных количествах оптически чистых стереоизоме-ров путем разделения рацемата ОХ-цистеина с учетом данных работы [34]. При нагревании ОХ-цистеина с формальдегидом в уксусной кислоте (80 °С, 1 ч) с добавлением Х-винной кислоты (Х-ТА) образуются малорастворимая соль О-тиазолидин-4-карбоновой кислоты с Х-винной кислотой (О-ТНСХ-ТА) и растворимая соль Х-тиазолидин-4-карбоновой кислоты с Х-винной кислотой (Х-ТНСХ-ТА) в эквимольном соотношении. Если используется О-винная кислота, то образуются малорастворимая соль Х-ТНСО-ТА и растворимая О-ТНСО-ТА. Одновременно происходит эпимеризация растворимой диастереромерной соли. Соли О-ТНСХ-ТА и Х-ТНСО-ТА распадаются под действием спиртов с образованием соответствующих О- и Х-тиазолидинкарбоновых кислот с выходом 30 %. При взаимодействии О- или Х-тиазолидинкарбоновой кислоты с гидрохлоридом гидроксиламина получается О- или Х-цистеин, соответственно. Выход О-цистеина при использовании Х-винной кислоты составляет около 20 % (см. схему 8).
Схема 8
Этот процесс получения О-цистеина экспериментально исследован нами наиболее тщательно путем
изучения спектров ЯМР 1Н, кругового дихроизма (КД) и удельного вращения промежуточных и конечных продуктов реакции. Данные по стереохимической структуре L-и О-цистеина, производных тиазолидин-4-карбоновых кислот, их молекулярного состава приведены в таблице
2. Эффекты Коттона (отрицательные и положительные), возникающие при определении зависимости разности поглощения света от его круговой поляризации в УФ-спек-трах, позволяют определить конфигурацию оптических изомеров.
Таблица 2. Физико-химические свойства оптически активных цистеинов, тиазолидин-4-карбоновых кислот и их солей с винными кислотами
№ п/п Соединение Т. пл., °С Удельное вращение, [а]о20 (с , р-ль) Эффект Коттона ЯМР-М ДМСО-da, 5, м. д.
1 L-Cys 220 (разл.) -16.5° (1.0, вода) +6.5° (2.5, 5M HCl) положительный при 205 нм 2.93-3.00 (2Н, м, ß-^2),3.97 (1Н, с, а-СН), 8.26 (2Н, м, NH2), 8.75 (2Н, уш. с, SH-СООН)
2 D-Cys 220 (разл.) -6.52° (3.99, 5M HCl) отрицательный при 205 нм 2.93-3.00 (2Н, м, СН2),3.97 (1Н, с, СН), 8.26 (2Н, м, NH2), 8.75 (2Н, уш. с, SH-СООН)
3 L-THC 190 (разл.) -141° (1.0, вода) положительный при 215 нм 2.80 (1Н, д, Н5), 3.10 (1Н, уш. с, Н5), 3.75 (1Н, т, Н4), 4.05 (1Н, д, Н2), 4.30 (1Н, с, Н2), 6.10 (1Н, уш. с, СООН)
4 D-THC 190 (разл.) +141° (1.0, вода) отрицательный при 215 нм 2.80 (1Н, д, Н5), 3.10 (1Н, уш. с, Н5), 3.75 (1Н, т, Н4), 4.05 (1Н, д, Н2), 4.30 (1Н, с, Н2), 6.10 (1Н, уш. с, СООН)
5 L-DMT 134-136 -183° (0.102, ацетон) - 1.74 (6Н, с, 2-СН3), 3.39 (2Н, м, СН2), 3.53 (2Н, м, СН2), 4.81 (1Н, т, NH)
6 L-TA 170-172 -12° (20.0, вода) отрицательный 4.27 (2Н, с, 2СН), 6.07 (1Н, с, ОН), 6.18 (1Н, уш. с, СООН)
7 D-TA 172-174 +12° (20.0, вода) положительный 4.27 (2Н, с, 2СН), 6.07 (1Н, с, ОН), 6.18 (1Н, уш. с, СООН)
8 L-THCD-TA 133-134 -74.0° (0.5, вода) - 2.80 (1Н, уш. с, Н5), 3.10 (1Н, уш. с, Н5), 3.75 (1Н, т, Н4), 4.00 (1Н, д, Н2), 4.23 (1Н, д, Н2), 4.27 (2Н, с)
9 D-THCL-TA 158 (разл.) +73.2° (0.5, вода) - 2.80 (1Н, уш. с, Н5), 3.10 (1Н, уш. с, Н5), 3.75 (1Н, т, Н4), 4.00 (1Н, д, Н2), 4.23 (1Н, д, Н2), 4.27 (2Н, с)
10 L-DMTD-TA 162 (разл.) -81.8° (0.5, метанол) - 1.74 (6Н, с, 2СН3), 3.36 (2Н, м, СН2), 3.51 (2Н, м, СН2), 4.83 (1Н, т, NH), 6.18 (1Н, уш. с, СООН)
11 D-DMTL-TA 170 +81.6° (0.5, метанол) 1.74 (6Н, с, 2СН3), 3.36 (2Н, м, СН2), 3.51 (2Н, м, СН2), 4.83 (1Н, т, NH), 6.18 (1Н, уш. с, СООН)
Примечание
Удельное вращение оптически активных образцов гидрохлоридов моногидратов L- и D-цистеина определено на приборе Perkin Elmer 241 MC. УФ-спектры поглощения записаны на двухлУчевом сканирующем спектрофотометре Specord-M40 (Kare Zeiss). Спектры КД записаны на дихрографе Mark-V (Jobin-Yvon) доцентом СПбГПУА.Н. Скворцовым.
В качестве стандартных образцов использовались L-цистеин гидрохлорид моногидрат (Sigma Ultra, 99% +), D-цистеин гидрохлорид моногидрат (Sigma Ultra, 99% +), L(+)- и D^-винные кислоты (Acros Organics).
В синтезах выделение свободных оснований L- и D-цистеинов из гидрохлоридов осуществлено действием триэтиламином в сухом хлороформе в инертной атмосфере.
В результате наших экспериментов установлено, что таким способом можно проводить трансформацию не только рацемата DL-цистеина, но и оптически чистого L-цистеина в D-цистеин с примерно той же эффективностью (выход 15-20 %). Промежуточная соль D-тиазолидин-4-карбоновой кислоты с L-винной кислотой (D-THOL-TA), образующаяся в результате эпимеризации диастереои-зомера, при дальнейшем раскрытии цикла под действием гидрохлорида гидроксиламина приводит к оптически чистому D-цистеину после перекристаллизации из насыщенных водных растворов. Вместе с тем следует отметить, что асимметрическая трансформация D-цистеина в L-цистеин через образование соли ^-тиазолидин-4-карбоновой кислоты с D-винной кислотой (L-THCD-TA) проходит гладко и с вдвое большим выходом.
Дополнительно исследованы методики асимметрической трансформации соли L-THOL-TA в D-THC в уксусной кислоте в присутствии 0,1 эквивалента салицилового альдегида или при нагревании этой же в избытке пропионовой кислоты. При точном соблюдении условий реакции в первом случае выход D-THC составил 28 %, во втором случае - 60 % после кристаллизации из воды [34].
Оптическая чистота синтезированных нами D- и L-цистеина составляла 98-99 % и совпадала с показателями стандартных фирменных образцов соединений и литературными данными (см. таблицу 2) [31, 32, 34-36].
Лучшие результаты в разделении рацемата D,L-цистеина на антиподы были достигнуты нами путем использования 2,2-диметилтиазолидин-4-карбоновой кислоты (DMT) [32]. При нагревании в течение 6 ч D,L-цистеина c L- или D-TA в ацетоне в обоих случаях с высоким выходом образуются хорошо кристаллизующиеся малорастворимые соли 2,2-диметил-тиазолидин-4-кар-
боновой кислоты. При использовании ^-винной кислоты (^-ТА) получается с выходом 80 % соль О^МТ^-ТА, гидролиз которой водой (в отсутствии гидрохлорида гидрок-силамина) с последующей кристаллизацией из метанола в инертной атмосфере приводит к образованию оптически чистого О-цистеина с 66 % выходом в расчете на исходный ОХ-цистеин (схема 9). В аналогичных условиях из соли ^^МТ-О-ТА получается чистый ^-цистеин.
Схема 9
Интересно отметить, что в методе количественного определения как D-цистеина, так и D-люциферина, в качестве реагента может быть использован предшественник 2-циано-6-гидроксибензотиазол (10), учитывая корреляцию квантовых выходов люциферин-люциферазной реакции [37].
Таким образом, мы установили, что для препаративного синтеза целевого D-цистеина путем асимметрической трансформации 2,2-диметил-4-карбоновая кислота является более предпочтительным интермедиатом, чем тиазолидин-4-карбоновая кислота. По этому способу можно получать десятки грамм D-цистеина, что достаточно для обеспечения масштабного выпуска D-люциферина.
Синтез и физико-химические свойства О-люциферина и его производных
Собственный эксперимент. Последняя стадия получения D-люциферина (12) гладко осуществлялась конденсацией 11 (до 10-15 г) с D-цистеином в би-карбонатном буфере при насыщении чистым аргоном с защитой от света [9, 10]. При подкислении реакционной смеси 2н HCl (0 °С, 1 ч) D-люциферин выпадал в осадок и, после кристаллизации из абсолютного метанола с защитой от кислорода воздуха и света, выделялся хроматогра-фически однородный продукт с выходом до 80 %. Спектр D-люциферина, в отличие от спектра соединения 10, содержит сигналы протонов тиазолидинового цикла в области 3,68-5,35 м.д. ТСХ- и ВЭЖХ-анализы не обнаруживали примесей, а содержание основного вещества составило более 99 %. ИК-спектр синтетического D-люциферина (12) идентичен спектру природного D-люциферина и имеет ряд характеристических полос поглощения при 3347 (NH), 3001 (OH), 1702 (C=O), 1613, 1553, 1558 (арильный и тиазолидиновый циклы) (см. таблицу 1).
D-люциферин представляет собой светло-желтое микрокристаллическое вещество, неустойчивое при нагревании, его невозможно возгонять из-за декар-боксилирования и разложения, он не стабилен по отношению к кислотам, кислороду и свету. Рацемизация D-люциферина быстро протекает в органических растворителях, например, со скоростью 7 %/ч при 4 °С в водном пиридине. D-люциферин устойчив в щелочных растворах, свободных от кислорода, но в тех же растворах, содержащих кислород, он быстро окисляется до деги-дролюциферина (L) [22]. Люциферин (LH2) при обработке разбавленной кислотой быстро разлагается, тогда как дегидролюциферин (L) устойчив к действию горячей концентрированной соляной кислоты. Восстановление де-гидролюциферина (L) (H2-Pd/C или Ni-Ренея) приводит к люциферолу (LOH) [8, 22].
Таким образом, были получены биологически активные структурные аналоги люциферина - дегидролю-циферин (L) и люциферол (LOH).
L LOH
Люциферин - это кислота, и ее натриевые и калиевые соли легко растворяются в водных буферных растворах. Водные стандартные растворы люциферина должны храниться замороженными и с защитой от света в буфере с рН 6,1-6,5 в атмосфере аргона при -20 °С. При более высоких рН люциферин подвержен катализируемой основанием трансформации в дегидролюциферин, а также рацемизации. При правильном хранении (в светонепроницаемой герметичной таре, на холоду (-20 °С) и в инертной атмосфере) сам люциферин, его соли и эфиры стабильны не менее 6 месяцев.
Практическая доступность О-люциферина (О-2-(6-гидроксибензотиазол-2-ил)-4,5-дигидротиазол-4-карбоновая кислота) позволяет получать другие важные биолюминесцентные субстраты: лиофилизированные натриевые и калиевые соли, а также 4- и 6-О-эфиры О-люциферина, где в качестве функционального остатка содержатся алкильные, нитрофенильные, аминокислотные и углеводные заместители. Например, О-люци-ферин-О6-галактозид и Ь-галактозидаза входят в состав диагностического средства, что позволяет повысить каталитическую активность и интенсивность люциферазной реакции при анализе на патогенные токсины [38]. В биохимии различные О-эфиры О-люциферина используются
для определения каталитической активности мутантных форм люциферазы.
Заключение
Синтетический D-люциферин применяется при количественном определении аденозин-5'-трифосфата в различных биологических объектах биолюминесцентным методом. В представленной работе усовершенствован препаративный способ получения D-люциферина, позволяющий нарабатывать его в лабораторном масштабе (десятки грамм); существенной особенностью усовершенствованного способа является высокий выход промежуточных бензотиазольных производных. Изучен процесс асимметрической трансформации Х-цистеина в D-цистеин путем последовательного образования тиазо-лидин-4-карбоновой кислоты или 2,2-диметилтиазолди-дин-4-карбоновой кислоты и солей этих кислот с оптически активными D- и Х-винными кислотами. Установлено, что для наработок D-цистеина в лабораторном масштабе путь через 2,2-диметилтиазолидин-4-карбоновую кислоту является более предпочтительным.
Структура всех синтезированных соединений доказана совокупностью аналитических и спектральных данных (ЯМР-, ИК-, УФ-, КД-спектры).
Литература
1 ZieglerM.M., Baldwin T.O. Methods in Enzymology. // J. Bioluminescence and Chemiluminescence. 2000. V. 305. 720 p.
2. M.A. De Luca Methods in Enzymology. // J. Bioluminescence and Chemiluminescence/ 1978. V. 57. 215 p.
3. Lundovskich I.A., Leontieva O.V., Dementieva E.I., Ugarova N.N. // J. Bioluminescence and Chemiluminescence. Perspectives for 21st Century. 1999. Р. 420.
4. Ugarova N.N., Brovko L. Iu., Kutuzova G.D. Bioluminescence and bioluminescent analysis: development of certain aspects of the problem over the last decade // Biokh-imiia. 1993. V. 58. № 9. P. 1351-1372.
5. White E.H., Rapaport E., Hopkins T.A., Seliger H.H. Chemi- and bioluminescence of firefly luciferin // J. Am. Chem. Soc. 1969. V. 91. № 8. P. 2178-2180.
6. Lomakina G.Y., Modestova Y.A., Ugarova N.N. Bioluminescence Assay for Cell Viability // Biochemistry (Mosc.). 2015. V. 80. № 6. P. 701-713.
7. Bitler B., McElroy W.D. The preparation and properties of crystalline firefly luciferin // Arch. Biochem. Biophys. 1957. V. 72. № 2. P. 358-368.
8. Seliger H.H, McElroy W.D., White E.H., Field G.F. Stereo-specificity and firefly bioluminescence, a comparison of natural and synthetic luciferins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1961. V. 47. P. 1129-1134.
9. White E.H., McCapra F, Field G.F., McElroy W.D. The structure and synthesis of firefly luciferin // J. Am. Chem. Soc. 1961. V. 83. № 10. P. 2402-2403.
10. White E.H., McCapra F., Field C.F. The Structure and Synthesis of Firefly Luciferin // J. Am. Chem. Soc. 1963. V. 85. P. 337-343.
11. McElroy W.D., White E.H. Hydroxybenzothi-azoles and methods of preparing same: пат. US3164613; за-явл. 08.08.1961; опубл.. 05.01.1965.
12. Batz H., Wulff K. Verfahren zur herstellung von luciferin: пат. DE2929115A1. № заявки DE19792929115; за-явл. 18.07.1979.опубл. 12.02.1981
13. Geiger R., Miska W. Derives de d-luciferine et leur utilization: пат. WO W01987002667 A1. № PCT/ EP1986/000615; заявл. 24.10.1986; опубл. 07.05.1987.
14. Batz H., Wulff K. Process for the preparation of luciferin compounds: пат. US4826989. № US 07/095,122; за-явл. 10.09.1987; опубл. 02.05.1989.
15. Okamoto K., Goto T. Luciferin derivatives: пат. US5128069 A. № US 07/496,998; заявл. 21.03.1990; опубл. 07.06.1992.
16. Zomer E., Saul S., Charm S.E. Method of pre-
paring D-luciferin derivatives: пат. US5374534. № US 08/062,315; заявл. 14.05.1993; опубл. 20.12.1994.
17. Dubikovskaya E., Godinat A. Precursor molecule for the synthesis of d-luciferin: пат. W02014057139 A2. № PCT/EP2013/071448; заявл. 14.10.2013; опубл. 17.04.2014.
18. Atsushi S., Koichi K., Hiroki T., Ikuko M., Shoichi T. D-Luciferin-O-beta-D-glucoronide derivate, its production, determination of activity of beta-glucoronidase using the derivate as active component and detection of E. coli: пат. JP2000270894A, № JP1999000077286; заявл. 23.03.1999; опубл. 03.10.2000.
19. Yukiko H. Production of luciferin alkaline metal salt: Japanese Patent. JPH1045734A. № JP1996000205542; заявл. 05.08.1996; опубл. 17.02.1998.
20. Loewik D.W.P.M, Tisi L.C., Murray J.A.H., Lowe C.R. Synthesis of 6-Hydroxybenzothiazole-2-carboxylic Acid // Synthesis. 2001. V. 12. P. 1780-1783.
21. Seto S. A Convenient Synthetic Method of 2-car-bomoyl-6-methoxy-benzothiazole - one of Intermediates for the Synthesis of Firefly Luciferin // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1963. V. 36. P 331-333.
22. Bowie L.J. Methods in Enzymology. Bioluminescence and Chemiluminescence (Edited by DeLuca, M.A.) // Academic Press, New-York, Tokio, 1978. V. 57. P. 15-28.
23. White E.H., Woerther H, Field G.F., McElroy W.D. Analogs of Firefly Luciferin // J. Org. Chem. 1965. V. 30. № 7. P. 2344-2347.
24. Suzuki N., Nomoto T., Toya, Y., Kanamori N., Yoda B., SaekiA. Synthetic Reactions in PEG: PEG-Assisted Synthesis of 2-Cyano-6-methoxybenzothiazole, A Key Intermediate For The Synthesis of Firefly Luciferin // Biosci. Biotech. Biochem. 1993. V. 57. № 9. P. 1561-1562.
25. Toya Y., Takagi M., Nakata H., Suzuki N., Isobe M., Goto T. Convenient Synthetic Method of 2-cyano-6-me-thoxybenzotiazole. A key Intermediate for the Synthesis of Firefly Luciferin // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1992. V. 65. № 2. P. 392-395.
26. Yarovenko V.N., Stoyanovich F.M., Zolotarska-ya O. Yu., Chernoburova E.I., Zavarzin I.V., Krayushkin M.M. New approach to the synthesis of 2-carbamoylbenzothiazoles // Rus. Chem. Bull. 2002. V. 51. № 1. P 144-147.
27. Vivekananda Bhatt M., Kulkarni S. Cleavage of Ethers // Synthesis. 1983. V. 4. P. 249-282.
28. Wood J.L., Vigneaud V. Racemization of ben-zyl-l-cysteine, with a new method of preparing d-cystine // J. Biol. Chem. 1939. V. 110. P. 109-114.
29. Shiraiwa T., Tazoh H., Sunami M., Sado Y. Ra-cemic structure and optical resolution by preferential crystallization of DL-cysteine salts of substituted benzenesulfonic acids // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1987. V. 60. № 11. P. 3985-3990.
30. Shiraiwa T., Sado Y., Komure M. Optical resolution by preferential crystallization of DL-thiazolidine-4-carbox-ylic acid // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1987. V. 60. № 9. P. 2773283.
31. Shiraiwa T., Kazuo K., ShinjiS., Hidemoto K. Racemization of optically active cysteine via formation of 2,2-di-methyl-4-thiazolidinecarboxylic acid // Bull. Chem. Soc. Jpn.
1988. V. 61. № 11. P. 4158-4160.
32. Miyazaki H., Ohta A., Kawakatsu N., Yukitaka W., Yasuhiro G., Shiraiwa T., Hidemoto K. Preparations of Optically Active Homocysteine and Homocystine by Asymmetric Transformation of (RS)-1,3-Thiazane-4-carboxylic Acid // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1993. V. 66. № 2. P. 536-540.
33. Ratner S., Clarke H.T. The action of formaldehyde upon cysteine // J. Am. Chem. Soc. 1937. V. 59. № 1. P. 200-206.
34. Shiraiwa T., Kataoka K., Sakata S., Kurokawa H. Asymmetric transformation of (RS)-cysteine via formation of (RS)-4-thiazolidinecarboxylic acids // Bull. Chem. Soc. Jpn.
1989. V. 62. № 1. P. 109-113.
35. Краббе П. Применение хироптических методов в химии. М.: Мир. 1974. 168 c.
36. Shiraiwa T., Kurokawa H., Kataoka K., Asymmetric Transformation of DL-4-Thiazolidinecarboxylic Acid // Chem. Lett. 1987. P. 2041-2042.
37. Kajiyama N. Method and reagent for quantitating D-cysteine: пат. US6376208. № US 09/534,283 (B1); заявл. 24.03.2000;, опубл. 23.04.2002.
38. Возный Я.В., Дементьева Е.И., Кутузова Г.Д., Угарова Н.Н. Способ получения D-2(6-p-D-галактопира-нозилбензтиазолил-2)-4,5-дигидротиазолил-4-карбоно-вой кислоты: пат. 2024538 Рос Федерация. № 4800302/04; заявл. 13.03.1990; опубл. 15.12.1994.
